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获取全长cDNA若干方法的比较
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【PDF】广东汉族人WT33cDNA3‘端非翻译区内的HinfⅠ酶切点的遗传多态性的用户评论RACE PCR_百度百科
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RACE(rapid-amplification of cDNA ends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要。
RACE PCR简介
RACE(rapid-amplification of cDNA ends)是通过PCR进行cDNA末端快速的技术。
cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要。
完整的cDNA序列可以通过文库的筛选和末端克隆技术获得。
末端克隆技术是20世纪80年代发展起来的。
RACE PCR优点
与筛库法相比较，有许多方面的优点
1）此方法是通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。
2）节约了实验所花费的经费和时间。
3）只要引物设计正确，在初级产物的基础上可以获得大量的感兴趣基因的全长。
实验室现有的RACE试剂盒的简介
􀂙RACE是一种从一个相同的cDNA模板进行5‘和3‘末端快速克隆的方法。此方法会产生较少的错误条带。此过程中使用的酶混合物非常适合长链PCR。
􀂙使用此方法的要求是必须知道至少23－28个核苷酸序列信息，以此来设计5’末端和3‘末端RACE反应的基因特异性引物（GSPs）。
RACE PCR引物的设计
基因特异性引物（GSPs）应该是：
􀂙Tm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果
需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE反应的基因特异性引物（GSP1和GSP2).由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。
RACE PCR反应中涉及到的一些事项
􀂙cDNA的合成起始于polyA+RNA。如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高。
􀂙RACEPCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。
􀂙在进行5‘和3’RACEPCR的时候应该使用热启动。
􀂙表4中给出了所有引物的相互关系。重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。另外，重叠的引物可以为PCR反应提供一个对照。并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。
􀂙引物GSP中的GC含量要在50－70%之间。这样可以使用降落PCR。避免使用自身互补性的引物序列，否则会产生回折和形成分子内氢键。另外，避免使用与AP1互补的引物，尤其是在3‘末端。
如果要用重叠片段来检测设计的引物，GSp1和GSp2之间至少是100－200碱基。只有这样才可以用扩增的产物来鉴定设计的引物是否正确。
􀂙降落PCR可以明显的增加RACEPCR产物的特异性。在最开始的循环中，退火温度高于AP1引物的Tm值，可以增加对特异性条带的扩增。随后的退火和延伸的温度降回到AP1的温度，可以进行随后的PCR循环。
􀂙
RACE PCR验证基因特异性引物的对照
􀁜单个引物的阴性对照：只用一个引物GSP来进行阴性对照。这样不应该产生任何的条带。如果可以看到明显的产物，应该改变循环的参数，或重新设计原始引物。
􀁜利用两个GSPS进行阳性对照：（只有两个GSP可以产生重叠的时候才可以采用此步。）为了确定RNA样品中目的基因确实表达，利用两个GSP和接头连接的cDNA来产生阳性对照。可以产生两个引物之间的重叠大小的片段。如果没有这个片段，应该重复cDNA的合成，或者从一个不同的组织或细胞来源进行cDNA的合成。
􀂙制备和抽提polyA+RNA
不要使用DEPC处理过的水。
纯化完mRNA之后，利用琼脂糖凝胶电泳检测mRNA的质量。哺乳动物的mRNA样品是0.5－12kb的拖带，在其中有4.5和1.9kb的rRNA的条带。非哺乳动物的mRNA应略小
RACE PCR具体的实验步骤
RACE PCRcDNA第一条链的合成
􀂃cDNA第一条链的合成：我们建议进行cDNA合成的对照反应，这样可以对样品的cDNA的合成进行鉴定。加入各种试剂之后，在气浴中42度保温一个小时。
注意：在水浴或酒精浴中保温减会少反应体积，从而降低第一链的合成效率。
将管放于冰上，以终止第一链的合成反应。
直接进行第二链的合成。
RACE PCRcDNA第二链的合成
cDNA第二链合成的酶混合物中，含有聚合酶、RNaseH和连接酶。T4DNA聚合酶的功能是补平dscDNA的末端。我们建议做阳性对照，试剂盒中提供人类骨骼肌的mRNA。
􀂃建议进行阳性对照,cDNA的质量取决于制备的polyA+RNA的质量。非哺乳动物样品的mRNA大约在0.5－3kb之间。
􀂃通过电泳检测cDNA的产量，与对照进行对比，这样可以有利于在以后的步骤中对cDNA进行稀释。
接头的连接及连接产物的稀释
􀂃按照程序进行连接反应。
􀂃如果没有对比样品和对照的产量，利用Tricine－EDTAbuffer制备接头连接的dscDNA的1/50和1/250的稀释物，用两种稀释物进行以下的RACEPCR反应，直到鉴定出哪一种稀释可以得到好的效果。
RACERACE－－PCRPCR扩增扩增
·进行5’和3’的RACE－PCR扩增。
·利用以下的程序进行降落PCR反应：
5个循环：94度5秒
5个循环：94度5秒
20－25个循环：94度5秒
RACE PCR注意
我们建议使用降落PCR反应，这就要求GSP的Tm值≥70度。
当循环结束时，利用1.2%琼脂糖凝胶电泳分析每一个管中的产物5μl，使用适当的分子量marker。
·可以根据你的基因的特异性来设计最理想的循环参数。如果看不到带或者只有微弱的带，在68度多加5个循环。最佳的延伸时间取决于扩增条带的长度。如果片断的长度在2－5kb的时候，经常使用4min，0.2-2kb的时候将延伸时间减到2－3min，对于5－10kb的条带，延伸时间增加到10min。
RACE PCRRACE产物的验证
􀁻应该对RACE的片段进行验证,以此来确定是否已经扩增了理想的产物。如果得到的是多条带或者研究的是多基因家族的成员，验证是非常有用的。
􀁻有3种验证RACE产物的方法：
（1）比较由GSP和NGSP获得RACE产物。
（2）Southernblot
（3）克隆并测序
􀁻我们建议最好测得RACE产物的部分序列。有的时候需要嵌套引物的存在。
比较由GSP和NGSP获得RACE产物。
􀁻对于5‘末端的RACE产物，比较由AP1和GSP1扩增出来的产物和由AP1和NGSP1扩增出来的产物。
􀁻对于3‘末端的RACE产物，比较由AP1和GSP2扩增出来的产物和由AP1和NGSP2扩增出来的产物。这对于鉴定多条带是否是上一个PCR的特异性产物是非常有用的。
􀁻如果条带是正确的，在嵌套PCR反应中的条带应该是略微小一些。基本PCR和嵌套PCR产物的迁移率的不同取决于cDNA结构中GSP1和嵌套引物的位置。
RACE产物的克隆和测序：
􀁻可以利用胶回收试剂盒来回收RACE产物，此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物；对于长的片段，可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法，最后用Tricine－EDTAbuffer30μl重新悬浮DNA样品。
􀁻电泳5μl回收的样品来鉴定回收的质量。
􀁻将回收的PCR产物直接克隆到/A型的PCR克隆载体中。另外还可以利用接头和/或cDNA合成引物中的Not1、Srf1、Xma1、ECOR1等酶切位点，将产物克隆到常规载体中
对于5‘端的RACE产物，我们建议挑取至少8－10个不同的克隆以获得5‘端的最大可能性的序列。（反转录并不总是进行到mRNA模板的5’末端，尤其是长模板。另外，T4DNA聚合酶会移走5‘末端的0－20个碱基。）
􀁻一旦鉴定了含有插入片断的克隆，应该获得多的序列信息。理想的是，可以对整个开放读码框进行测序。包括5‘和3‘的非翻译区。
全长cDNA的获得
􀁻通过部分或全部测序鉴定了RACE产物后，可以通过两种选择获得全长的cDNA。
通过PCR的方法。
通过克隆的方法。
通过PCR的方法获得全长cDNA：
􀂄扩增长的cDNA需要较长的延伸时间，但是如果延伸的时间过长，可以产生拖带，所以要慎重的设计引物。
􀂄根据从5‘和3‘RACE产物获得序列信息设计5’和3‘GSP引物。这些引物应该来自cDNA的3’或者5‘的末端，应该是23－28nt长。不应该在引物的末端加上限制性位点，这样会导致高背景。在某些时候可以设计3’和5‘的嵌套引物。但是还是应该先利用一对引物进行PCR反应。
通过PCR的方法获得全长cDNA：
􀂄进行如下的热循环：
25个循环94度5秒
72度2－15分钟
􀂄延伸的时间应该等于预期的cDNA长度加上2分钟。例如：预期得到6kb的条带，用6+2=8分钟的延伸时间。
􀂄注意：如果没有条带或者条带弱，增加5个循环；或者优化PCR的条件。
通过PCR的方法获得全长cDNA：
􀂄在1.2%的琼脂糖凝胶上分析5μl的样品。通常情况下，可以见到一条单一带，如果这样，利用胶来纯化全长的cDNA。
􀂄制备1.2%的TAEbuffer制备琼脂糖凝胶。不使用TBEbuffer，TBE的胶很难制备全长的cDNA。
􀂄将剩下的45μl反应物点样，选用适当的marker。
􀂄利用长波紫外观察cDNA（≧300nm）切下全长的cDNA。注意：应该尽量减少紫外对cDNA的照射。
通过PCR的方法获得全长cDNA：
􀂄利用胶回收试剂盒回收cDNA。此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物；对于长的片段，可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法，最后用Tricine－EDTAbuffer30μl重新悬浮DNA样品。
􀂄将全长的cDNA克隆到T/A型的PCR克隆载体中。
通过克隆产生全长的cDNA：
􀁺如果你已经获得了含有重叠部分的5‘和3’RACE产物，同时在cDNA的重叠部分含有一个酶切位点的话，通过克隆技术可以获得全长的cDNA。
􀁺利用酶切获得的3‘和5’扩增产物，并且利用T4DNA连接酶将它们连接起来。利用接头和cDNA合成引物中的内切酶将最终的全长cDNA克隆到载体中。
􀁺在哺乳动物基因组中，NOT1和Srf1酶切非常稀少，大约106bp才出现一次，因此在绝大多数的cDNA中是不出现的。
Appendix：cDNA接头和引物􀁺接头在设计的时候可以使cDNA的扩增成功进行：􀁺接头的5‘端在第一个循环中没有AP1引物的结合位点。AP1的结合位点只有通过GSP的扩增之后才能够产生。􀁺这些特点中的每一个都可帮助减少cDNA片段扩增过程中出现的非特异性扩增。另外，它们允许从一个复杂的DNA片段的混合物中扩增出靶样品――所有的产物都有相同的末端结构，因为使用了单一的一套GSPs。黄鳝AQP1 cDNA的克隆与表达分析--《华北农学报》2012年S1期
黄鳝AQP1 cDNA的克隆与表达分析
【摘要】：采用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法(RACE)分离、克隆出黄鳝水通道蛋白(Aquaporin 1,AQP1)基因全长cDNA序列,共1 134 bp,包括163 bp 5'非翻译区、789 bp阅读框以及182 bp 3'非翻译区,阅读框共编码263个氨基酸,分子量计算值为27.8 kDa,理论等电点为7.945。氨基酸组成中,正电荷残基(K,R)总数21个,负电荷残基(E,D)总数19个,极性氨基酸为115个,疏水性氨基酸60个。同源性分析表明,黄鳝与欧洲鳗的相似性高达87%,其次与底(鱼将)、鲷、犬、克氏鲤、猪、珍珠鸟、斑马鱼、半滑舌鳎、非洲肺鱼、蟾蜍、非洲瓜蟾的相似性分别为42.9%,61.2%,46.1%,42.9%,53.9%,47.9%,41.5%,40.1%,33.2%,30.8%,33.2%。生物信息学分析显示,黄鳝AQP1基因所编码的蛋白质以亲水性区域为主,具有丰富的B细胞抗原位点。定量分析结果表明,AQP1 mRNA主要在卵巢中高表达,其他组织中表达量较少。
【作者单位】：
【关键词】：
【基金】：
【分类号】：S917.4【正文快照】：
黄鳝(Monopterus albus),俗称鳝鱼,属于硬骨鱼纲、合鳃目、合鳃科、黄鳝属,广泛存在于亚洲地区,中国仅产1种。其体型细长,形状似蛇或鳗,营养价值极高。长期以来,由于野生黄鳝被过量捕捉,及其生活的水域环境受到严重破坏,导致黄鳝自然资源下降,养殖所需苗种短缺。刘健康等早年
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京公网安备75号草鱼AMBP基因cDNA的克隆与序列分析--《水生生物学报》2009年02期
草鱼AMBP基因cDNA的克隆与序列分析
【摘要】：α1-微球蛋白和Bikunin是由同一基因翻译表达出的两种功能不相关联的血浆蛋白。本文通过快速扩增cDNA末端的方法,首次从草鱼肝脏组织克隆了α1-微球蛋白和Bikunin前体蛋白(α1-microglobulin/Bulinin precur-sor,AMBP)基因全长cDNA。其cDNA全长1230bp,包含5′非翻译区23bp,3′非翻译区160bp和开放读码框1047bp。开放读码框编码348个氨基酸,包含182个氨基酸的α1-微球蛋白和145个氨基酸的Bikunin。草鱼AMBP与其他物种的氨基酸序列分析结果表明,它们具有较高的同源性(44.7%-84.4%),其中草鱼与斑马鱼同源性最高(84.4%)。结果表明AMBP序列结构和α1-微球蛋白与Bikunin共翻译表达特点在动物机体中具有着重要的生理意义。
【作者单位】：
【关键词】：
【基金】：
【分类号】：Q78【正文快照】：
α1-微球蛋白是存在血浆中的一种棕色糖蛋白,与视黄醇、增味剂和类固醇同属Lipcalin家族[1]。结构上往往含1—2个寡糖结合位点,分子量约为25—30kD,α1-微球蛋白在人血浆中一部分以游离形式存在,大部分与IgA、凝血酶原和清蛋白结合形成复合物的形式,在鼠血浆中α1-微球蛋白主
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