超级干扰素抑制A549增殖诱导其衰老
肺癌是近年来WHO报道的所有癌症中致死率最高的[1], 并且随着环境的不断恶化,
肺癌的发生率呈逐年上升的趋势。人们迫切需要找到一种疗效好而副作用小的治疗肺癌的方法。超级干扰素(supernterferon
alpha, sIFNα)就有很好的抗肺癌作用(超级干扰素原名冻干重组高效复合干扰素, 后因其抗癌和抗病毒效果均很好,
故论文中常用sIFNα)。细胞衰老(cellular
senescence)是指细胞不可逆地发生细胞周期阻滞、丧失增殖能力后进入一种相对稳定的状态。导致细胞发生衰老的原因有很多,如原癌基因的激活、端粒的缩短、氧压、基因损伤等。最新研究表明,
除了可以抑制癌症发生以外,
诱导癌细胞发生衰老已经成为治疗癌症的一种新策略[2~4]。细胞衰老现象是1961年Hayflick等[5]在正常成纤维细胞的体外培养中首先发现的,
正常细胞在体外条件下增殖分裂50-70代即进入一种衰老的状态, 细胞丧失继续增殖的能力, 无法进一步传代培养,
但仍然存活,这种现象被称为“Hayflick极限”。衰老的细胞呈现大而扁平的形态, 细胞内颗粒增加,
溶酶体数量增多以及pH依赖的β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)表达活性增强[6]。由于正常细胞每分裂一次,
就会丢失端粒的一段序列, 所以走向衰老是正常细胞的必然归宿, 也是机体发生衰老的潜在原因之一。后来的研究发现除了端粒的缩短,
很多因素均可以诱导正常细胞很快发生衰老[7], 如原癌基因的激活会刺激绝大部分的正常细胞启动衰老通路,
而正常细胞转变为肿瘤细胞的必要条件就是必须绕过细胞的衰老体系, 也就是说细胞衰老是机体内非常重要的抑制肿瘤发生的机制,
是机体防御肿瘤形成的主要屏障之一[8]。无论何种原因导致的细胞衰老,
现象都是一致的。检测细胞衰老最常用的方法就是细胞衰老β-半乳糖苷酶染色,
这种方法也被称为检测细胞衰老的金标准[6]。由于辉阳公司的超级干扰素具有很强的抗癌能力, 本研究着重研究了它是否也会有诱导衰老作用,
并通过诱导衰老而达到治疗癌症的目的。
1 材料与方法
实验材料超级干扰素(sIFNα)和辛化诺(IFNα2b)由四川辉阳公司提供。MTT和DMSO购自Sigma公司。细胞培液和胎牛血清(FBS)购于GIBCO-BRL公司(GrandIsland,
NY, USA)。TACS TdT Kit in situ ApoptosisDetection Kit
购于R&D公司 (Minneapolis, MN, USA)。Rabbit or mouse ABC
Staining System购于Santa Cruz公司。Anti-p53和anti-p21购于Cell Signaling
Technology。细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒(Senescenceβ-Galactosidase Staining
Kit)购自碧云天生物技术研究所。
细胞株及细胞培养人肺腺癌细胞系A549购于美国标准菌种收藏所(American Type Culture
Collection, 简称ATCC,Rockvill, Maryland, USA),
所用的培液为含有10�S的RPMI-1640, 培养条件为37 ℃ , 5% CO2 的恒温培养箱。
1.3 结晶紫实验将细胞铺于24孔板, 次日, 分别用0 μg/ml、0.1
μg/ml、1 μg/ml、7 μg/ml的sIFNα或IFNα2b处理,放入培箱继续培养3 d, 然后取出培养板,
倒掉培液,在每孔中加入200 μl结晶紫染液(2%结晶紫溶于20%甲醇溶液)染色15 min, 小心洗去染液,
晾干后拍照保存。
1.4 MTT法测定细胞存活率细胞接种于96孔板, 次日, 分别用7
μg/ml的sIFNα或IFNα2b处理细胞, 不处理组为对照。在不同的时间点(12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72
h)每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml), 放入37 ℃继续培养3 h以上, 然后去除含MTT的培液, 每孔加入100
μlDMSO, 置于摇床上震荡10 min至底部紫色物质全部溶解, 在酶标仪上测定570 nm处的吸光值(D值)。细胞存活率 =
D570 (样品)/D570(对照)&100%。
1.5 细胞形态学观察将细胞铺于6孔板上, 次日, 分别用sIFNα或IFNα2b
处理, 使其终浓度为7 μg/ml, 对照组不处理。3 d后, 置于倒置显微镜下, 仔细观察其形态变化并拍照。
1.6 Hoechst 33258染色将细胞接种在放有盖玻片的24孔板中,
次日,分别用终浓度为7 μg/ml的sIFNα或IFNα2b处理, 对照组不做处理, 继续培养3 d。除去培液, 用PBS洗涤2次,
4%多聚甲醛(PFA)固定10 min, 然后加入Hoechst 33258染液, 5 min后, 洗去染液,
取出玻片,用防止荧光淬灭的封片剂封在载玻片上。置于荧光显微镜下观察, 拍照。
1.7 Western blot将细胞铺在10 cm培养板中, 次日,
分别用0.1 μg/ml、1 μg/ml、7 μg/ml 的sIFNα或IFNα2b处理,不处理组作为对照, 放入培箱继续培养。3
d后收集细胞, 用碧云天的裂解液裂解后, BCA法测定蛋白浓度, 用裂解液平衡到相同浓度, 然后加入6&loadingbuffer,
沸水中煮10 min, -80 ℃保存或立即用于电泳。上样时每孔加40 μg蛋白, 在标准电泳缓冲液中80 V至染料到达胶的底部,
然后150 mA恒流150 min将蛋白转移到PVDF膜。用相应的抗体检测相关蛋白表达。
1.8 Tunel染色将细胞接种在放置有盖玻片的24孔板中,
次日,分别用终浓度为7 μg/ml的sIFNα或IFNα2b处理, 对照组不做处理。3 d后,
将长有细胞的盖玻片取出,4%PFA室温固定10 min, 然后按照TACS TdT Kit insitu Apoptosis
Detection Kit的说明做以下的步骤。
SA-β-Gal染色用细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测在A549细胞有没有发生衰老。首先将细胞铺在六孔板上,
细胞密度为10 000个/孔。次日, 分别用终浓度为7 μg/ml的sIFNα或IFNα2b处理, 对照组不做处理。
3 d后, 吸除细胞培养液, 用PBS洗涤1次, 加入1 ml β-
半乳糖苷酶染色固定液, 室温固定15 min, 然后吸除细胞固定液, 用PBS洗涤细胞3次, 每次3 min。吸除PBS, 每孔加入1
ml染色工作液, 37 ℃孵育过夜, 然后置于显微镜下观察, 拍照。
1.10 免疫细胞染色细胞免疫染色用Rabbit or Mouse ABC
StainingSystem试剂盒, 按照厂家的说明书进行。
2.1 sIFNα对A549的增殖有明显抑制作用。首先,
我们用结晶紫染色的方法初步检测了sIFNα对A549细胞的影响, 发现与空白对照组和临床常用的普通干扰素IFNα2b处理组相比,
sIFNα处理组细胞数目明显要少(图1)。随后,
我们又用MTT实验的方法验证了sIFNα对A549细胞的增殖抑制作用,结果同样表明sIFNα处理后细胞活性受到明显抑制,也就是说sIFNα可以更强的抑制肺癌细胞A549的增殖
sIFNα对A549形态的影响我们进一步研究了sIFNα处理后A549细胞的形态变化。如图3所示,
与对照组相比, sIFNα处理组细胞体积明显变大, 形状变为扁平无规则状态,
平摊在细胞板上。我们又进一步用Hoechst33258染色的方法检测细胞核的形态,
结果发现与对照组相比,sIFNα处理组的细胞数目要少得多, 显示了其较强的抗增殖能力,
但是细胞核并没有形态改变(图4)。Hoechst 33258染色观察细胞核的形态(标尺=10 μm)Fig.4　Hoechst
33258 stainning (Scale bar=10 μm)
2.3 sIFNα不引起A549细胞发生凋亡用Western
blot的方法检测了凋亡相关蛋白caspase
3和caspase
8的表达。结果发现在A549细胞中sIFNα处理对这两种蛋白的表达量没有影响(图5)。然后进一步用Tunel染色的方法检测凋亡。结果显示细胞均呈Tunel阴性(图6)。至此,
我们基本可以确定, sIFNα不会引起Α549细胞发生凋亡。
2.4 sIFNα诱导A549细胞发生衰老基于以上的实验结果,
我们推测在sIFNα的处理下肺癌细胞A549可能发生了衰老, 而检测衰老最常用的标志就是SA-β-Gal染色。统计结果发现,
在sIFNα处理组约有80%的细胞呈SA-β-Gal阳性, 在IFNα2b处理组只有20%左右, 而在对照组不到1%的细胞着色(图7,
表1)。也就是说sIFNα极有可能是通过诱导肺癌细胞A549衰老来抑制癌症生长。然后我们进一步做了免疫细胞染色,
检测了衰老相关蛋白的表达。发现在sIFNα处理的细胞中,
p53和p21均有上调(图8)。进一步验证了A549细胞在sIFNα的诱导下发生了衰老。
3 讨论干扰素自1957年发现以来[9], 就引起了人们极大的兴趣,
但由于来源限制, 无法得到广泛应用。直到1986年, 基因工程干扰素的出现, 才使得干扰素能够大量应用于临床。为了增强干扰素的活性,
减小其副作用,
人们对它们进行了很多改造[10,11]。刘新垣院士与四川辉阳公司合作发现了这种sIFNα有很好的抗癌作用[12]。目前的研究表明sIFNα对多种肿瘤细胞具有诱导凋亡作用[13,14]。干扰素(interferon,
简称IFN)是一类由受病毒感染或经抗原、有丝分裂原刺激的细胞分泌的蛋白质。最初将干扰素分为IFNα、β、γ三种,
现在干扰素按照受体不同可分为三大类: Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型, 其中Ⅰ型最为复杂,
包括IFN-α、β、ω、ε、κ、δ、τ、ξ,IFNα最复杂并且应用最广, 又可分为IFNα-1a、1b、1c、1d,
IFNα-2a、2b、2c等。目前已经确认IFNα具有抗病毒、抗癌和免疫调节等作用[15]。近年来的研究表明IFNα对许多血液中的恶性肿瘤如慢性粒细胞白血病等有很好的疗效[16],
但对实体肿瘤的治疗有一定的局限。
通过诱导癌细胞发生衰老作为一种治疗癌症的策略是一个很新的领域。2002年,
Schmitt等[17,18]率先提出通过诱导肿瘤细胞衰老可以治疗癌症。近年来, 已陆续发现多种因子可以诱导癌细胞衰老[19~22],
诱导肿瘤细胞衰老不仅可以减少药物的用量, 有效地降低药物毒性,
而且对于克服肿瘤的耐药性具有重要意义[23,24]。目前的化疗药物大都是通过诱导癌细胞凋亡达到治疗癌症的目的。然而癌细胞一般都具有凋亡障碍,
所以如何克服癌细胞凋亡的障碍是治疗癌症的一个重大难题。而采用诱导细胞衰老的方法有望成为解决这一难题的突破口。本工作用MTT和结晶紫染色的方法均证明sIFNα对肺癌细胞A549有很强的抑制作用,
同时与衰老相关的SA-β-Gal活性也显著增加, 而IFNα2b却没有或只有极弱的抗癌作用, 其SA-β-Gal活性也增加极少,
故我们可初步推断sIFNα是通过诱导Α549细胞衰老而治疗这种癌症的。(本文来源于：)
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【求助】求助，细胞衰老SA-β-Gal原理，染色部位
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问题已关闭悬赏丁当:5
哪位大神做过细胞衰老实验，我用的碧云天的C0602,结果所有的细胞都染色了。请问正确的应该是核仁还是细胞核着色啊？有没有那位大神能说一下的作用原理。这张是我最近染的图，不知道问题出在哪里？先谢过各位啦
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应该在细胞核附近！
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我用碧云天的染肿瘤细胞，全绿了，细胞里有很多绿色颗粒，郁闷
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我用碧云天的染肿瘤细胞，全绿了，细胞里有很多绿色颗粒，郁闷
我用的也是碧云天的染肿瘤
和楼主的情况差不多
100倍 和400倍都很少
并且颜色也很淡
和别人文献上染色不太一样
不知道是什么方面原因 准备买进口的染色试剂试试
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渊梦无痕 minluna 我用碧云天的染肿瘤细胞，全绿了，细胞里有很多绿色颗粒，郁闷我用的也是碧云天的染肿瘤
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请问进口的染色剂用着怎样啊？我跟大家相反，我用碧云天的蓝染率很低，急求助。
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sherrywang_dlut 渊梦无痕 minluna 我用碧云天的染肿瘤细胞，全绿了，细胞里有很多绿色颗粒，郁闷我用的也是碧云天的染肿瘤
和楼主的情况差不多
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请问进口的染色剂用着怎样啊？我跟大家相反，我用碧云天的蓝染率很低，急求助。我买的进口millipore的衰老染色试剂盒 2070元
碧云天的试剂盒其实我的后来做的也可以
我的是有一个淡黄色的试剂没有振荡混匀 导致染色不均匀
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Percentages of SA- gal-positive cells were determined by scoring 300 cells, in triplicate, in three independent experiments.关于实验文献中这种计数方法不明白，有大神能够解释下？
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万分感谢！
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cheff0412 edited on
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陈林木 Percentages of SA- gal-positive cells were determined by scoring 300 cells, in triplicate, in three independent experiments.关于实验文献中这种计数方法不明白，有大神能够解释下？通过计数300个细胞确定其中的阳性细胞比例，每组计3个视野/重复，共独立计3组
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cheff0412 edited on
小白新接触，也就是数300个细胞，记下300个细胞中的阳性个数，计算阳性比例？一个条件下三重复，同时重复三次。可以这样理解？谢谢！
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陈林木 小白新接触，也就是数300个细胞，记下300个细胞中的阳性个数，计算阳性比例？一个条件下三重复，同时重复三次。可以这样理解？谢谢！yes, smart!
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cheff0412 陈林木 小白新接触，也就是数300个细胞，记下300个细胞中的阳性个数，计算阳性比例？一个条件下三重复，同时重复三次。可以这样理解？谢谢！yes, smart!啰嗦一下，实在感谢，如果这样的话贴壁细胞铺多少合适？六孔板，我养的是食管癌细胞，文献上是2或3乘以10的五次方？
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还有使用什么统计学方法分析，统计学软件使用prism可以吗？
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陈林木 还有使用什么统计学方法分析，统计学软件使用prism可以吗？It is ok
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我想知道U2OS,12孔板密度应该多大，之前都是铺了个大概密度的，没有计数。
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cheff0412 通过计数300个细胞确定其中的阳性细胞比例，每组计3个视野/重复，共独立计3组是在普通光学显微镜下数300个细胞吗？那岂不是数累死了，而且一组要数900个。。。
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文档介绍：
miR-17 在细胞衰老中的表达变化课题研究:王怡丹指导教师: 符永兰( 北京师大二附中) 王苗(北京师范大学生命科学学院) 该文获 2010 年西城区科技创新大赛二等奖摘要: miRNA (全称 microRNA ,通用简称是 miRNA ,以下简称 miRNA , miR-1 7 是 13 号染色体长臂上的 miRNA ) 是一种长约 22 个碱基的小 RNA, 近些年来 miR-1 7 被报道在许多肿瘤中表达上调。但 miR-17 在衰老细胞中的表达还没有报道。目的: 本实验的目的是建立年轻和衰老的 WI38 细胞系, 检测已知在多种肿瘤中高表达的 miR-17 细胞衰老中的表达情况。方法: 通过传代培养细胞, 细胞计数确定细胞代数, β-Gal 染色检测细胞是否衰老。用 Trizol 试剂提取细胞的总 RNA, 逆转录获得 cDN A 模板。最后通过实时定量 PCR 比较 miR-17 在年轻和衰老细胞中的表达。结果: 构建了年轻和衰老的 WI38 细胞系, 发现与在肿瘤细胞中相反, 衰老细胞中 miR-17 的表达水平显著降低。这一结果预示 miR-17 可能同时参与细胞衰老和肿瘤的发生发展。一、综述(一)细胞衰老 1. 细胞衰老概述衰老是一种有机体的死亡危险随年龄增加而增大的现象,是生命的基本现象, 也是生物界的普遍规律。随着衰老研究及分子生物学的迅猛发展,人们对衰老的探究已经逐渐深入到细胞、基因及分子水平。 1961 年, L.Hayflick 做过这样的实验,体外培养的人体某种细胞,最多分裂 50 次左右就停止分裂了,并且丧失了正常的功能[1] 。这种原来具有分裂能力的细胞随着整体年龄增长而减缓或停滞分裂的现象叫做细胞衰老。成纤维细胞 WI38 是研究细胞衰老的经典模型。衰老细胞与年轻细胞相比,在形态结构和生理生化反应上会出现明显的变化, 主要表现在膜透性及脆性增加,核膜内陷,核增大,核中染色质凝聚、破碎,线粒体数量减少, 胞内脂褐素等异常物质沉积等。在 pH=6 时, 衰老细胞的酸性β- 半乳糖苷酶染色呈阳性。 2. 细胞衰老的机制从诱因来看衰老一般分为复制型衰老和过早型衰老两种,由于细胞分裂增殖进而端粒缩短或端粒机构的破坏而引起的人类和某些物种细胞的衰老称为复制型衰老, 这是人类和某些物种细胞衰老的主要机理[2]。由外界因素诱导比如, 离子辐射, 氧化胁迫,某些肿瘤抑制因子和癌基因的过表达诱导的衰老称为过早型衰老。 3. 细胞衰老与肿瘤的关系细胞衰老是细胞经历的不可逆的生命过程,在这个时期里, 组成细胞的化学物质在运动中不断受到内外环境的影响而发生损伤,造成退化时期生理功能下降和紊 2 乱。当机体组织受到某些外界或内源的刺激时,导致细胞发生转化,脱离了正常的周期而不断进行无限增殖时,肿瘤即便产生。可见, 细胞衰老作为细胞的一种主要的肿瘤抑制机制,与癌变有着密切的联系。多种研究表明,当细胞处于发生癌变风险的情形下,会诱发细胞发生衰老。(二) miRNA 1. miRNA 概述 miRNA 是一种长度约为 22 个碱基的小 RNA, 在动物、植物和真菌中广泛存在,可以在转录后水平调节基因的表达。迄今发现的 miRNA 在生物的发育, 细胞增殖, 凋亡, 衰老和肿瘤发展中发挥调节功能。 2. miRNA 与肿瘤 miRNA 调控转录后水平的基因表达抑制或者是基因沉默的方式, 很多与信号通路中细胞周期调控的转录因子及相关蛋白有关,且近来研究发现 50% 有注释的人类 miRNAs 集中于基因组的脆性位点, miRNA 突变或者异位表达与多种人类癌症相关, miRNAs 可以起到肿瘤抑制基因或者癌基因的功能。这就注定了其与癌症等疾病有着重要的关联。 3. miRNA 与衰老正如 miRNA 对生长发育的调节作用一样, 科学家们也猜测是否 miRNA 在衰老和死亡过程中也起到重要作用。在秀丽隐杆线虫模型中发现, miRNA lin-4 ,通过胰岛素/ 类胰岛素生长因子-1 信号通路影响寿命和衰老的节奏。缺失 lin-4 会缩短线虫的寿命[3] 。利用基因芯片的技术,在不同的模式生物中,人们发现随着年龄的变化, miRNA 的表达图谱发生改变。随着 miRNA 在细胞发育,增殖,凋亡及癌症中的调节作用逐步被揭示。 miRN A 调节衰老的机制及 miRNA 如何参与细胞衰老的信号通路等问题将成为今后 miRNA 研究的热点之一。 4. miR-17 miR-1 7位于13 号染色体长臂. miR-1 7 所在的 mir-1 7 基因簇被认为是一个致癌基因,表达该基因可促进细胞增殖,抑制肿瘤细胞的凋亡,导致肿瘤发生等。在 B 淋巴细胞瘤中, miR-17 所在的基因簇会高表达, 同时抑制肿瘤细胞的凋亡。原癌基因 c-Myc 可以诱导 miR-17 的表达,而 miR-17 可以抑制转录调控因子 E2F1 的表达。从而促进 c-Myc 介导的细胞增殖,与肿瘤形成相关。在其它一些造血细胞瘤及实体瘤中,该基因簇的高表达也被证明可以促进肿瘤发生[4]。由上述实验结论可知, mir-17 通过调节转录调控因子 E2F1 等靶基因起到了调节细胞周期, 影响细胞增殖、分化的作用。这与细胞衰老的分子机制息息相关。此外,近期的报道也证实其在心、肺及免疫系统等正常细胞组织发育中起到了重要作用。(三)立题依据 miR-17 位于人 13 号染色体长臂, 已有报道显示 miR-17 在许多恶性肿瘤中存在高表达,包括肺癌,胰腺癌,结肠癌等。衰老作为细胞的一种主要的肿瘤抑制机制, 与癌变有着密切的联系。虽然人们对细胞衰老相关蛋白的作用有比较深入的了解, 但细胞衰老的调节机制还不是很清楚, 近些年来科研人员发现 miRNA 可能与细胞衰老的调节有关。 miR-17 是 miRNA 家族中的一员,据报道 miR-17 在许多肿瘤中高表达,参与肿瘤的发生和发展。但 miR-17 是否调节衰老还没有报道。鉴于 miR-17 在多数肿瘤中存在异常表达,并与肿瘤的发生发展有关,我们推测 miR-17 可能参与细胞衰老过程的调节, 细胞衰老和癌变存在某些共同的调控机制。为 3 了研究 miR-17 在细胞衰老中的调节作用,本课题主要研究 miR-17 在细胞衰老过程中的表达情况。二、实验部分(一)实验材料 WI38 ,人胚肺成纤维细胞。 mir-17 逆转录引物:
mir-17 实时定量 PCR 引物: 上游引物:GCAAAGTGCTTACAGTGCAGGT 下游引物:GAGGT (二)试剂 DMEM , Trypsin-EDTA, L-Glutamin, Penicillin-Streptomycin 购自 GIBCO 公司; DEPC 购自 Sigma 公司; M-MLV Reverse Transcriptase 购自 Promega 公司; DNase I 购自 Ambion 公司; 琼脂糖(Agarose), 酵母提取物(Yeast Extract), 胰蛋白胨(Trptone) 1
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