农用微生物杀菌剂研究进展
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农用微生物杀菌剂研究进展
微生物农药的特性和发展趋势与人类生态环境、食品安全和生物多样性具有良好的相融性，加上现代微生物工业化生产技术体系日趋完善，微生物农药的研究开发已引起了广泛的关注和重视。在我国农业生产从传统方式向绿色产业和出口创汇产业过渡中，微生物农药具有重要的意义，而微生物杀菌剂是微生物农药的重要组成部分，在植物病害防治中起到非常重要的作用。1&微生物杀菌剂分类与特性微生物杀菌剂是指微生物及其代谢产物和由它们加工而成的具有抑制植物病害的生物活性物质。微生物杀菌剂主要抑制病原菌能量产生、干扰生物合成和破坏细胞结构。内吸性强、毒性低，有的兼有刺激植物生长的作用。微生物杀菌剂主要有农用、细菌杀菌剂、真菌杀菌剂等类型。1.1&农用抗生素农用抗生素是由微生物发酵过程中产生的次生代谢产物，在低浓度时可抑制或杀灭作物的病、虫、草害及调节作物生长发育。国外以日本发展最快，居世界领先地位，在植物病害防治领域先后开发了春日霉素、灭瘟素、多氧霉素、井冈霉素、灭孢素等。我国农用抗生素的研究较晚，始于20世纪50年代初，至今已取得了很大的成果。已研制出并利用的农用抗生素品种有井冈霉素、农抗120、春日霉素、庆丰霉素、多抗霉素、公主岭霉素、中生菌素、武夷菌素、科生霉素等。井冈霉素已成为我国农药杀菌剂和杀虫剂销售和使用量名列前茅的品种。从综合产业化规模与其研究深度上分析，井冈霉素、阿维菌素、赤霉素、苏云金杆菌(简称Bt)4个品种已成为我国微生物农药产业中的拳头产品和领军品种，而农用链霉素、农抗120、多抗霉素和中生菌素等产业化品种已成为我国农用微生物农药产业的中坚力量。这些品种现有的市场规模已占到生物农药的90%左右，它们的发展趋势代表着我国未来微生物农药产业市场的发展方向。1.2&真菌微生物杀菌剂真菌杀菌剂研究和应用最广泛的是木霉菌，其次是粘帚霉类。我国开发研制的灭菌灵，主要用于防治各种作物的霜霉病。此外，一些食线虫真菌可用来防治大豆孢囊线虫、根结线虫病害，如淡紫拟青霉用于防治香蕉穿孔线虫病、马铃薯金线虫病，并提高其产量。目前，此类制剂商品化很少，市场有待开拓。1.3&细菌微生物杀菌剂近年来，以细菌防治植物病毒病取得了较大的进展。在国外用放射土壤杆菌k84菌系防治果树的根癌病是最成功的例子，并且已商品化。美国报道，用草生欧氏杆菌防治梨火疫病效果与链霉素相当。沈阳农业大学生物农药工程中心利用拮抗木霉和拮抗细菌混合发酵制成粉剂，成功地防治了保护地蔬菜和甜瓜的苗期病害，该项产品正处于中试阶段。其他报道的细菌杀菌剂还有：用来防治黄瓜及烟草炭疽病菌的地衣芽孢杆菌，防治甘蓝黑腐病的枯草芽孢杆菌，以及防治水稻纹枯病的假单孢菌等。由于细菌的种类多、数量大、繁殖速度快，且易于人工培养和控制，因此，细菌杀菌剂的研究和开发具有较大的前景。用于生防的细菌以芽孢杆菌为主，主要有枯草芽孢杆菌(Bacillus.subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amylolique &faciens)多粘芽孢杆菌(B.polymyxa)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)和短小芽孢杆菌(B. pumilis)等。由于芽孢杆菌具有抑制植物病害的能力，又是自然界中广泛存在的非致病细菌，对人畜无害，不污染环境，因而备受关注。国内已开发成功并投入生产的枯草芽孢杆菌商品制剂有百抗、麦丰宁、纹曲宁、依天得、根腐消等。云南农业大学和中国农业大学共同研制的微生物农药“百抗”(10亿个/g活芽孢枯草芽孢杆菌可湿性粉剂)获得农业部登记注册，已在多个省推广使用，推广面积约4667hm2，主要防治水稻纹秸病、三七根腐病、烟草黑胫病。百抗的主要有效成分是枯草芽孢杆菌B908。大田应用中，百抗对水稻纹枯病防效70%以上。其抑菌机制为营养竞争、位点占领等。南京农业大学研发的麦丰宁是由枯草芽孢杆菌菌株B3制成的活体生物杀菌剂，对小麦纹枯病田间防效达50%～80%，其防病机制主要表现在产生抑制小麦纹枯病病菌菌丝生长、菌核形成和菌核萌发的抗菌物质。河南省农业科学院植保所筛选出22个对苹果轮纹病菌、苹果褐斑病菌、苹果腐烂病菌、小麦纹枯病菌、黄瓜枯萎病菌、辣椒枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、棉花枯萎病菌、山药炭疽病菌、黄瓜灰霉病菌有拮抗作用的生防菌株；通过16SrDNA和ITS(internal transcribed space，ITS，内转录间隔区)的序列分析，对这些生防菌株进行了快速鉴定，它们属于B.amyloliquefacens(解淀粉芽孢杆菌)和B.subtilis(枯草芽孢杆菌)，其中枯草芽孢杆菌B2903、YN-1、YN-2防治苹果轮纹病、棉花枯萎病、小麦纹枯病，以及西红柿灰霉病等取得了较好的效果。2&农用微生物杀菌剂活性物质微生物杀菌剂可以产生多种抗菌物质，包括脂肽类、肽类、磷脂类、类噬菌体颗粒、细菌素等，可抑制病原菌对现有的抗菌素的抗性问题。其中尤为重要的是具有极高生物工程利用价值的脂肽类和肽类抗生素。如非核糖体途径合成的脂肽类抗生素表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturins)和丰原素(fengyctin)；核糖体途径合成的肽类抗生素枯草菌素(subtilin)、Sublancin。2.1&抗菌肽(环肽)抗菌肽广泛存在于自然界中，是具有抗菌活性的天然小分子蛋白。因分子量低、水溶性好、热稳定、强碱性和广谱抗菌等特点而备受关注。目前对其研究已经深入到分子结构、作用机制等多个方面。Subtilin、Sublancin和Mersacidin都是抗菌肽类型，Subtilin的分子量为3317U，Mersacidin的分子量为1825U，Sublancin的分子量为3877U，产生的核糖体抗生素(TasA，Subtilosin，Sublancin)也是抗菌肽类型。河南省农科院植保所从分离得到的YN-1菌株中获得了编码TasA基因的全长DNA，构建含TasA基因的原核表达载体，经IPTG诱导表达出一个57kU左右的重组蛋白，表达产物对苹果轮纹病菌、黄瓜灰霉病菌和苹果褐斑病菌具有显著的抑菌活性，这些研究结果为后续的TasA基因工程研究奠定了基础。2.2&脂肽类物质(lipopeptide)脂肽类物质是枯草芽孢杆菌产生的主要抗菌物质之一。脂肽类生物表面活性剂易溶于水，在油水界面上具有良好的表面活性；与化学表面活性剂相比，易被生物降解。Surfactin、Iturins、非核糖体抗生Bacolysin、磷脂类抗生素Bacilysocin和抗菌枯草菌素(Mycosubtillin)等都属于脂肽类物质。枯草芽孢杆菌IF03039、YB8产生的脂肽类表面活性剂，商品名为表面活性素(Surfactin)。有学者筛选到地衣芽孢杆菌NK-X3分泌的一种脂肽类表面活性剂。此外，还有Leiffert等报道的短芽孢杆菌(B.pumilus)CL45和枯草芽孢杆菌CL27也可以分泌脂肽类物质。环状芽孢杆菌(B.circulans)J2154分泌一种抗菌环肽。据报道，伊枯草菌素是由解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens及B.subtilins G3产生的一类抗菌物质，B.subtilins 168可产生非核糖体抗生索Bacolysin和磷脂类抗生素Bacilysocin物质。Duitman等报道的B.subtilins ATCC6633分泌抗菌枯草杆菌素(Mycosubtillin)。河南省农科院植保所研发的YN-1菌株发酵液粗提物对棉花枯萎病菌具有抑菌活性，质谱分析发现，活性粗提物中含有C14-IturinA、C15-IturinA、C16-IturinA、C14-FengycinA、C15-FengyeinA、C16-FengycinA、C17-FengycinA、C16-FengycinB、C17-FengycinB9种脂肽抗生素，其中C16-IturinA、C14-FengycinA、C16-FengycinA、C17-FengyrcinA、C17-FengycinB5种脂肽抗生素为活性粗提物中主要成分。该研究结果为利用YN-1菌株开发成微生物杀菌剂奠定了良好基础。2.3&蛋白类抗菌物质这一类物质包括几丁质酶、抗菌蛋白、多肽类。几丁质酶是一种分解聚N-乙酰氨基葡萄糖分子的糖苷酶。B.subtilins G3、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌都可分泌产生几丁酶。抗菌蛋白主要是枯草芽孢杆菌分泌产生的抗菌物质，已报道的有A30、B-916、B-903、96-79、SN202等菌株。蜡状芽孢杆菌(B.cereus)UW85菌系分泌出的2种抗菌物质，一种是氨基多肽，属于Zwittermicin。苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)分泌的Zwittermicin A可以防治由Phytophtora&medicaginis引起的苜蓿种子病害。3&我国微生物杀菌剂面临的问题及展望3.1&欠缺能够与国际接轨的技术平台建设我国生物农药从品种、剂型、质量和数量上与发达国家相差甚远，很多只针对某一类病原菌，抑菌谱很窄，品种单一，不能够满足与日俱增的微生物农药市场；而基因工程生物农药的研发还很薄弱；生物农药仅占农药市场的11.7%，远远不能满足国内外市场的需求。我国规划到2015年生物农药占所有农药的份额将由现在的10%增加到30%，生物农药的需求缺口将更大。河南是农业大省，生物农药的需求量也很大。当前，我国的农药市场面临国外生物农药的蚕食，国外抗虫棉的长驱直入，占据我国棉花种子大部分市场，已给我们敲响警钟。因此，生物农药的研制已成为当务之急，应加快采用基因工程与发酵工程新技术，研发拥有自主知识产权，安全、高效、环境友好型的、多功能的生物农药新品种。3.2&技术落后，科研成果转化率低在国外大量筛选新的具有生物活性的化合物已经是生物农药研究开发的重要方向。年，日本平均每年申请到110个新抗生素的专利，居世界首位，1999年以后美国超过了日本。而在国内仍以井岗霉素和Bt等少数的农用抗生素为主，很多新的生物农药活性成分还没有鉴定出来。虽然我国筛选出的农抗品种很多，但大多只停留在实验室研究或小生境范围内使用的水平，能大规模生产和广泛推广应用的主要是井冈霉素、阿维菌素和赤霉素3种，研究开发滞后于生产应用。3.3&展望虽然微生物农药有以上的一些局限性，但与化学农药相比具有资源易得、安全、环保、长效、无残留等优点，注重低毒、高效、选择性强，已经成为21世纪研究热点。长期以来，我国农作物病虫害的防治主要依赖化学农药，导致农药污染成为世界上最严重的国家之一，食品中农药检出率高达90%以上，严重危害广大消费者的人身健康，同时也使我国农产品频频遭遇国外的“绿色堡垒”，严重影响农业发展和农民增收，农药污染成为粮食安全生产中亟待解决的难题。生物农药具有安全环保、持效期长等特点，大力发展和推广生物农药是化解这一难题的根本出路，是实现无公害和绿色农产品生产的根本保障。
TA的最新馆藏[转]&[转]&[转]&[转]&[转]&农用微生物杀菌剂是微生物农药的一种类型，目前对其并没有统一和明晰的概念。杨丽荣等[]认为，农用微生物杀菌剂是指由微生物或其代谢产物加工而成的、具有抑制植物病害功能的生物活性物质。笔者认为，农用微生物杀菌剂应仅指可用于控制作物病害、以活体微生物为主要成分的制剂，而以代谢产物为主要成分的则应归为生物化学农药或生物源农药。随着世界各国政府和民众对食品中农药残留问题的关注，农用微生物杀菌剂的发展越来越快，市场份额逐年增多[]。农用微生物杀菌剂的研制一般需经历“生防菌筛选→生防机理及安全性研究→生防菌大量制备→生防菌剂型化→制剂田间防效验证→生产工艺放大→生产线建设→田间药效试验→质量标准制定→农药登记→生产批准证→制剂商业化”的过程，其中剂型研究是生防菌能否从实验室走向田间的关键步骤之一，对于农用微生物杀菌剂的产业化具有重要意义。然而，由于商业上的技术保护等原因，有关剂型研究的细节或策略较少被报道，因而不利于农用微生物杀菌剂的发展。本文拟就农用微生物杀菌剂剂型的功能、种类、性质以及制剂生产和贮存条件、田间环境条件对其性质及防效的影响等多个方面进行系统的评述，并对其存在的问题及未来发展趋势进行分析，以期为相关研究提供参考。
1 农用微生物杀菌剂剂型的定义及功能
剂型是农药有效成分的最终使用形式或状态，起着保护、稀释或缓释有效成分，优化使用效果以及扩大使用范围等作用。由于农用微生物杀菌剂的主要成分生防菌是活体生物，在剂型加工过程中容易失活，且其主要成分本身是不溶于水的颗粒，具有疏水性，导致制剂的物理性质如润湿性、悬浮率等难以得到提高，因此农用微生物杀菌剂的剂型加工明显难于化学农药。另一方面，由于生防菌在环境中容易失活，导致其防效极不稳定，因而在剂型加工以及田间应用过程中需要采取一定的保护措施。然而，与生物防治的其他研究领域(如生防机理、生防菌筛选、生防菌培养等)相比，有关剂型的研究相对较薄弱，严重阻碍了农用微生物杀菌剂在植物病害防治中的推广和应用。
2 农用微生物杀菌剂的主要剂型
根据物理形态，可将农用微生物杀菌剂分为固态制剂[包括粉剂(DP)、颗粒剂(GR)、水分散粒剂(WG)和可湿性粉剂(WP)等]和液态制剂[主要为水剂(AS)和悬浮剂(SC)]；根据用药对象，则可分为种子处理剂、土壤处理剂和叶部喷雾制剂等。笔者就我国已登记的农用微生物杀菌剂的剂型种类(截至2014年2月有效的单剂)[]进行了统计分析(图 1)，发现其中可湿性粉剂占绝大多数(82%)，水剂为6%，粉剂、水分散粒剂、悬浮剂和颗粒剂各占3%，即可湿性粉剂是我国目前农用微生物杀菌剂的主要剂型。
图 1Fig. 1图 1 已在中国取得登记的农用微生物杀菌剂剂型种类(截至2014年2月)
Fig. 1 Microbial pesticide formulation types
which were registered for plant disease
control in China before
已在美国环保署登记的农用微生物杀菌剂剂型种类(截至2014年2月有效的单剂)[]的统计分析结果见图 2，其中悬浮剂所占的比例最高(37%)，可湿性粉剂次之(26%)，颗粒剂占21%，粉剂占16%，表明悬浮剂是美国农用微生物杀菌剂的主要剂型。
图 2Fig. 2图 2 已在美国环保署登记的农用微生物杀菌剂
剂型种类(截至2014年2月)
Fig. 2 Microbial pesticide formulation types which
were registered for plant disease control by USA
Environmental Protection Agency(EPA) before
对比中美两国农用微生物杀菌剂剂型种类可知，中国农用微生物杀菌剂的剂型种类单一，主要为可湿性粉剂，其他剂型较少，比例相差悬殊；而美国农用微生物杀菌剂的剂型种类较丰富，悬浮剂、可湿性粉剂和颗粒剂占的比例均较高。因此我国亟待加强农用微生物杀菌剂剂型的相关基础研究，拓宽剂型种类和应用范围，并通过新剂型研发和原有剂型优化技术，提高微生物杀菌剂的防治效果，降低其生产成本。
2.1 悬浮剂
悬浮剂(suspension concentrate，SC)是由菌体悬浮液或发酵液加入助剂(防沉降剂、pH稳定剂和防腐剂等)直接制备而得的剂型，由于省去了干燥脱水过程，因此生产成本较低。悬浮剂目前存在的最大问题是生防菌存活期较短，无法满足实际应用的需要。Melin等[]和Trivedi等[]的研究结果表明，悬浮剂中活菌的存活期明显低于干燥后的固态制剂。这是因为制剂中较高的水分含量不利于生防菌的休眠，同时还容易引起生防菌的二次生长或杂菌污染。微生物杀菌悬浮剂的进一步发展需依赖于对生防菌生理代谢特点的深入了解，目前，悬浮剂研究是农用微生物杀菌剂剂型研究的难点，一旦理论和技术方面有所突破，货架期过短的问题得以解决，低廉的制造成本必然会使悬浮剂成为最具竞争力的剂型。此外，现有农用微生物杀菌悬浮剂产品均为水悬浮剂，应加强对油悬浮剂(以植物油为主)的研究。
粉剂(dustable powder，DP)是指无需经过兑水而可直接使用的剂型，其制备过程一般包括菌体悬浮液和载体混合、晾干[](不需要经过喷雾干燥和粉碎)，在无杂菌条件下制备则不需要经过干燥[]。粉剂所用的载体包括高岭土、硅藻土、滑石粉和碳酸钙等，其中用滑石粉作为载体的报道较多[, , ]。Vidhyasekaran等[]的研究表明，采用滑石粉制备的农用微生物杀菌剂粉剂贮存6个月后，其生防菌株(Fluorescent pseudomonad Pf1和Pf2)仍具有较高的存活力，而高岭土制剂中活菌的存活力很低，表明滑石粉更适用于这2株荧光假单胞菌粉剂的制备。粉剂虽然使用方便且制备成本较低，但由于其容易飘移导致环境污染，因此实际应用范围并不广。
2.3 可湿性粉剂
可湿性粉剂(wettable powder，WP)是指由原粉、填料(载体)和助剂(表面活性剂、润湿剂、分散剂、紫外光保护剂、稳定剂和营养助剂等)混合组成，并经粉碎而制成的一种粉状制剂。与粉剂相比，其有效成分含量较高、粒径更小、更易润湿、可分散于水中供喷雾使用。尽管可湿性粉剂生产过程中粉尘污染较大，但由于其加工成本低、制作过程简单，因此仍是我国目前农用微生物杀菌剂的主要剂型。
可湿性粉剂的主要缺点是加工及使用过程中粉尘较大，易污染环境，对制剂生产操作人员或农药使用人员的健康有潜在威胁。加工过程的污染可以通过密封性能良好的自动化生产线解决，而使用时的粉尘危害可通过采用水溶性包装材料加以避免。因此，如果选用更好的加工条件和包装材料，可湿性粉剂仍将在市场中占有较大比例。
目前国内外有关微生物农药可湿性粉剂制备的主要研究概况见表 1。多数研究者采用离心或过滤的方法收集生防菌，制成悬浮液后再与载体和助剂等组分混合制备可湿性粉剂[, , ]。然而，由于许多生防菌在培养过程中都会产生一些对植物病虫害有抑制作用的物质[, , ]，如果仅收集活菌，则可能会造成活性成分的流失[]。鉴于此，一些研究者将包括生防菌在内的发酵液作为剂型化研究的对象，用于可湿性粉剂的制备[, ]，从而可以有效利用发酵液中的活性物质，起到提高制剂防效的作用。
2.4 颗粒剂
颗粒剂(granulars,GR)是由原药、助剂和载体制成的粒状制剂，具有持效期长、用量少、使用方便、易贮存和使用时无粉尘飘移等优点。颗粒剂按粒径大小可分为大粒剂(macrogranule，2 000～6 000 μm)、细粒剂(fine granule，300～2 500 μm)和微粒剂(microgranule，100～600 μm)。由于粒径较大，颗粒剂不能用于叶部喷施，主要用于土壤施用(穴施或垄施)。以多粘类芽孢杆菌HY96-2及其代谢产物为主要成分，笔者所在课题组与上海泽元海洋生物技术有限公司合作首创的新型农用微生物杀菌剂——107 CFU/g多粘类芽孢杆菌细粒剂(“康蕾”牌商标，原商品名：康地蕾得)[, ]对素有“植物癌症”之称的细菌性病害植物青枯病具有良好的防效[, , ]，并可明显促进植物的生长；对植物枯萎病等危害严重的真菌性土传病害也具有较好的防治效果，如对黄瓜枯萎病的防效可达57.08%～73.48%[]，对百合枯萎病的防效为55.08%～68.32%[]。
表 1(Table 1)表 1 农用微生物杀菌剂可湿性粉剂的主要成分及制备方式
Table 1 Main ingredient and preparation type of microbial pesticide wettable powder
菌株(或菌种)
Preparation method
Research Group
枯草芽孢杆菌
Bacillus sublits
膨润土和高岭土
Bentonite and
No information
菌粉和载体混合
Mixing the bacteria powder and carrier
XIN Yucheng[]
Trichoderma spp.
润湿剂B5、分散剂C4、
紫外光保护剂UV-1
Wetting agents B5,
dispersants C4,
UV resistance UV-1,
stabilizing agent E
未说明干燥方式，未粉碎
No information about drying type,
without milling
ZHANG Min,et al. []
枯草芽孢杆菌
Bacillus subtilis
滑石粉、玉米淀粉
Talc,corn starch
羧甲基纤维素钠
Sodium carboxymethyl
50 mL菌悬液与100 g载体及助剂混合，35 ℃干燥48 h，未粉碎
Mixing 50 mL bacterial suspension,100 g carrier and adjuvant,then drying
48 h at 35 ℃,without milling
JAYARAJ,et al.[]
解淀粉芽孢杆菌
amyloliquefaciens
菌悬液与载体以1%(质量体积比)液固
混合，未进行干燥和粉碎
Mixing bacterial suspension and carrier
at ratio of 1∶100 (m ∶V),without drying
and milling
CHIOU,et al.[]
恶臭假单胞菌
Pseudomonas
灭菌滑石粉
Sterile talc
木质素磺酸钙
Calcium lignosulphonate
菌悬液和载体及助剂混合后晾干，未粉碎
Mixing bacterial suspension,carrier
and adjuvant,then drying in the air,
without milling
BORA,et al.[]
荧光假单胞菌
Pseudomonas
fluorescens
灭菌膨润土
Sterile bentonite
No information
菌悬液和载体及助剂混合后于35 ℃
下干燥，未粉碎
Mixing bacterial suspension,carrier
and adjuvant,then drying at 35 ℃,
without milling
JAYARAJ,et al.[]
抗生素溶杆菌
Lysobacter
antibioticus 13-1
硅藻土和碳酸钙
Diatomaceous earth
and calcium
农乳100号或十二烷
Agricultural emulsion
100 and sodium dodecyl
菌株发酵液加载体后经板框压滤，
加入助剂，混匀，通风干燥，粉碎
Mixing bacterial fermentation broth
and carrier,filtrating with plate-frame
pressure,then adding adjuvant,
mixing,drying in the air,milling
姬广海，等
JI Guanghai,et al.[]
Penicillium
frequentans
(ATCC number
海藻酸钠和甘油
Sodium alginate and
流化床干燥
Drying with fluidized bed
GUIJARRO,et al.[]
地衣芽孢杆菌
licheniformis
Corn starch
橄榄油、蔗糖
Olive oil,saccharose
细菌培养液和载体及助剂混合后烘干
(55 ℃)，粉碎
Mixing bacterial fermentation broth,carrier and adjuvant,then drying at 55 ℃,milling
LEE,et al.[]
枯草芽孢杆菌
Bacillus sublits
硅藻土和碳酸钙
Diatomaceous earth
and calcium
木质素磺酸钠和十二烷
Sodium lignin sulfonate
and sodium lauryl sulfate
菌株发酵液与载体混合后喷雾干燥
Mixing bacterial fermentation
broth and carrier,then spray-drying
WANG Min,et al.[]
枯草芽孢杆菌
Bacillus sublits
菌株发酵液和载体混合后烘干，粉碎
Mixing bacterial fermentation broth and
carrier,then drying in the air,milling
MA Ping,et al.[]
苹果轮纹病拮
Antagonistic bacteria
against ring rot
萘磺酸盐甲醛缩合物和
甲基萘磺酸盐甲醛缩合物
Naphthalene sulfonate
formaldehyde condensate
and methyl naphthalene
sulfonate formaldehyde
condensate
将助剂和填料混合并粉碎，加入菌株
发酵液，混合，未进行干燥
Mixing carrier and adjuvant,milling,
then adding bacterial fermentation
broth,mixing,without drying
YANG Hua,et al.[]
Trichoderma viride
Diatomaceous earth
黄原胶、十二烷基硫
酸钠和几丁质
Xanthan gum,sodium
lauryl sulfate and chitin
自然风干，粉碎
Natural air drying,milling
WANG Yong []
表 1 农用微生物杀菌剂可湿性粉剂的主要成分及制备方式
Table 1 Main ingredient and preparation type of microbial pesticide wettable powder
颗粒剂所用的载体主要为植物性农业副产品，如稻壳粉等，干燥过程采用简单的晾干或气流干燥等方式，生产成本较低。但由于粒径较大，颗粒剂不能用于喷雾防治植物叶部病害，仅适用于土传病害的防治，因而限制了其应用范围和发展。
2.5 水分散粒剂
水分散粒剂(water dispersible granules，简称WG或WDG)，是一种可在水中迅速分散的剂型，包装和使用方便、无需溶剂、无粉尘污染、有效成分含量高，已成为当今农药剂型发展的一个重要方向。张敏[]在木霉菌可湿性粉剂的基础上，通过挤压造粒法制备了水分散粒剂，润湿时间和悬浮率分别可达到22 s和82.75%，制剂性能良好。牛赡光等[]制备了一种枯草芽孢杆菌水分散粒剂，其对田间棉花枯萎病的防效达到60%以上。尽管水分散粒剂是农药剂型发展的一个良好方向，但由于其加工成本较高，市场竞争力差，因此在农用微生物杀菌剂中所占的比例不大。今后应重点开发具有良好崩解分散性能的助剂，并简化水分散粒剂的制备过程，如研究开发将生防菌发酵液、载体及助剂混合后通过一步干燥即可制得水分散粒剂的新工艺。
同一种生防菌在理论上可以被加工成多种剂型，但在实际生产中应根据微生物的生理特性、使用方式和目的的不同，选择合理、适当的剂型[]。药剂使用方式主要包括飞机施药、地面喷施、拌种、穴施和灌根等；使用目的有速效性和持效性，速效性需考虑剂型的内吸性，持效性则要考虑其缓释性能[]。此外，由于农用微生物杀菌剂剂型研究的最终目标是制剂的商品化，因此，在选择剂型时还必须考虑加工成本及其在市场上的竞争力，否则，即使是性能优良的剂型，在应用推广中也会遇到诸多困难。
3 农用微生物杀菌剂的主要性质
农用微生物杀菌剂的性质主要包括生物性质和物理性质。生物性质包括生防菌的含量、芽孢率及活力等，良好的生物性质是农用微生物杀菌剂高效防治作物病害的重要基础。物理性质则因剂型种类不同而有所差异。对悬浮剂而言，包括悬浮稳定性、结块性和倾倒性等；对可湿性粉剂而言，包括润湿性、分散性、结块(团)性和悬浮率等；对水分散粒剂，则包括崩解性、粒径和悬浮率；等等。物理性质主要与农药使用时的方便程度及药液的均匀程度等有关。农用微生物杀菌剂的生物性质和物理性质对产品功效及市场接受程度均有很大影响，是产品质量控制的主要指标。由于物理性质涉及因素太多，且随剂型不同要求也有所不同，故本文主要讨论农用微生物杀菌剂的生物性质，对其物理性质不作讨论。
3.1 活菌数
具有一定数量的活体个数是生防菌在环境中定殖和生长的基础，因此，活菌数是农用微生物杀菌剂的一项重要质量指标。测定活菌数的方法很多(表 2)，最常用的是传统的平板菌落计数法。平板菌落计数法具有技术简单、容易操作、不需要使用高级仪器等优点，缺点是耗时、工作量大且误差较大。此外，由于活菌之间团聚以及载体吸附等原因，导致可湿性粉剂等固体剂型中附着在载体上的活菌难以被全部解析至水中。针对这一问题，陈振民等[]发明了一种新的微生物农药活菌计数方法：以生理盐水和吐温-水溶液作为制剂的稀释液，通过超声振荡和均质器挤压方法促使活菌从载体上解析并分散，逐级稀释后再采用平板菌落计数法测定制剂中的活菌数。随着基因和分子探针技术的发展，ATP荧光法、定量PCR法和酶法等逐渐被用于微生物活菌数测定，这些方法的优点是测定时间短、测定误差较小，缺点是费用昂贵。
表 2(Table 2)表 2 几种常用活菌计数方法比较
Table 2 Comparison of live microbial organism counting method
Counting method
可否区分活细胞和死细胞
Differentiation
between live and dead
microbial organism
Application
characteristics
平板菌落计数法
Plate count []
广泛应用于微生物数量测定
Widely used to determine
microorganisms quantity
显微镜观察法
Observation with
microscope
Little application
流式细胞仪法
The flow cytometry
Little application
Dry weight method
Little application
分光光度计法
Spectrophotometric
应用于固形物较少的菌悬液
Applied to bacterial suspension
with little solids
ATP fluorescence
Little application
Quantitative PCR
method [, ]
用于水样或肥料中特定微生物数量测定
Used to determine the specific
microorganisms in water or fertilizer
Enzymatic method []
用于双歧杆菌定量
Used to determine the amounts
of Bifidobacterium
表 2 几种常用活菌计数方法比较
Table 2 Comparison of live microbial organism counting method
活菌数是农用微生物杀菌剂生产过程中测定频率最高的一项指标，倘若荧光探针标记等方法能够代替传统的平板菌落计数法，则高通量和高精度的活菌数检测目的将得以实现，对农用微生物杀菌剂生产过程中活菌质量控制具有重要的促进作用。
在害虫生防制剂生产过程中，常用生防微生物的“毒力”作为其质量控制指标，表征生防微生物侵染及致死害虫的能力。生防微生物对害虫的致死能力不仅与其数量有关，还与其侵染能力、寄生能力、繁殖能力以及产毒素能力等相关，因此“毒力”可综合反映生防制剂的杀虫潜力。在农用微生物杀菌剂质量控制过程中，一般用“活菌数”作为质量控制指标。生防微生物的杀菌效果除与其数量相关外，还与其在田间环境中的存活能力、在植物体内的定殖能力、营养空间竞争能力、抑菌能力以及诱导能力等多种因素有关，单纯用活菌数评价农用微生物杀菌剂的防治潜力不够准确。因此，如何更准确地评价农用微生物杀菌剂的防效，并将其作为一个质量控制指标应用于生产过程的检测，是值得相关科研工作者重视的问题。尽管每一种农用微生物杀菌剂都有其相应的盆栽模型，但由于其测定时间长，重复性差，不宜大规模、常态化使用，因此发展微型、快速、稳定可靠、标准化的防效测定模型也非常重要，对生防微生物产品的质量控制将具有较大的推动作用。
4 生产条件对农用微生物杀菌剂性质的影响
生产条件如生防菌培养和剂型化过程都可能对农用微生物杀菌剂的性质产生很大影响。许多非芽孢类微生物对制剂加工条件(如高温)很敏感，在高温条件下，其活力会急剧下降。因此，如何提高生防菌对不良加工条件的耐受力是一项很有意义的研究工作。Usall等[]的研究表明，在生防菌培养过程中，提高培养温度或利用氯化钠调节培养液的渗透压，都可提高生防菌对干燥过程的耐受力。该结果对其他生防菌尤其是非芽孢类生防细菌制剂的研制具有重要参考价值。
生防菌培养好后，还需经过干燥、粉碎或加入表面活性剂等其他一些加工程序方可成为制剂。有研究者研究了喷雾干燥过程中进风口温度、出风口温度以及不同雾化器对生防菌活力的影响，发现其中出风口温度的影响较大[]；笔者所在课题组研究了粉碎和添加表面活性剂对多粘类芽孢杆菌的影响，发现气流粉碎方式对活菌数影响不大，但不同表面活性剂与生防菌的相容性存在很大差别[]。这些结果可为其他农用微生物制剂加工提供参考。
5 贮存条件对农用微生物杀菌剂性质的影响
与化学农药相比，农用微生物杀菌剂的一个主要劣势是贮存稳定性较差，货架期短。在农用微生物杀菌剂贮存稳定性方面，各国目前均未有具体的规定。Burges等[]认为，微生物农药的货架期应不小于18个月，但其并未对货架期进行准确的定义，即并未界定活菌损失多少时为货架期。在货架期测定方面，加速贮存试验可在较短时间内对化学农药的货架稳定性进行考察，近年来，这种方法在微生物制剂研究领域已有报道。如Abe等[]和Lalloo等[]的研究结果表明，生防菌的存活与制剂含水量、温度及时间之间具有一定的关系，据此建立模型则可以预测生防菌在特定条件下的存活率或半衰期。通过Lalloo建立的模型，预测室温中蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus的半衰期为5年，与试验测定值相近。除温度以外，Hern?ndez等[]的研究还表明，真空保存更有利于生防菌微变冢村氏菌Tsukamurella paurometabola C-924的存活。以上研究结果表明，对一些不稳定的革兰氏阴性菌或酵母菌，应尽量选择相对低温、低含水量及真空状态进行保存。由于芽孢杆菌的芽孢对不利环境有极强的抵抗力，因此芽孢杆菌的保存相对比较容易。上述报道为预测农用微生物杀菌剂的货架期提供了很好的参考。
6 田间环境条件对农用微生物杀菌剂防效的影响
农用微生物杀菌剂的防治效果不仅与生防菌的活菌数、活力及剂型种类、生产条件和贮存条件有关，跟田间使用时的环境条件也有很大关系，生防菌在田间环境中的定殖、生长很容易受到紫外光辐射、化学农药、水分、pH和营养状况等因素的影响。田间环境中的紫外光辐射对生防菌具有很强的杀伤力[, ]。研究表明，有些染料可以减轻紫外光对生防微生物的损伤[, , ]，因此可用作农用微生物制剂的紫外光保护剂。但紫外光保护剂的保护作用有限，而且其本身对植物和动物具有潜在危害。将生防微生物制成微囊也可以保护其免受紫外光损伤[]，但制剂成本的增加不利于产品的推广和商业化，而且微囊仅适用于微生物杀虫剂，不适用于微生物杀菌剂，因为囊壁的包覆作用会减少生防菌与病原菌接触的机会。有研究表明，微生物中的黑色素可减弱紫外光辐射的危害[, ]，通过基因工程构建表达黑色素的苏云金芽孢杆菌，发现其对紫外光的抵抗能力明显强于野生菌株[]。因此，从自然界或微生物自身寻求天然的“紫外光保护助剂”应是较为长远的策略。笔者所在课题组研究发现，生防菌多粘类芽孢杆菌胞外多糖对该菌具有紫外光保护和热保护功能[]，该结果为进一步研究开发天然“紫外光保护助剂”奠定了基础。
化学农药是另一种对农用微生物杀菌剂防效具有重要影响的田间因素，但却常常被农药使用者忽略。对于任何一种病害，作物种植者都不会仅使用某一类农药，相关知识的欠缺和急于治疗作物病害的心情使得他们通常也不会考虑菌药混用对生防菌的影响，因此在实际生产中，农用微生物杀菌剂在很多情况下会不可避免地与化学农药发生客观上的混用，这种状况在我国可能更为普遍。有研究表明，化学农药对农用微生物杀菌剂的防效存在不利影响[]。针对这种情况，一是需要注意确保实验室的平板拮抗(化学农药对生防菌的拮抗)试验结果与田间试验结果的一致性——在很大程度上，实验室的平板试验不能代替田间试验；二是要加强对农药使用者的专业技术培训，使他们充分认识到农药不当混用的危害。当然，并非所有的化学农药均对生防菌有害，有些化学农药不仅无害，甚至还可以提高生防菌的防效，起到协同抗病的作用，如井冈霉素对蜡质芽孢杆菌抑制作用很弱[]，将两者混配后对稻曲病具有很好的防效[]。因此，对化学农药与农用微生物杀菌剂的相容性还需进行广泛深入的研究，尤其是有关田间药效试验方面的研究亟待加强。
在农用微生物杀菌剂制备过程中，生防菌一般在营养丰富及环境适宜的条件下生长，然而，当产品应用于田间时，植物表面或根部的水分、pH、盐度和营养状况等很可能并不适合该生防菌的生长，因此，改变这些条件或通过“训练”提高生防菌的适应能力可提高其防治效果。Khan等[]报道，向制剂中添加糖蜜作为营养成分，可提高生防菌枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis 在田间环境中的定殖能力。Verhaar等[]报道，向制剂中添加花生油可提高生防菌蜡蚧轮枝菌Verticillium lecanii对叶片表面湿度的依赖性，并提高其对黄瓜灰霉病的防治效果。还有些生防菌在高盐、高渗透压的生长条件下会积累一些抗渗透压物质，如海藻糖和氨基酸等，从而提高生防菌在干燥或低相对湿度下对叶部病害或采后果实病害的防治能力[, ]。然而，目前尚未见通过对生防菌的“训练”提高其在土壤中存活能力和生防效果的报道，而这方面研究对提高微生物杀菌剂防治作物土传病害的药效具有重要意义。
7 总结与展望
目前，我国农用微生物杀菌剂的主要剂型为可湿性粉剂，今后应大力发展水分散粒剂和悬浮剂等环保剂型，尤其是以植物油或水为介质的液态制剂，以实现降低成本且对环境友好的目的。
农用微生物杀菌剂剂型加工存在的主要问题是缺乏统一和标准化的质量控制体系，不重视生防菌培养技术、培养液特性(特别是表面张力、黏度、流变学特性、活性化合物含量、生防菌状态等)、生防菌与载体及其他助剂的生物相容性、培养液与载体及助剂的混合过程、加工工艺优化等应用基础研究，导致剂型研究的新颖性不强，产品价格偏高并且田间应用后适应能力差。今后应在加强上述研究的同时，加强相关质量控制体系的建立，如采用一定的模型准确评价制剂的防效，而不是简单用活菌数评价；重视基础性研究，如生防菌在植物油或水中的休眠状态、复苏能力、活性化合物及生防菌在载体中的吸附和解析特性等，为其液态或其他剂型的开发奠定基础；深入研究田间不同环境因素对制剂中生防菌定殖和防效的影响规律，综合考虑防治对象的发病规律、栽培技术、土壤特性、使用成本及微生物杀菌剂的产品特性，开发出简单实用的田间应用技术，以使微生物制剂的田间防效更加稳定。
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