做完lncRNA测序，怎么选择验证实验？_诺禾致源-爱微帮
&& &&& 做完lncRNA测序，怎么选择验证实验？
lncRNA（long non-coding RNA）这两年算是RNA界的红人了，赚足了大家的眼球，这里不得不跟大家再重提一下它主角光环的原因——功能。&lncRNA的功能通过下面的示意图来简单粗暴解释一下：（点击可放大查看）DNA水平上参与表观遗传调控：lncRNA可以招募染色质重构复合体介导某些基因的表达沉默； lncRNA还可以参与到维持染色体数目的稳定；转录调控：作为诱饵与转录因子结合抑制mRNA的转录；转录后调控：海绵作用吸收microRNA；直接与mRNA结合降解或抑制mRNA的翻译；与蛋白结合激活或抑制蛋白活性。想要了解具体的功能介绍点这里：正是lncRNA有这么多复杂、强大的功能，人们对它的研究热情持续升温，对于研究不太成熟且时空特异性非常强的lncRNA，二代测序技术相对芯片（基于已知RNA）无疑是发现新的lncRNA比较好的研究技术。言归正传，如果做了lncRNA测序，人家高分文章中测序数据通常就占到整篇文章的20-30%，实验设计占到20%，50%-60%都是验证实验，验证实验设计是怎么个逻辑，需要怎么做呢？如果是发现新的lncRNA：如果是发现样本间lncRNA差异表达：&1. 验证发现的lncRNA是真实存在的可以通过提取RNA做sanger测序验证；&可以通过probe qPCR，不仅可以对序列进行验证还可以同时检测lncRNA的表达水平，一举两得哦！（具体原理戳这里：）2.&验证lncRNA表达水平存在差异与差异表达mRNA的验证方法相同，设计引物做qPCR验证就OK了，或者做个northern-blot既可以验证RNA的表达丰度又可以验证序列信息，这里就不多做介绍了，大家可以根据自己需求选择。3. 验证功能如果你觉得做完上面的实验就结束了，小编只能遗憾的告诉你，文章也就登个3分左右的期刊。那么多数据想想确实有些浪费，特别是有新发现。再下功夫做点下面的实验，进一步提高您文章的水平。功能验证完全不知道怎么入手肿么办？我们为大家精心准备了实验步骤，一步一步锁定目标的功能，走起！！！！lncRNA要发挥功能，要么是跟DNA相互作用，要么跟RNA相互作用，再就是跟蛋白相互作用。更简单分的话，就是在细胞核发挥功能或者在细胞质中施展本事。大家想想小编说的是不是很有道理（自己都佩服自己的智商）。&原位杂交（In situ hybridization，ISH）首先看看锁定的lncRNA细胞的位置，再推断它的功能。ISH是利用同位素标记核酸探针进行细胞或组织的RNA或DNA定位。功能缺失实验利用siRNA、shRNA、反义核酸等方法沉默lncRNA，观察干预后对细胞增值、凋亡、侵袭、转移、染色体等的影响，验证lncRNA靶基因的表达情况。功能获得性实验构建lncRNA过表达载体，观察过表达lncRNA后对细胞增殖、凋亡、侵袭等的影响，验证lncRNA靶基因的表达丰度。分析推测后的进一步验证假如通过ISH实验lncRNA定位到细胞核，缺失后发现预测的靶基因表达水平升高，推测lncRNA可能与转录因子（蛋白）结合抑制DNA的转录；或者定位发现lncRNA位于细胞质中，过表达或缺失实验发现一些蛋白活性升高或降低，推测lncRNA可能和一些蛋白结合发挥作用。如何验证：●&设计探针利用免疫磁珠富集lncRNA，富集产物进行lncRNA和蛋白解离，利用质谱鉴定结合产物●&若已知某个蛋白与RNA结合，可以采用抗体富集蛋白，产物进行蛋白与RNA解离，对RNA进行测序（RIP-seq技术）以上的功能验证实验不是都需要做，能确定目标的功能就可以了。举个简单的例子：经过测序和信息分析，发现了一个感兴趣的lncRNA，且该lncRNA鉴定出了microRNA（靶基因已知）结合位点，过表达实验发现靶基因表达水平升高，缺失实验发现靶基因表达受到抑制，那就基本可以确定该lncRNA是sponge作用了。关于lncRNA实验验证，简单给大家介绍到这里，其实验证实验远不止这些，比如细胞实验通过动物模型再现验证等。希望对大家的实验有所启发，有任何问题欢迎给我们留言讨论~诺禾致源lncRNA分析包括lncRNA的鉴定、表达水平分析、靶基因预测、靶基因GO/KEGG富集分析、lncRNA特征分析（保守性分析、与mRNA特点比较），全套mRNA分析，lncRNA与mRNA联合分析，全面分析满足您的需求。参考文献 [1] Hu X,&Feng Y,&Zhang D, et al.&A Functional Genomic Approach Identifies FAL1as an Oncogenic Long Noncoding RNA that Associates with BMI1 and Represses p21Expression in Cancer.&Cancer Cell . ): 344-57.[2] Quinn JJ,&Ilik IA,&Qu K, et al.&Revealing long noncoding rNA architecture and functions using domain-specific chromatin isolation&by RNA purification.Nat Biotechnol. ): 933-40.[3] Li L,&Chang HY.&Physiological roles of long noncoding RNAs: insight from knockout mice. Trends Cell Biol. ): 594-602.申婷婷（转录调控事业部）丨文案贾红丽丨编辑配图来源于网络，侵删长安识别二维码，关注诺禾致源
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Nature子刊：最新发现3000多个LncRNA
Copyright@Majorbio 上海美吉生物医药科技有限公司　　1.&概述
长链非编码RNA(lncRNA)是一类转录本长度超过200nt的RNA分子，通常认为它们并不编码蛋白，而是以RNA的形式在多种层面上（表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等）参与蛋白编码基因调控。
大多数lncRNA的二级结构，剪切形式以及亚细胞定位都较为保守，这对lncRNA发挥功能非常重要。但相对于miRNA和蛋白质的功能来说，lncRNA功能机制更加难以确定，目前并不能仅根据序列或者结构来推测它们的功能。根据lncRNA在基因组上相对于蛋白编码基因的位置，可以将其分为sense、antisense、bidirectional、intronic、intergenic这5种类型。这种位置关系对于推测lncRNA的功能有很大帮助。
&不同位置lncRNA示意图
2.&lncRNA生物学功能
在哺乳动物基因组中，有4%~9%的序列产生的转录本是lncRNA（相应的蛋白编码RNA的比例是1%）。lncRNA起初被认为是基因组转录的“噪音”，是RNA聚合酶II转录的副产物，不具有生物学功能。然而，近年来的研究表明，lncRNA会广泛参与到染色体沉默，基因组印记、染色质修饰，转录激活，转录干扰，核内运输等多种重要的调控过程，通过对已发现的lncRNA的研究，研究者已发现lncRNA能够在多种层面调控基因表达，一般来说，主要包括以下三个层次：
2.1.&表观遗传学调控某些特异的lncRNA会招募染色质重构和修饰复合体到特定位点，改变DNA/RNA甲基化状态、染色体结构和修饰状态，进而控制相关基因的表达。很多DNA/RNA甲基化突变与癌症等某些疾病发生有关，而染色质修饰状态的改变也通常会影响到某些基因的表达状态，最常见的是在启动子区域出现的H3K4me3、H3K9me2及H3K27me3修饰等，这些组蛋白修饰会改变染色质活性，从而促进或抑制转录，控制基因表达。
这类lncRNA中，最典型的是HOXC基因簇转录的lncRNA HOTAIR，会募集染色质修饰复合体PRC2，并将其定位到HOXD基因簇位点，改变该区域的染色质修饰状态，进而抑制HOXD基因表达。已经有临床研究表明，在乳腺癌、结肠癌和肝癌等肿瘤组织中HOTAIR表达水平与肿瘤转移、复发及预后效果紧密相关，肿瘤细胞中HOTAIR高表达会抑制某些肿瘤转移抑制基因，促进肿瘤恶化，反之，沉默HOTAIR则会使肿瘤细胞丧失转移能力。除了HOTAIR，还有其他一些lncRNA可以通过募集染色质修饰复合体，对DNA/RNA和组蛋白的表观遗传状态进行修饰，如Xist，Air等。
2.2.&转录调控在真核细胞中，转录因子对于基因转录非常重要，它们可以结合到基因转录产生的RNA上，控制RNA转录、定位和稳定性。一些lncRNA会作为配基，与一些转录因子结合，形成复合体，控制基因转录活性。例如，由一个超保守区域转录产生的lncRNA Dlx6os1既可以作为antisense RNA控制Dlx6表达，也可以通过募集DLX2或MECP2蛋白调控Dlx5和Gad1的表达。还有一些lncRNA本身就是转录因子。例如，lncRNA HSR1可以同HSF1、eEF1A共同形成复合物，在细胞热休克应激反应时调节热休克蛋白表达。另一个例子中，lncRNA GAS5会折叠成一个类似糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor，GR）DNA结合位点的结构，同GR互作，进而阻止GR发挥调控作用。在最近的研究中，有学者发现一些增强子也会通过转录产生RNA（enhancer RNA，eRNA），对特定方向距离较远的基因进行调控，不过，eRNA发挥调控作用的机制尚未确定。
2.3.&转录后调控除了上述两种机制，lncRNA还会直接参与到mRNA转录后调控过程中，包括可变剪切、RNA编辑、蛋白翻译及转运等过程中。这些过程对于基因功能多态性非常重要。参与mRNA转录后调控的主要为antisense lncRNA，在mRNA可变剪切调控过程中，antisense lncRNA会与mRNA互补区域结合，影响某些剪切位点募集剪切体，控制mRNA剪切过程，同时也会对RNA编辑（A-to-I）产生影响。在mRNA核转运及胞内定位过程中，也有一些antisense lncRNA同mRNA互作，发挥调控作用。
2.4.&调控miRNA除了直接调控mRNA，lncRNA还会通过控制miRNA表达来影响其靶基因的表达量。在一些肿瘤细胞和特定组织中，一些lncRNA会携带有某些miRNA的“种子序列”，像海绵一样结合miRNA，从而阻止miRNA同其靶mRNA结合。
总结起来，虽然关于lncRNA调控作用已经有很多研究，但目前还有很多关键问题没有解决，比如说，细胞如何平衡调控miRNA和lncRNA的表达、lncRNA如何得到结合miRNA的信号等。随着对lncRNA研究越来越深入，研究者也将发现更多lncRNA调控模式。
lncRNA功能示意图 来源：Yang G, Lu X, Yuan L. LncRNA: A link between RNA and cancer[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms, 2014.
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联系信箱：Nat Genet文献精读：教你分析高通量筛选数据的思路
Nat Genet文献精读：教你分析高通量筛选数据的思路
——日读一帖，解螺旋大V团队伴你科研路作者：螺丝钉Ｗ解螺旋出品，转载需经授权　　解螺旋今天与大家分享的内容源于在解螺旋lncRNA俱乐部分享过的、来自NAT GENET的相关文献（IF=29.648)（索要原文请在解螺旋公众号中回复0507），对lncRNA感兴趣的小伙伴，欢迎仔细品读。加入lncRNA俱乐部可以加解螺旋助手为好友并提出您的要求（助手微信号：helixlife0）。摘要翻译　　lncRNA可充当基因调控元件，对外界刺激产生应答，调节基因活性。但这种活性的调节范围和功能尚不清楚。作者使用108个具有不同外界刺激的人的组织标本，采用超高密度阵列，对56个细胞周期相关基因的启动子进行筛选。鉴定了216个可能编码lncRNA的转录区域，RT-PCR验证了他们中的一些分子在细胞周期循环过程中周期性的表达。提示这些分子在肿瘤中的表达改变，与特定的致癌刺激、干细胞分化或DNA损伤有关。在CDKN1A启动子区，DNA损伤诱导了5个lncRNA分子的表达。将其中的一个lncRNA命名为PANDA，其诱导表达具有p53依赖性。PANDA与转录因子NF-YA相互作用，抑制了促凋亡基因的表达；PANDA缺失导致人成纤维细胞对阿霉素诱导的细胞凋亡更加敏感。以上结果表明，启动子表达的lncRNA在细胞生长控制方面有广泛的作用。研究思路　　研究者最开始通过对56个基因的启动子区域进行筛选，获得216个转录本；然后通过大量的生物信息学分析，证实了他们都是lncRNA。然后通过gene module map将范围缩小到60个转录本（都与细胞周期或ESC相关），然后通过阿霉素刺激细胞模型，缩小到几个转录体，最后由于PANDA 的表达变化是最强的（40倍），将研究的重点放在了PANDA上。筛选细胞周期相关的lncRNA的流程图推荐理由　　一般来说，如果要进行lncRNA的芯片筛选，会获得海量数据。如何分析这些数据？　　有时候，我们可以委托公司或者有生物信息学背景的人来做，但委托者更多还是依赖我们的思路来做。因此提出分析的思路是最为关键的。　　“这篇文章之所以很有借鉴意义，是因为大多数CNS级别的文章，对于怎样通过筛选获得候选分子，介绍得语焉不详。而是重点就筛到的候选分子，对其功能做了大量的研究工作。这篇文章正好反其道而行之，对于PANDA的功能做得不多。反而着重介绍了如何筛选研究对象并逐步缩小范围，最后就感兴趣的lncRNA（PANDA）进行深入研究。” 研究内容第一步 筛选转录起始位点（TSS）的RNA　　在转录起始位点附近，RNA聚合酶常常可以产生20-200nt的转录产物，被称为启动子相关小RNAs（RASRs）。这些分子是有功能的，还是仅仅是转录副产物，不得而知。　　作者就聚焦TSS区附近转录的非编码RNA进行筛选和分析。在做筛选时，作者证实了绝大多数（41/56）的exon 1 都能被检测到，说明3’bias 现象不存在（分辨率是5个nt，很可能出现5个T的探针。如果出现5个T的探针，和RNA的3’poly A 区域容易形成互补，即是所谓的3‘bias 现象）。　　首先，用来源于各种干扰下的人类细胞，包括细胞周期同步改变、DNA损害、分化刺激、致癌的刺激，进行复瓦市微阵列，总共选取了56个基因，研究位置在9p21区（此区域包括p16、p14、p15）的25 kb 分辨率5nt 、 TSS上游10kb、TSS下游2kb。　　调用算法峰值寻找统计上最明显的信号，并找到至少有50kb的连续区域。最后确定了216个离散的转录区域，平均每个样本中有73个不与细胞周期基因重叠的转录区。平均长度234nt。171个在TSS的5’端，40个在内含子区，5个在TSS的3’端下游。（1）CHIP-chip检测结合EpiGRAPH分析，证实这216个转录区是普遍转录的。（2）CSF验证结合BLAST分析，这些分子不编码蛋白。（3）另外，这些转录产物都不含有miRNA前体，小核仁RNA等。　　以上特征，与lncRNA相符。　　将这些杂交信号与TSS做对比，发现一个高峰，正在TSS下游与exon1对应。并且发现在TSS上游4~8kb处富集非编码RNA。第二步：证明这些候选lncRNAs具有生物学功能　　在这216个转录产物中，有92个转录产物至少有2倍或以上的表达变化。这些发生变化的转录产物大部分参与了干细胞通路（40个）、浸润性乳腺导管癌（35个）。进一步分析，发现干细胞和肿瘤干细胞所引起的lncRNA的变化具有极大的相似性。最后，通过GO 分析，发现这216个转录产物可以分成三个簇，主要参与的细胞周期、自我更新和肿瘤发生。第三步：了解lncRNA的作用机制是顺式还是反式lncRNA与同源mRNA间的表达是否有关？　　17组全基因组表达测序，计算lncRNA和mRNA的相关皮尔森系数。发现无关，推测lncRNA不起顺式作用。　　已有报道发现lncRNA可以发挥顺式作用，即指上游的lncRNA转录后，通过调控其下游的mRNA（lncRNA的位点loci与mRNA靠得很近）的转录。但是通过筛选及分析发现lncRNA与其附近的mRNA 之间的表达没有相关性，因此排除了顺式作用。lncRNA与别处的基因表达是否相关？　　针对每一个lncRNA，研究者都选取了一组mRNA（入组mRNA 条件是与该特定的lncRNA的表达呈现正相关或者负相关），通过分析这个gene module map，发现多个lncRNA与多种生物学途径紧密相关，包括细胞周期、DNA重组、RNA 剪切、DNA 损伤应答等。第四步：验证lncRNA在细胞周期、ESC分化、癌症和DNA损伤反应中表达　　作者挑选了60个lncRNA进行研究（如何挑选的未明确说明，估计是针对上面的gene module map 进行挑选的。挑选的基因都是与细胞周期，ESC 相关）　　qRT-PCR验证了60个lncRNA在不同的情况下有不同的表达方式和作用。在Hela细胞和fibroblast 细胞中，这些lncRNA的表达，都呈现出一个随时间而变动的调控方式（即随着时间的变动，都有峰值出现，而且这些峰值往往和细胞周期相对应）。提示这些lncRNA参与了细胞周期的变化。　　通过ESC （有干性，未分化）和 fetal pancreas（分化终末细胞）的比较，显示出这些lncRNA在分化的过程中，受到显著地调控。　　类似地，可以发现正常地乳腺组织和转移性乳腺癌组织中，lncRNA的表达也呈现显著地差异。　　从这一步开始，研究者已经把筛选到的216个转录体，缩减到60了。而且这60个都是和ECS及细胞周期相关的。研究内容已经开始越来越聚焦了，为后面focus 到 PANDA 打下了基础。第五步：聚焦其中一个lncRNA验证其功能　　接下来作者就锁定目标了。通过共表达图谱预测到一些lncRNA和DNA损伤有关。阿霉素刺激的胎儿肺成纤维细胞，有12个lncRNA的表达出现至少2倍的改变。其中，2个位于p53目标基因CDKN1A (也叫p21)的TSS的5’端，这两个lncRNA与CDKN1A mRNA 相似的地方是，都可以受到阿霉素刺激的调控（阿霉素刺激是研究DNA损伤的经典方法），提示这两个lncRNA参与了DNA损伤反应。将60个lncRNA放在胎儿肺成纤维细胞模型中，阿霉素刺激24h，观察他们的表达情况，发现CDKN1A上游的一些lncRNA反应迅速明显。在这些lncRNA中，CDKN1A-4845 的表达高达40倍（文中之后将其称为PANDA），提示这条lncRNA可能在DNA损伤反应中起到重要的作用。　　以上说明CDKN1A区域的lncRNA可能在DNA受损反应下与p21相互作用。　　最后，siRNA的方法对PANDA进行功能验证。　　PANDA，一种长链非编码未经剪切的1.5kb lncRNA，由CDKN1A的反义链转录，动力学比CDKN1A更快。功能缺失和互补实验表明，PANDA在DNA损伤是依赖于p53的感应。敲除CDKN1A或PANDA对彼此的DNA损伤反应无影响，说明他们的作用是平行的。PANDA通过将转录因子NF-YA与靶基因启动子隔离，阻滞凋亡基因表达，增强细胞存活。在CDKN1A位点的编码和非编码mRNA协调DNA损伤反应的模式图作者背景　　通讯作者供职于斯坦福大学，主要研究基因在空间与时间上的功能，目前主要的研究方向是这些基因如何在lncRNA的调控之下，进行表达和发挥功能。
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