利用多基因转化技术培育重金属超富集植物的研究_伤城文章网
中国科学院植物研究所 博士学位论文 利用多基因转化技术培育重金属超富集植物的研究 姓名：郭江波 申请学位级别：博士 专业：植物学 指导教师：麻密
摘要摘要植物耐受和积累重金属的细胞学基础是植物细胞内存在一些能够络合和区隔化金属离子的机制。细胞中络合重金属离子最重要的小肽分子是谷胱甘肽（ＧＳＨ）和植物络合素（ＰＣｓ），而ＹＣＦ Ｉ基因编码的ＡＢＣ．ｔｙｐｅ液泡膜转运蛋白负责将重金属离子及其与上述小肽形成的复合物转运进入细胞液泡中，即将重金属离子区隔化。植物细胞中合成ＧＳＨ和ＰＣｓ的关键酶分别是Ｙ一谷氨酰氨半 胱氨酸合成酶（ＧＳＨ Ｉ）和植物络合素合酶（ＰＣＳ），他们的编码基因分别为ＧＳＨ Ｉ和ＰＣＳ。此外定位于细胞质中的小囊泡上且对二价阳离子的吸收和转运有重要 作用的ＳＭＦ２蛋白可能也参与重金属离子的区隔化过程。为了改良植物使之能够应用于清除土壤中的重金属污染，本研究基于植物 耐受和积累重金属的细胞学机制，分别将酿酒酵母来源的ＧＳＨＩ、ＹＣＦ Ｉ和 ＳＭＦ２基因，以及ＧＳＨ Ｉ、ＹＣＦ，基因分别与镉抗性植物大蒜来源的ＡｓＰＣＳ Ｉ 基因构建为不同的基因组合表达载体，转化模式植物拟南芥。对不同组合转基 因拟南芥的功能分析表明： １、酵母来源的基因ＧＨＳ Ｉ、ＹＣＦ １分别在拟南芥中异源超表达可以在一 定程度上提高转基因拟南芥耐受、积累重金属的能力；其中ＧＳＨ，基因在拟南 芥超表达可以提高转基因拟南芥合成ＧＳＨ的能力，转基因拟南芥细胞中ＧＳＨ 浓度比野生型增加。２、将ＧＳＨ，基因和来自大蒜的么妒ＣＳ Ｉ基因同时在拟南芥中超表达能够显著提高转基因拟南芥耐受和积累重金属的能力，且积累和耐受能力显著高于分别转ＧＳＨ，或ＡｓＰＣＳ Ｉ的单价转基因株系；将ＹＣＦ Ｉ基因和ＡｓＰＣＳ，基因同 时在拟南芥中超表达也能够显著提高转基因拟南芥耐受和积累重金属的能力， 且积累和耐受能力显著高于分别转ＹＣＦ Ｉ或４妒ＣＳ Ｉ的单价转基因株系。两种 双价转基因株系ＧＳＨ，＋ＡｓＰＣＳ，和ＹＣＦ Ｉ＋ＡｓＰＣＳ Ｉ在积累和耐受不同重金 属胁迫方面没有明显差别。３、将ＳＭＦ２基因在拟南芥中异源表达，研究了植物中囊泡转运是否参与了 重金属离子的吸收和区隔化过程。研究结果表明：超表达ＳＭＦ２基因的拟南芥 尽管耐受重金属胁迫的能力与野生型没有明显差异，但其积累重金属的能力显著提高。这为证明植物中小囊泡转运参与重金属转运提供了间接证据。Ｉ郭江波博士论文：利用多基因转化技术获取重金属超富集植物的研究综上所述，同时将多个参与植物对重金属络合、转运和区隔化作用的关键基因在转基因植物中表达可以提高植物耐受和积累重金属的能力，是培育可用 于植物修复的新型工程植物的值得探索的途径。本论文所设计和构建的双价基因组合及其对目标植物的转化，在环境重金属污染的清除中有潜在的应用价值。关键词：重金属；镉；砷；植物络合素合酶；ＹＣＦ Ｉ；ＰＣＳＩ；ＧＳＨＩ；ＳＭＦ２ⅡＡｂｓｔｒａｃｔＥｌｅｖａｔｅｄ ｈｅａｖｙ ｍｅｔａｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ａｎｄａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｏＶｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｍｕｌｔｉｐｌｅ ｇｅｎｅｓＪｉａｎｇｂｏ Ｇｕｏ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｐｒｏｆｅ￥ｓｏｒ Ｐｌａｎｔｓ ｃｅｌｌｓ ｈａｖｅ ｍｅｔａｌｓａｌｌＭｉ ＭＡｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｔｏ ｔｏｌｅｒａｔｅ ａｎｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅ ｈｅａｖｙｂｙｃｈｅｌａｔｉｏｎａｎｄｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｌａｔｉｎｓ（ＰＣｓ）ａｎｄｒｅｄｕｃｅｄｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ（ＧＳＨ）ａｒｅｔｈｅ ｍａｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｔｏ ｃｈｅｌａｔｅ ｈｅａｖｙ ｍｅｔａｌ ｉｏｎｓ，ｗｈｉｌｅＹＣＦ Ｉ，ａｎ ＡＢＣ－ｔｙｐｅ ｆａｍｉｌｙ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｌｏｃａｔｅｄ ｉｎ ｂａｋｅｄｓ ｙｅａｓｔ ｔｏｎｏｐｌａｓｔ，ｉｓ ｉｎｃｈａｒｇｅ ｏｆ ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｎｇ ｈｅａｖｙ ｍｅｔａｌ ｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒｓ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓｉｎｔｏ ｖａｃｕｏｌｅｓ．Ｔｈｅ ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｋｅｙ ｓｔｅｐ ｅｎｚｙｍｅｓ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ＰＣｓ ａｎｄ ＧＳＨａｒｅｐｈｙｔｏｃｈｅｌａｔｉｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ａｎｄ丫一ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ＰＣＳ ａｎｄ ＧＳＨ／ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＳＭＦ２ ｉｓ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｖｅｓｉｃｌｅ，ｉｓａａｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｒａｍｐ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｍｅｔａｌ ｌｏｃａｔｅｄ ｉｎ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｐｅｒｈａｐｓｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ―ｂｏｕｎｄ ｉｎ ｔｈｅｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．ＳＭＦ２ｍｅｔａｌｄｉｖａｌｅｎｔｉｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ，ａｎｄｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｓｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅａｖｙ ｍｅｔａｌ ｉｏｎｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ ｃｅｌｌ．Ｉｎ ｔｈｅ ｐａｓｔ ｔｈｏｕｇｈ ｍａｎｙ ｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔｐｌａｎｔｓｂｙ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｌｉｔｔｌｅ ａｄｖａｎｃｅｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｐｌａｎｔｓｆｏｒｐｈｙｔｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ，ａｎｄｉｎ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｗｅｒｅ ｔｈａｌｉａｎａ，ｗｈｉｃｈｇｏｔ．Ｗｅａｒｅａｔｔｅｍｐｔｅｄ ｔｏ ｔｒａｎｓｆｏｒｍ ｓｅｖｅｒａｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎｔｏ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｒｅｌａｔｅｄ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｄｅｔｏｘｉｃａｔｉｎｇｈｅａｖｙｍｅｔａｌｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ ａｎｄ ｙｅａｓｔ．Ｉｎ ｔｈｉｓ ｔｈｅｓｉｓ，ｓｉｘ ｂｉｎａｒｙ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ：ＧＳＨ Ｉ，ＹＣＦ Ｉ，ＡｓＰＣＳ Ｉ，ＧＳＨ Ｉ＋ＡｓＰＣＳ １，ＹＣＦ，＋ＡｓＰＣＳ１ ａｎｄＳＭＦ２ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｇｅｎｅｓＳＭＦ２，ＹＣＦ ｌ ａｎｄ ＧＳＨ １ａｒｅｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｓｔｒａｉｎ￥２８８Ｃ．ａｎｄ ＡｓＰＣＳ ｌ Ｓａｔｉｖｕｍａｒｅ ｆｒｏｍｇａｒｌｉｃ（ＡｌｌｉｕｍＬ．）．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅ ｈｅａｖｙ ｍｅｔａｌ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｗｅｒｅｔｏｌｅｒａｎｃｅ ａｎｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ａｎｄｄｏｕｂｌｅ ｇｅｎｅｓｅｖａｌｕａｔｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ１／Ｉａｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ：爿加６脚括ｃ蛆ｄｒａｍａｔｉｃａｌｌｙｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｏ２、ＯｖｅｒｅＸｐｒｅｓｓｉｎｇｇｅｎｅｓｏｆＧＳＨ，ａｎｄＡｓＰＣＳ ＪｓｉｍｕＩｔ姐ｅｏｕｓＩｙｍｈｙｐｅｒａｃｃｕｍｕｌａｔｅｓｔｒｅｓｓｅｓｍｏｒｅｈｅ哪ｍｅｔａｌｓ跹ｄｈ鲥ｅａｎｄｓｉｎｇｌｅｍｏ∞ｈｅａｖｙｍｅｔａｌｔｈａｎｗｉｌｄｔｙｐｅｔｒａｎｓｇｅｍｃｓ；ＹＣＦ［ａｎｄ ＡｓＰＣＳ，ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｍｅ ｓｉｍｉｌａｒａｂｉｌｉｔｙｔ０也ｅ仃ａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＧＳＨ，ａｎｄ么ｓＰＣＳ Ｊｉｎ胁６螂捃脚：ｅｎｈａｎｃｅｒｓｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ｓｅｖｅｒａｌ ｈｅａｖｙ ｍｅｔａｌｓ；３、Ｔｈｅｏｖｅ哗ｓｓｉｏｎｏｆＳＭＦ２ｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｕｎｄｅｒ铆ｏｐｒｏｍ嘶ｏｎｓ ｗ弱阳髓衄ｅｄｖｅｓｉｃｌｅｓ ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｗｈｅｔｈｅｒ ｔｈｅｔｒａｎｓｐ嘣ｔｈｅｌｒ ｈａｖｅｒｅｓｕｎｓ ｓｈｏｗｓ也ａｔ ｏｆ ｈｅａｖｙ ｍｅｔａｌｓ ｉｎ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ?Ｔｈｅ ｐａｎｉｃｉｐａｔｅ ｉｎ出ｅ ｄｅｔｏＸｉｃａｔｉｏｎ４阳６舶声括ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｎｏＳＭＦ２ Ｃａｎ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅ ｍｏｒｅｈｅａｖｙ ｍ‘纯ａｌｉｏｎｓｌｎｒｏｏｔ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｎ ｉｎ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ＇ｓ，ｔｈｏｕｇｈ ｔｈｅｉｒａｎｄ ｓｈｏｏｔ ｆｒｅｓｈ ｗｅｌ曲ｔｓｏｂｖｉｏｕｓｄｉ鼢ｅｎＣｅ ｗｉｔｈ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ’ｓ ｕｎｄｅｒ ｈｅａｖｙ ｍｅｔａｌｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ｐｅｒｈａｐｓｓｔｒｅｓｓｅｓ?ｏⅢｅｘｐｅｆｉｍｅｎｔｓｔ０ｏ肫ｒｉｎｄｉｒｅｃｔｖｅｓｉｃｌｅｓ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｓ ａｎｏｔｈｅｒ ｐａｔｈｗａｙｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｅ Ｉｎｈｅａｖｙｍｅｔａｌ ｉｏｎｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ?ｔｏｒｅｌａｔｅｄ ｃ０１１ｃｌｕｓｉｏｎ，ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ａｎｄｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆｉｏｎｓ ｃａｎ一ｃｈｅｌａｔｉｏｎ，仃ａｎｓｐｏ删ｏｎｃｏｍｐａｒｔｒｎｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｈｅａｖｙｍｅｔａｌｓ蛐ａｔｉｃａｌｌｙｃｅｌｌｓ Ｋｅｙｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｏｌｅｒａｎｃｅａｎｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ坟ａｎＳｇｅｍｃｐｌａｎｔｗｏｒｄｓ＝ｈｅａｖｙｍｅｔａｌｓ；ｃａｄｍｉｕｍ；ａｒｓｅｎｉｃ；ｐｈｙｔ。ｃｈｅｌａｔｉｎｓｙｎｔｈａｓｅ；卿，；Ｐ∞卜ＧＳＨ ｋＳＭＦ２ＩＶ缩略词英汉对照缩略词英汉对照Ａｍｐ Ａｓ ｂｐ Ｃｄ ｃＤＮＡ Ｃｙｓ ＤＥＰＣ ＤＮＡａｍｐｉｅｉｌｌｉｎａｒｓｅｎｉｃ ｂａｓｅｐａｉｒ氨苄青霉素 砷 碱基对 镉 互补ＤＮＡ 半胱氨酸 焦碳酸二乙酯 脱氧核糖核酸 ５，５’．二硫硝基苯甲酸 溴化乙啶 乙二胺四乙酸 绿色荧光蛋白 谷胱甘肽 ｐ一葡萄糖苷酸酶 潮霉素 异丙基一１３一Ｄ一硫代半乳糖苷 千碱基对 卡那霉素 非蛋白巯基 光密度 聚合酶链式反应 植物络合素合酶 植物络合素 核糖核酸 反转录聚合酶链式反应 每分钟转速 十二烷基磺酸钠ｃａｄｍｉｕｍ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡｅｙｓｔｅｉｎｅ ｄｉｅｔｈｙｌ ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｓｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ５，５＇－ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ?２ ｅｔｈｄｉｕｎｌ ｂｒｏｍｉｄｅＤＴＮＢＥＢ ＥＤＴＡ ＧＦＰ ＧＳＨ ＧＵＳ Ｈｙｇ ＩＰＴＧ ｋｂｄｉｄｏｄｉｕｍ ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａ－ａｃｅｔａｔｅｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ１３－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎｉｓｏｐｒｏｐｙｌ―Ｂ－Ｄ－ｔｈｉｏ ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅｋｉｌｏｂａｓｅ ｋａｎａｍｙｃｉｎ ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ ｓｕｌｔｈｙｄｒｙｌ ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙＫａｎＮＰＴ ｏ．Ｄ． ＰＣＲ ＰＣＳ ＰＣｓｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎｐｈｙｔｏｃｈｅｌａｔｉｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｐｈｙｔｏｃｈｅｌａｔｉｎｓ ｏｘｙｒｉｂｏｓｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄＲＮＡＲＴ－ＰＣＲｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ＰＣＲｒｐｍＳＤＳＲｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｐｅｒ ｍｉｎｕｔｅ ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ郭江波博士论文：利用多基因转化技术获取重金属超富集植物的研究ＴＨｓ Ｘ－ｇａｌＴｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｌｍａｎｅ三羟基甲基氨基甲烷５－ｂｒｏｍｏ－４－ｃｈｌｏｒｏ一３－ｉｎｄｏｌｙｌ－ｐ?Ｄ―ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ ５一溴．４一氯一３－吲哚．Ｄ．Ｄ．半乳糖苷关于学位论文使用授权的说明本人完全了解中国科学院睦濑７研究所有关保留、使用学位论文的规定，即：植 物研究所有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以提供目录 检索以及公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论 文。１．学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行研究 工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成 果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。 对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明 确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。学位论文作者签名第一章文献综述第一章文献综述１．１重金属的化学和物理特性及其对植物细胞的毒害 １．１．１重金属的化学和物理特性金属在自然界中以氧化的形式存在，而且许多金属是地球生态系统的必要组成成分。金属中密度超过４．５ ｇ?ｅｒａ－３以上的称为重金属，例如铜、锌、钻、 镍、钨、钼、锑、铋、铅、锡、镉（ｃａｄｍｉｕｍ，Ｃｄ）、汞等大概有５３种（Ｓｃｈｕｔｚｅｎｄｕｂｅｌｅｔａ１．２００２）。其中１７种重金属在生理状态下是可溶的，可能是生物维持生命需要的。铁、钼、锰是重要的微量元素，而锌、镍、铜、钒、钴、钨和铬在痕量 水平会对生物产生或高或低的毒害。虽然最近发现镉是一种硅藻的碳酸酐酶的 辅基（Ｌａｎｅ ｅｌ ａ１．２００５），但人们通常认为镉和砷、汞、银、铅非但不是植物营养元素，而且还对植物的生长发育有或大或小的毒害作用ｍｉｅｓＳｃｈｕｔｚｅｎｄｕｂｅｌ ｅｔ１９９９；ａ１．２００２）。陆地生态系统中的重金属主要来源于大气沉降和环境中物质的降解。土壤中重金属离子的浓度依赖于岩石的淋溶和大气中金属离 子的沉降。在正常条件下，自然界中重金属的离子浓度一般很低，如Ｃｄ在土 壤、空气、水和生物系统中以微量存在，地壳中Ｃｄ的平均含量为０．１５＂－－－０．２０ ｍｇＣｋｇ，空气中为０．００２＂－－０．０５ ｍｇ／ｍ３（ＤｉＴｏｐｐｉ ｅｔａ１．１９９９）。由于人类活动，如采矿、燃烧化石燃料、金属工业、含磷化肥的使用等等，特别是在工业革命之后， 导致地球生态系统中的重金属的量急剧增加（Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ１９９８；Ａｚｉｍｉｅｔ ａ１．２００３；Ｙａｎｇ ｅｔ１９７９；Ｄｉ Ｔｏｐｐｉ ｅｔ ａ１．ａ１．２００５），使得土壤、水体中的重金属含量远远超过生物所能承受的范围，而且在某些地区严重危害了当地居民的身心健康（吴 燕玉等１９８９；Ｎｉｅｓ１９９９；Ｉｋｅ ｅｔａ１．２００６）。土壤中由于重金属离子和有机、无机土壤复合物及有机质结合，因此游离的和非游离的重金属离子的可移动性是不 同的。土壤类型不同，对金属离子的吸附、解吸附、以及形成复合物的过程有 影响，进而影响金属离子在土壤中的可溶性和可移动性。１．１．２重金属对植物细胞毒害的机理重金属对植物的作用，特别是其对植物的毒害作用，依赖于植物根际复杂 的反应。植物根际反应不仅包括土壤和植物之间的交换过程，还包括菌根真菌郭江波博士论文：利用多基因转化技术获取重金属超富集植物的研究等根际微生物的活动。只有在植物根尖周围的几毫米范围内重金属离子能够进入植物根中，然后在植物皮层中通过非质体途径，以其在植物中的浓度梯度为动力被运送到植物的其他部分或是积累在植物细胞壁中（Ａｒｄｕｉｎｉｅｔ ａＬ１９９５），最后金属离子接触细胞膜结构后开始产生毒害作用。重金属离子主要通过两种途径进入植物细胞：１）浓度梯度提供动力的植物细胞被动吸收；２）耗能的、可诱 导的、底物特异的主动吸收ｍｉｅｓ １９９９；Ｗｉｌｌｉａｍｓｅｔａ１．２０００；Ｃｌｅｍｅｎｓ２００１）。现在利用酵母功能互补等手段在植物中发现了很多重金属离子跨膜转运相关的转运蛋白（Ｃｌｅｍｅｎｓ ２００１）。 重金属离子对活细胞产生毒害与其化学特点有关。大多数的重金属是过渡金属，在生理条件下，由于它们的６轨道未被完全填充而形成阳离子。有氧细胞细胞内的生理电位介于一４２０ｎｌＶ～－－８００ｍＶ（Ｍａｔｓｕｕｒａ ｅｔａｌ．１９７８），因此重金属在生理条件下可以分为两大类：氧化还原活性活泼和惰性金属。氧化还原活 性活泼的重金属离子可以和比其氧化还原电位低的生物分子发生氧化反应，例如Ｆｅ２＋、Ｃｕ＋是细胞内０２一产生的催化剂，而且可以通过Ｆｅｎｔｏｎ反应和０２一反应生成Ｈ２０２和ＨＯ‘，这些自由基分子就会对细胞的膜结构和生物大分子如ＤＮＡ产生攻击，使细胞受到伤害（Ｓｔｏｈｓｅｔａ１．１９９５；Ｑｉａｎ１９９６；Ｂｅｃａｎａ ｅｔ ａ１．１９９８）。因此，Ｆｅ２＋和Ｃｕ＋等重金属离子通过自氧化和Ｆｅｎｔｏｎ反应产生自由基是对活细胞 产生毒害的一条重要途径。某些重金属离子还可以和氧、氮、硫原子强烈结合， 使某些生化过程中的酶失活。Ｃｄ２＋可以和酶蛋白中的半胱氨酸上的毓基结合， 打破细胞内的毓基平衡，并使酶的活性下降或消失，进而对活细胞产生毒害作 用（Ｃａｎｅｓｉｅｔ ａ１．１９９８；Ｃａｒｏｌ ｅｔａ１．２０００）。重金属还可以通过替换细胞内酶的活性中心的金属离子使酶钝化进而使细胞死亡。许多酶的活性中心都需要金属离子 辅基的参与才能有功能。二价阳离子如Ｃ０２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋等可以将核酮糖ｌ、５一二磷酸羧化酶／力Ⅱ氧酶的活性中心的Ｍｇ＋替换掉，导致酶的活性丧失（Ｃｌｉｊｓｔｅｒｓｅｔ ａ１．１９８５；Ｖａｎ Ａｓｓｃｈｅ ｅｔａ１．１９８６）。Ｃｄ２＋还可以将钙调蛋白中的Ｃａ２十替换调，使细胞内依赖Ｃａ２＋的信号转导途径受到抑止，使细胞内的生理生化反应出现混乱，最后导致细胞死亡（ＣｈａｏＫａｎｅｋｏ ｅｔｅｔ ａＬ１９８４；Ｒａｉｎｔｅａｕ ｅｔ ａ１．１９８９；Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａＬ１９９０；ａ１．２００６）。综上所述，重金属离子主要是通过三条途径对植物细胞产生毒害：１）通过 自氧化和Ｆｅｎｔｏｎ反应产生氧自由基分子；２）阻断生物大分子中必需的酶活性中 心；３）替代生物大分子中必需的金属离子。２第一章文献综述１．１．３重金属离子在植物中的分布一般情况下，重金属在植物植物组织、器官内中的分布是：根＞叶＞茎＞ 花、果、籽粒。但超富集植物（ｈｙｐｅｒａｃｃｕｍｕｌａｔｏｒｓ）是一类能够在地上部分富集重金属的植物（Ｂａｋｅｒｅｔａ１．２００２），现在已经报道有大约４５种（Ｆｒｅｅｍａｎｅｔ ａ１．２００４）。Ｌｉｕ及其同事通过电子能量损失谱（ＥｌｅｃｔｒｏｎＥＥＬＳ）和电子能量损失谱成像技术（ＥｌｅｃｔｒｏｎＥｎｅｒｇｙ Ｌｏｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，ＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃＩｍａｇｉｎｇ，ＥＳＩ）研究洋葱（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）发现，在ｌＯＯ山Ｖｉ Ｃｒ＋Ｎｉ处理条件下，这两种重金属主要分布在 植物细胞的细胞壁和液泡ｑｂ（Ｌｉｕｅｔａ１．２００３）。Ｆｒｉｔｉｏｆｆ等人（Ｆｒｉｔｉｏｆｆｅｔ ａ／．２００６）在研究水生植物浮叶眼子菜（Ｐ．ｎａｔａｎｓ）的不同组织对Ｚｎ，Ｃｕ，Ｃｄ，和Ｐｂ的吸收和 转运发现，大约２４％到５９％的重金属结合在植物细胞壁上，而且发现除Ｐｂ外， 其他金属在茎杆细胞细胞壁的积累要低于在叶肉细胞细胞壁中的积累。除Ｃｄ 以外，研究人员没有观察到其他的重金属离子在不同的植物组织之间迁移。其 他的研究者（ＶａｒｇａＸ．ｒａｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｅｔａ１．２００２）利用全反射Ｘ射线荧光光谱法（ｔｏｔａｌｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）研究Ｃｄ，Ｎｉ，Ｐｂ和Ｆｅ在黄瓜根、叶的细胞质和细胞壁中的分布发现，在根中绝大部分Ｐｂ分布在细胞壁中，而Ｃｄ和Ｎｉ主要 分布在细胞质中。在叶中，约５０＂－－６０％的Ｐｂ和几乎全部的Ｃｄ分布在细胞质中， 约３０－－－４０％的己迁移的Ｎｉ残留在叶的细胞壁中。显然，不同重金属的吸收和 转运、以及在植物组织、细胞内的分布与植物耐受和积累该重金属的机制有关。１．２植物耐受、积累重金属的机制植物虽然不能像动物那样迁移避开对自己不利的环境，但是它们还是在千 百万年的进化过程中发展出很多适应环境变化的机制来应对生存条件的改变。在整体植株水平和细胞水平上，不同植物耐受不同重金属胁迫的方式不尽相同。 根据现有的文献资料，植物耐受重金属的机制可以分为细胞质耐受机制和细胞质膜及细胞壁外排机锘１］（Ｔａｙｌｏｒ １９９１；Ｋｏｃｈｉａｎ １９９５）。外排机制可以阻止重金属离子进入细胞质中，典型的作用方式就是将金属离子沉降在植物细胞壁中，例如火山叶藓（Ｊｕｎｇｅｒｍａｎｎｉａ ｖｕｌｃａｎｉｃｏｌａ）就可以将Ｈｇ沉淀在细胞壁中固定（Ｓａｔａｋｅｅｔａ１．１９９０），洋葱可以将Ｐｂ沉淀在细胞壁上降低其对自身的毒害（Ｗｉｅｒｚｂｉｃｋａ１９９８）。植物还可以分泌有机酸，如草酸、苹果酸、柠檬酸络合重金属以后将其 排出细胞质膜外，降低细胞对这些重金离子的吸收（Ｐｅｌｌｅｔ３ ｅｔ ａ１．１９９５；ｇｙａｎ ｅｔａＬ郭江波博士论文：利用多基因转化技术获取重金属超富集植物的研究１９９５；Ｍａｅｌ ａ１．１９９８；Ｚｈｅｎｇ ｅｌａ／．１９９８）。植物细胞质耐受重金属胁迫的机制建立在植物细胞络合（Ｃｈｅｌａｔｉｏｎ）、区隔 化（Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｔｉｏｎ）重金属离子的能力之上。而且植物能够超富集重金属是以植物细胞能够耐受重金属胁迫为前提的，虽然植物耐受和超富集重金属是 植物两个独立的特征。植物细胞内有很多小肽能够络合重金属离子，其中比较 重要的就是谷胱苷肽（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ，ＧＳＨ）和植物络合素（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｌａｔｉｎｓ，ＰＣｓ）。重金属离子被小肽络合后就会被转运到植物细胞的液泡中与细胞内的膜系统隔 离，这一过程就是区隔化（Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｔｉｏｎ）。植物受到重金属毒害以后，植 物的抗氧化酶系（Ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｙｓｔｅｍ）可以立即做出应答，因此植物的抗氧化酶系在植物耐受重金属胁迫中有重要的作用。１．２．１植物细胞内络合重金属的小肽１．２．１．１谷胱苷肽（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ，ＧＳＨ） 植物细胞内有数量众多的游离的、低分子量的巯基。一般情况下，这些巯 基得主要构成成份是ＧＳＨ。ＧＳＨ（Ｙ．Ｇｌｕ－Ｃｙｓ．Ｇｌｙ）是一种细胞保护剂和信号分 子，也是植物细胞中的主要的非蛋白还原硫的储存形式（Ｎｏｃｔｏｒｅｌａ／．１９９８）。ＧＳＨ 的保护作用主要体现在三个方面：１）还原型的ＧＳＨ是一个关键的抗氧化物；２）ＧＳＨ可以在谷胱苷肽．Ｓ．转移酶的作用下与其他分子发生亲电结合反应使进入细胞的外源异生物脱毒（Ｍａｒｒｓ１９９６；Ｅｄｗａｒｄｓ ｅｔ ａ１．２０００；Ｆｏｙｅｒ ｅｔａ１．２００５）；３）ＧＳＨ还可以和重金属离子络合使这些离子能够更容易被转运到植物细胞的液 泡内隔离以降低它们对细胞膜系统的损伤（Ｚｅｎｋ１９９６；Ｓｃｈａｆｅｒ ｅｔ ａ１．１９９７；Ｓｉｒｉｐｏｍａｄｕｌｓｉｌ ｅｌ ａ１．２００２；Ｂｏｖｅｔ ｅｌ ａ／．２００５）。拟南芥突变体ｒｍｌｌ缺失了ＧＳＨ合成途径中的第一个关键酶基因根部细胞不能正常分裂，原因在于细胞由Ｇ１期 转向Ｓ期需要ＧＳＨ的参与（Ｖｅｒｎｏｕｘ 育必需的（Ｏｇａｗａ ２００５）。 １）ＧＳＨ的合成及调控ｅｌａ１．２０００），因此ＧＳＨ是植物细胞正常发植物、动物和微生物中谷胱苷肽的合成都是由依赖ＡＴＰ的Ｙ．谷氨酰氨半 胱氨酸合成酶（Ｙ．ＥＣＳ）、谷胱苷肽合成酶（ＧＳａｓｅ）催化反应完成的（见图１．１）。 ＧＳＨ中连接谷氨酸和半胱氨酸的Ｎ端肽键是通过Ｙ位而非Ｑ位的羧基。植物中Ｙ．ＥＣＳ和ＧＳａｓｅ的活性很低，它们的两步催化反应可以发生在叶绿体和非叶绿体的细胞区间，而且在光合和非光合组织中都存在（Ｆｏｙｅｒ ｅｌ４ａ／．２００１曲。Ｙ．ＥＣＳ第一章文献综述的编码基因ｇｓｈ，最早是从拟南芥中利用大肠杆菌突变体功能互补克隆ｆ１０（Ｍａｙｅｔａ１．１９９４），但是将该基因在酵母突变体中异源表达只恢复了野生型酵母ｌＯ％ｅｔ的ＧＳＨ水平，进一步的功能互补实验证实这个蛋白具有ｙ．ＥＣＳ的活性（Ｍａｙａ１．１９９８ａ）。同样利用大肠杆菌突变体功能互补实验，Ｒａｗｌｉｎｓ等从拟南芥中克隆了编码ＧＳａｓｅ的基因ｇｓｈ ＩＩ（Ｒａｗｌｉｎｓｅｔａ１．１９９５）。依据ＧＳＨ合成酶系在豆科 ＧＳａｓｅ在细胞植物根瘤中的分布，有的学者推测Ｙ―ＥＣＳ主要分布在质体中， 质和线粒体中都有分布（Ｂｅｃａｎａ ｅｔ ａ１．２０００）。对动物细胞，特别是癌细胞的研究发现，蛋白因子和编码序列上游保守的 抗氧化反应元件可以调控Ｙ－ＥＣＳ的转录（Ｆｏｙｅｒ ｅｔ ａ１．２００１ａ）。相对来说，现在对ｇｓｈＩ和ｇｓｈ刀协同表达的调控了解很少，虽然现在已经清楚ＧＳＨ、ＧＳＳＧ和Ｈ２０２对转录本质上的影响微乎其微（Ｘｉａａｇ ｅｔ ａ１．１９９８）。Ｃｄ２＋能够诱导印度芥菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ］ｕｎｃｅａ）中ｇｓｈ 芥中ｇｓｈ Ｉ，ｎｇｓｈＩ和ｇｓｈ肼专录本丰度增加（Ｓｃｈａｆｅｒ ｅｔａｌ．１９９８），拟南ｅｔ１１转录也可以受Ｃｄ２＋和Ｃｕ２＋诱－导（Ｘｉａｎｇａ１．１９９８）。茉莉酸（Ｊａｓｍｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＪＡ）可以调控ｇｓｈ Ｉ和ｇｓｈ口转录本丰度，说明ＪＡ与重金属离子对ｇｓｈ Ｉ和ｇｓｈ口转录调控的信号转导途径可能相似（Ｘｉａｎｇｅｌａ１．１９９８）。虽然ＪＡ和重金属离子可以调控转录，但是蛋白质的翻译却受氧化胁迫的调控， 暗示可能存在转录后水平的调控，而且Ｈ２０２和ＧＳＨ／ＧＳＳＧ比例影响ｍＲＮＡ翻 译的去抑止化作用。ｇｓｈ，基因５’非转录区（５＇－ＵＴＲ）可以与抑止因子结合蛋 白作用，外加Ｈ２０２或改变细胞内ＧＳＨ／ＧＳＳＧ比例可以释放该蛋白，这暗示存在一个可以与５＇－ＵＴＲ结合的氧化还原作用敏感的复合体调控ｙ．ＥＣＳ ｍＲＮＡ翻译（Ｎｏｃｔｏｒ ｅｔ ａ１．２００２）。在植物和动物细胞中，产物抑止是Ｙ．ＥＣＳ转录后调控最重要的因素。Ｙ ．ＥＣＳ是ＧＳＨ合成的限速酶，而并非ＧＳａｓｅ。将ＧＳａｓｅ编码基因ｇｓｈ口在植物细胞质／叶绿体中超表达，虽然能够检测到ＧＳａｓｅ酶活性增加，但都不能提高转基因植物叶片中ＧＳＨ浓度；外加Ｙ．ＥＣ后，这些转基因植物叶片中ＧＳＨ浓度显著增Ｎ（Ｓｔｒｏｈｍｅｔａ１．１９９５）。而ｇ―ＥＣＳ编码基因ｇｓｈ，转化植物就可以大幅度提ｅｔ高植物细胞内ＧＳＨ浓度（Ｎｏｃｔｏｒａ１．１９９６）。２）ＧＳＨ代谢的细胞内区隔化５郭江波博士论文：利用多基因转化技术获取重金属超富集植物的研究●‘吲图Ｉ １植物细胞内ＯＳＨ合成、利用及降解（０１自ＦｏｙｅｒｅｌａＬ ２００１ｂ）ＧＳＨ是由定位在细胞质和叶绿体中的ｖ一备鲺酰氪半胱氯酸合成酶（ｙ－ＥＣＳ）和符胱苷肚合成酶（ＧＳａｓｅ）的”构体催化合成的。研究裘蜊 并非所有的植物细胞具有相同的ＧＳＨ台成容最．因此需要本地和系统 （整株）转运ＧＳＨ。做为一种抗氧化荆．还原型ＧＳＨ会被氧化为氧化 型ＧＳＨ（ＧＳＳＧ）．但是在ＧＳＨ库中贮存的主要是还原璀的ＧＳＨ．这可 能是由于在细胞质、线粒体和叶绿体中部有ＧＳＨ还原酶（ＧＲ）存在的原冈。虽然植物中ＧＳＨ降解厘结合反应还未完金阐明，但有三种可能的途径：１）在液泡ＣＰａｓｅ作用下去处ＧＳＨ或ＧＳ．Ｘ上的Ｇｌｙ；２）＿ｒｑＳＴｍｅ 催化的转肚反应，将ＧＳＨ上的Ｇｌｕ转移到其他＿肽上参加谷氨酰氨循环（浚逢衽还未在植物中发现）；３））＿ｒ－ＧＴａｓｅ催化的转肚反应的产物Ｃｙｓ?Ｇｌｙ在ＤＰａｓｅ催化下分解进入氪基酸代谢。不同细胞、不同组织中ＧＳＨ浓度是ＧＳＨ合成、降解、使用和转运问平衡 的结果。不同细胞器间ＧＳＨ浓度和氧化还原态的差异可能在信号转导中起关键６第一章文献综述作用。早在２０世纪７０年代，研究者就知道菠菜叶绿体中的ＧＳＨ浓度很高，而且光合自养烟草可以比异养的更快往培养基中转运ＧＳＨ（Ｎｏｃｔｏｒｅｔａ／．２００２），后来的研究证实ＧＳＨ在叶肉细胞叶绿体和细胞质中合成后转运到韧皮部中（Ｈｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｔａ１．２０００）。最近免疫细胞化学研究揭示，拟南芥Ｙ．ＥＣＳ蛋白定位在叶绿体中，而ＧＳａｓｅ蛋白在叶绿体和细胞质中都有分布（Ｗａｃｈｔｅｒ ｅｔ ａ１．２００５）， 因此ＧＳＨ的合成是在不同的细胞器见完成的，这可能为细胞内氧化还原信号转导提供了一个平台。植物和动物降解ＧＳＨ、ＧＳ．Ｘ的途径可能不一样。在动物细胞中，ＧＳＨ和 ＧＳ．Ｘ的降解是由ｙ．谷氨酰氨转肽酶（Ｙ．ＧＰａｓｅ）催化完成的。这个酶可以催化 ＧＳＨ、ＧＳ．Ｘ和ＧＳＳＧ Ｎ端氨基键水解，并把水解下来的谷氨酸残基转到新的受体分子，如其他氨基酸上（见图１．１）。而半胱氨酸和甘氨酸二肽接着会被细胞外二肽酶水解。虽然有报道证实植物细胞膜表面有二肽酶存在，但是迄今为 止该降解过程在植物细胞中还没有直接证据。植物中存在一种液泡羧基肽酶可 以将ＧＳＨ或ＧＳ―Ｘ上的Ｇｌｙ去掉，开始ＧＳＨ和ＧＳ―Ｘ降解的第一步（Ｗｏｌｆｅｔ １９９６）。 ＧＳＨ在不同的细胞器中合成、降解，有效的转运系统是必需的，是维持细 胞内高还原势和氧化还原平衡缓冲液的必要条件。 ３）ＧＳＨ稳态（Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）：浓度与氧化还原态（ｒｅｄｏｘ ｓｔａｔｅ）／氧化还原 稳态（ｒｅｄｏｘ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）的关系 动物细胞内有严格的稳态（Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）概念，但在植物细胞不能完全与 外界多变的环境隔绝，因此相对动物细胞而言植物细胞的稳态更有弹性和冗余。 ＧＳＨ库有两个明显的特征：即ＧＳＨ浓度和氧化还原态。植物叶中ＧＳＨ浓度有ａ／．季节、日波动，受植物营养、特别是硫的可用性影响很大。早期的证据表明，韧皮部硫与ＧＳＨ的比例是调节ＧＳＨ稳态的关键。ＧＳＨ在叶片中合成以后被转 运到韧皮部并对根中硫吸收产生调节（Ｈｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｔａ１．２０００）。相对于ＧＳＨ浓度而言，ＧＳＨ库的氧化还原态的稳态作为维持细胞内氧化还原平衡的一部分，受 到更严格的控制。至少在叶片细胞中，除了受到相对持续的胁迫使得叶细胞 ＧＳＨ库还原态下降超过９０％外，ＧＳＨ氧化还原态是明显不变的。高还原ＧＳＨ 库的中心地位对光合代谢非常重要，以致细胞可以感受到高还原态的变化而启 动适应性变化的基因表达。植物细胞为了维持细胞质内的高还原巯基，需要浓度达到ｍＭ数量级的ＧＳＨ库，因此ＧＳＨ浓度是维持ＧＳＨ库的氧化还原态的７郭江波博士论文：利用多基因转化技术获取重金属超富集植物的研究前提。植物细胞中其他的抗氧化物质，如抗坏血酸，维生素Ｅ等在维持细胞氧化还原稳态中起着非常重要的作用（Ｆｏｙｅｒ ４）ＧＳＨ与信号转导 ＧＳＨ／ＧＳＳＧ在指示细胞内巯基平衡、对细胞代谢和基因表达产生影响的作 用研究的比较透彻。ＧＳＨ／ＧＳＳＧ调节基因表达的作用可能是别的还原性化合物 不能替代的，或是已报道的影响可能反映的是细胞氧化还原态变化的共同特征， 而这些影响在真核和原核生物中都可以调节基因的表达。ＧＳＨ库是植物细胞一 个重要的氧化还原组件，内源ＧＳＨ变化可以对细胞产生重要的后果：例如外源 施加ＧＳＨ可以改变烟草和松树细胞内细胞质Ｃｕ、Ｚｎ超氧化物歧化酶（ＳＯＤ） （Ｈｅｒｏｕａｒｔ ｅｔ以１９９３）和ＧＲ的基因表达（Ｗｉｎｇｓｌｅｅｔ ｅｔａ１．２００５）。ａ／．１９９６）。ＧＲ基因可能有一ｅｔ个结合ＧＳＳＧ的位点，ＧＳＳＧ可以调控ＧＲ基因的表达（Ｃｒｅｉｓｓｅｎａ１．１９９２）。ＧＳＳＧ还是参与细胞内蛋白巯基化的重要物质。巯基化可能是植物种子发育过 程中一个重要的现象。干种子比其他的组织含有更高浓度的氧化型ＧＳＨ（Ｂｕｔｔａ１．１９９１；Ｔｏｍｍａｓｉｅｔ ｅｔａ１．２００１）。干种子中蛋白的巯基化有三个功能：１）如果蛋白关键的Ｃｙｓ残基被氧化，这个蛋白就会被降解，而巯基化可以保护ＧＳＨ和蛋 白被降解；２）可以通过与蛋白的Ｃｙｓ残基相互作用影响蛋白的功能；３）可能与 细胞分裂静止期Ｇｏ的信号转导有关。 ＧＳＨ还参与植物细胞分裂的调控（Ｍａｙ ｅｔ ａ１．１９９８ａ），是细胞进入Ｇｌ期的必 要条件。Ｇ１期是细胞周期的有丝分裂前期，在这一时期细胞能够感知外界刺激， 从而决定细胞是进入Ｓ期还是进入休止期，也就是细胞是参与分化还是进入程序化死亡。５）ＧＳＨ与重金属胁迫 植物细胞中区隔化重金属离子的主要途径与富含半胱氨酸的小肽即植物络 合素（ＰＣｓ）的形成有关。在生物细胞中ＰＣｓ合成的前体是ＧＳＨ（Ｇｒｉｌｌ ｅｔ ａ１．１９８９）。Ｃｄ２＋胁迫可以诱导培养的细胞和植物根中的ＧＳＨ耗竭（ＲａｕｓｅｒＶｏｓ ｅｔ ａ１．１９９２；Ｒｕｅｇｓｅｇｇｅｒ ｅｔｅｔ ａ１．１９９１；Ｄｅａ１．１９９２），而且在培养基中添加能特异抑止ｙ―ＥＣＳ酶活性的抑止剂ＢＳＯ（ｂｕｔｈｉｏｎｉｎｅ ｓｕｌｐｈｏｘｉｍｉｎｅ），可以抑止细胞中ＰＣｓ合成（Ｇｒｉｌｌ ｅｔａｌ．１９８７）。在培养的番茄细胞中提高Ｙ．ＥＣＳ酶活性可以相应的提高对Ｃｄ２＋的 抗性（Ｃｈｅｎｅｔａ１．１９９４），反之就降低植物细胞对Ｃｄ２＋的抗性（Ｘｉａｎｇｅｔａ１．２００１）。１．２．１．２植物络合素（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｌａｔｉｎｓ，ＰＣｓ）８第一章文献综述１）植物络合素的结构及功能 植物络合素通常由三种氨基酸组成：Ｇｌｕ，Ｃｙｓ，Ｇｌｙ。其一级结构通常是 由重复的Ｙ．Ｇｌｕ．Ｃｙｓ结构加上一个末端的Ｇｌｙ组成：（Ｙ．Ｇｌｕ．Ｃｙｓ）ｎ－Ｇｌｙ，ｎ一般介于２到５，最高可达到１１。ＰＣｓ最早在蛇根木中发现（Ｇｒｉｌｌ １９８７），随后在 多种植物与微生物中发现，而且，在一些高等植物中，除了以Ｇｌｙ为Ｃ．末端氨 基酸的ＰＣｓ分子之外，还存在以其它氨基酸为Ｃ．末端氨基酸的ＰＣｓ分子如（Ｙ ．Ｇｌｕ－Ｃｙｓ）ｎ．１３．Ａｌａ（同型植物络合素，ｈｏｍｏ－ＰＣｓ）、（Ｙ．Ｇｌｕ－Ｃｙｓ）ｎ－Ｇｌｎ（异植物络合素，ｉｓｏ．Ｐｈｙｏｔｃｈｅｌａｔｉｎｓ）、（Ｙ．Ｇｌｕ―Ｃｙｓ）ｎ．Ｓｅｒ（羟甲基植物络合素， ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ．ＰＣｓ），这些变异的植物络合素的合成、分布及其生理功能目前还 不清楚。植物中还产生一类Ｃ．末端缺失Ｇｌｙ的络合素（ｄｅｓＧｌｙ．ＰＣｓ）以及在Ｎ 一末端缺失Ｙ―Ｇｌｕ的ＰＣｓ，分别命名为ＰＣｓ―Ｙ―Ｇｌｕ和ｄｅｓＧｌｙ．ＰＣｓ．Ｙ―Ｇｌｕ。 但是目前对这些非正常植物络合素的产生途径还不了解（见表１．１）。 植物络合素可以在含有痕量必需金属元素的培养基上生长的植物组织和细 胞中检测到，而且观察到培养细胞中的植物络合素水平升高与培养基中Ｃｕ２＋和 Ｚｎ２＋的消耗有关，因此推测植物络合素与细胞内必需的金属离子的稳态 （Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）有关（Ｒａｕｓｅｒ１９９５；ＣｏｂｂｅＲ ２０００ａ；Ｃｏｂｂｅｔｔ２０００ｂ）。维持离子稳态的前提之一是Ｙ．Ｇｌｕ．Ｃｙｓ肽把结合的离子交给需要该离子的脱辅基的酶，例 如脱辅基的碳酸酐酶在获得Ｚｎ．【（Ｙ．Ｇｌｕ―Ｃｙｓ２）．Ｇｌｙ］复合物提供的Ｚｎ２＋后可以 重新表现活性，而且ｎ＝２的ＰＣｓ的效果明显高于ｎ＝１的复合物。Ｙ．Ｇｌｕ．Ｃｙｓ 肽在维持离子稳态中的另一个作用是保护某些对金属敏感的酶，例如Ｃｄ２＋与 ＰＣｓ形成复合物后对Ｒｕｂｉｓｃｏ酶、硝酸还原酶、乙醇脱氢酶、３一磷酸甘油醛脱氢酶的抑制效果比Ｃｄ２＋单独作用低了１０＂～１０００倍。但是也有证据表明，在维持细胞内离子稳态中起作用的不仅仅是ＰＣｓ，可能还有其他的蛋白起作用。例 如拟南芥突变体ｃａｄｌ．３细胞中没有检测到ＰＣｓ，但是该突变体在有微量必需元 素的培养基上依然生长良好。根据现有的研究结果推断，植物络合素最重要的作用是在植物细胞内与重 金属结合解毒并将其转移到液泡中隔离，即参与植物络合化与区隔化作用。Ｃｄ２ ＋是ＰＣｓ的一个有效的诱导剂，而且Ｃｄ２＋常常被作物吸收对人类健康产生不良 的影响，所以Ｃｄ２＋与ＰＣｓ的复合物的研究引起了研究人员的关注。体外实验发 现，Ｃｄ２＋可以与植物络合素结合形成两种复合物：低分子复合物（ＬＭＷ）和高分子复合物（ＨＭＷ）（Ｇｒｉｌｌｅｔａ／．１９８７）。ＰＣｓ中的Ｃｙｓ巯基可与胞内的Ｃｄ计形９郭江波博士论文：利用多基因转化技术获取重金属超富集植物的研究成配位键，进而形成ＰＣｓ．Ｃｄ复合物，相对于游离的Ｃｄ２＋而言，此复合物对细 胞的毒性已大为降低，但是植物还进一步采取了液泡区域化作用以隔离重金属。就目前所知，胞内Ｃｄ２＋被解毒、隔离的过程主要包括了低分子量复合物Ｃｄ２＋＿ＰＣｓ 跨液泡膜转运、Ｓ２’在液泡中积累以及高分子量复合物Ｃｄ２＋＿ＰＣｓ的形成等主要环节。表１．Ｉ六类已报道的植物络合素（引自Ｔｏｍａｓｚｃｗｓｋａ ２００２）第一个令人信服的证明ＰＣｓ在植物对重金属抗性机制中的解毒作用的实验 是Ｓｔｅｆｆｅｎｓ等人利用番茄细胞完成的（Ｓｔｅｆｆｅｎｓ ｅｔ ａ１．１９８６）。把在Ｃｄ２＋致死浓度上 筛选的可以持续生长的番茄转栽到有ＢＳＯ的培养基中，这些株系又恢复了对Ｃｄ２＋的敏感。１９９５年，Ｒｏｓｓ Ｈｏｗｄｅｎ等人的实验结果有力的证明了ＰＣｓ在植物对重金属抗性机制中的作用。他们分离了对Ｃｄ敏感的拟南芥突变体ｃａｄ－１及相 应的等位突变体系列，这些突变体都不同程度地表现对Ｃｄ的敏感，而且都不能合成Ｃｄ－ＰＣ复合物。它们都丧失了ＰＣｓ的累积能力，并且对Ｃｄ的敏感程度与其体内ＰＣｓ的水平相关。与野生型相比，突变体中ＰＣｓ合成的底物ＧＳＨ水平并无明显差异，只是缺失了ＰＣｓ合酶（ｐｈｙｔｏｃｈｅｌａｔｉｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＰＣＳ）的活性 （Ｈｏｗｄｅｎｅｔ ａ１．１９９５ａ；Ｈｏｗｄｅｎｅｔ以１９９５ｂ）。可见，拟南芥对Ｃｄ的敏感是由于ＰＣｓ合成受阻而引起的。１０第一章文献综述在植物和酵母中，Ｃｄ―ＰＣ复合物被转运进液泡中隔离。最直接的证据是来自裂殖酵母镉敏感突变体ｈｍｔｌ的研究（Ｏｒｔｉｚｅｔａ１．１９９２）。ｈｍｔｌ突变体在Ｃｄ２＋胁迫下不能积累硫化物与Ｃｄ．ＰＣ形成的复合物，即高分子量复合物（ＨＭＷ）， 表现出对Ｃｄ２＋胁迫敏感。ＨＭＴｌ属于ＡＢＣ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ家族，是一个液泡膜转运蛋白，体外实验显示其在转运ＰＣｓ时依赖ＡＴＰ。Ｃｄ２＋只有与ＰＣｓ形成复合体一Ｉ，Ｍｗ后才被ＨＭＴｌ转运进液泡，而且ＨＭＴｌ在转运ＰＣｓ和Ｃｄ．ＰＣ时不依赖液泡膜旷．ＡＴＰａｓｅ提供的质子梯度（Ｏｒｔｉｚ ｅｔ ａ１．１９９２）。ｈｍｔｌ突变体在Ｃｄ２＋胁迫下不能把Ｃｄ－ＰＣ转运到液泡中，将ＨＭＴｌ转入酵母突变株中可以看到明显得互补作用。植物中也发现Ｃｄ２＋处理后有ＰＣｓ积累，并被转运到液泡中（Ｖｏｇｅｌｉ．Ｌａｎｇｅｅｔａ１．１９９０），而且从燕麦根中鉴定出一种不依赖液泡膜ｉ－ｉ＋．ＡＴＰａｓｅ提供的质子梯度、但需要ＡＴＰ提供能量、能够转运ＰＣｓ和Ｃｄ－ＰＣ到液泡中、类似酵母ＨＭＴｌ的蛋ｌ刍（ＳａｌｔＡＢＣ．Ｔｙｐｅｅｔａ１．１９９５）。在酿酒酵母＆ｃｅｒｅｒｖｉｓｉａｅ中也发现了Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ，称为ＹＣＦｌ，它可介导Ｃｄ与ＧＳＨ形成的复合物的跨液ｅｔ泡膜转运（Ｌｉａ１．１９９７）。Ｃｄ２＋与ＰＣ在液泡外结合形成ＬＭＷ后被ＨＭＴｌ转运进液泡，亦可由液泡膜上的Ｃｄ２＋／矿反向转运体介导进入液泡中，以维持ＨＭＷ中Ｃｄ２＋与ＰＣｓ的比例。经过不同途径进入液泡中的ＬＭＷ及Ｃｄ２＋与液泡内的酸不稳定的硫化物结 合形成ＨＭＷ。ＬＭＷ的作用是胞质中的金属离子的载体，而ＨＭＷ是金属离 子的储存形式。在ＨＭＷ中的硫化物可以增加结合的Ｃｄ２＋数及复合物的稳定性。在液泡的酸性环境中，虽然Ｓ２。、Ｓ０３２－可稳定ＨＭＷ中的Ｃｄ２＋＿ＰＣｓ，但是 此复合物还是很可能发生降解。降解后游离出的Ｃｄ２＋可被液泡中含量丰富的有机酸如苹果酸、柠檬酸、草酸等所沉淀，而复合物中的多肽成分将被分解为氨 基酸，又可进入细胞质中，参与下一轮ＰＣｓ的合成或其它代谢过程。如此细胞则完成对Ｃｄ２＋的解毒过程（见图１．２）。除了Ｃｄ以外，ＰＣｓ对其他重金属如砷的解毒也有一定的作用。拟南芥的 ＰＣｓ合成的突变体对砷酸盐表现出敏感（Ｈａｅｔａ１．１９９９）。Ｓｃｈｍｏｇｅｒ证明砷酸盐与亚砷酸盐都可以诱导ＰＣｓ的生物合成，而且体外实验中，砷酸盐还可以提高 ＰＣｓ合酶的活性（Ｓｅｈｍｏｇｅｒｅｔａ１．２０００）。Ｊｅａｎｅｔｔｅ等的研究也表明砷酸盐能够诱导使绒毛草（Ｈｏｌｃｕｓ ｌａｎａｔｕｓ）根中的ＰＣｓ的含量增加；在相同的有效抑制根生长 的砷酸盐浓度处理下，绒毛草可耐受砷酸盐的抗性品种中的ＰＣｓ的含量比敏ｅｔ感品种中的ＰＣｓ的含量高１５＂－＇２０倍（Ｈａｒｔｌｅｙ．Ｗｈｉｔａｋｅｒａ１．２００１）。ＰＣｓ对其他韩江波博士论文：利用多基田转化技术获取重金属超富集植物的研究金属的解毒作用也有报道（Ｓｃｈａｔ“ａＬ１９９２；Ｄｅ Ｋｎｅｃｈｔ“ａＬ１９９４）。：‘夏≥．４ＩＩ廖：璁圈１．２植物和真菌中与ｃｄ脱毒有关的基因及其功能（引自Ｃｏｂｂｅｎ．２０００ａ，２０００ｂ．部分修改） ｏ与。分别表示正谓节和负调节。Ａｔ、Ｂｊ、Ｔａ分别袁示拟南芥．印度 芥菜、小麦。２）植物络合素的合成ＰＣｓ植物络台豢在结构上与ＧＳＨ（Ｙ―ＧｌｕＣｙｓＧｌｙ）有’定相似性。虽然也有 例外，但是很多生理生化和遗传学的研究都证明了ＧＳＨ是ＰＣ合成的底物。如 ＧＳＨ缺陷的酵母与拟南芥突变体均表现为ＰＣｓ缺失并对镉敏感。１９８８年Ｇｒｉｌｌ 等首先从麦瓶草（Ｓｉｌｅｎｅ ｃｕｃｕｂａｌｕｓ）的细胞培养物中发现了一种酶，在体外特定的 反应系统中它可利用ＧＳＨ先合成ＰＣｓ。这种将ＧＳＨ的半分子７－Ｇｔｕ－Ｃｙｓ转移 到另一个ＧＳＨ分子上的酶被命名为十谷氨酰半胱氨酸二肽转肽酶。简称为ＰＣｓ 合酶（ＰＣＳ）（ＥＣ．２３２．１５）（Ｇｒｉｌｌ ｅ／ａ／．１９８９）。酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｂｉａｅ）中是由两个液泡膜蛋白行使ＰＣｓ台酶的功能（Ｗｔｍｓｃｈｍａｎｎ ｅｔａ／．２００７）。ＰＣＳ是催化ＰＣｓ合成的关键酶凌瓶草中的ＰＣｓ合酶分子量为ＭＷ－－９５ＫＤａ，等电点ｐｌ＝２ ７：被ｃｄ２＋激活的ＰＣｓ合酶呈２５ ＫＤａ亚单位二聚体或四聚体形式， 可在较宽的温度范围内保持活性，最适反应温度为３５＂Ｃ，犀适ｐＨ值为７．９；它 催化的反应式为： （７－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ）Ｄ．Ｇｌｙ＋（｜ｒ－Ｇｌｕ―ｃｙｓ）ｒＧｌｙ叶（Ｔ―ＧＩｕ－Ｃｙｓ）一ｒＧｌｙ＋（７－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ）｜卜ｌ－Ｇｌｙ第一章文献综述其中，７－Ｇｌｕ．Ｃｙｓ由ＧＳＨ提供（对ＧＳＨ，Ｋｍ＝６．７ ｍＭ），当胞内ＧＳＨ缺乏时，ＰＣｓ如（丫．Ｇｌｕ．Ｃｙｓ）２一Ｇｌｙ亦可提供该半分子，作为供体以合成更长链的 ＰＣｓ。此酶只有在金属离子存在的条件下才表现活性。在体外实验中，金属离子与ＰＣｓ络合的活性依次为：Ｃｄ２＋＞ｐｂ２＋＞Ｚｎ２＋＞Ｓｂ３＋＞Ａｇ＋＞Ｈ９２十＞Ａｓ５－＞ Ｃｕ＋＞ｓｎ２＋＞Ａｕ３＋＞Ｂｉ３＋。而其它一些离子，如Ｎａ＋，Ｋ＋，Ｃａ２＋，Ｍｇ＋，Ｆｅ”，Ａ１３＋ 没有激活作用（Ｚｅｎｋ １９９６）。 ３）重金属离子在ＰＣｓ合酶催化过程中的作用 基于ＰＣｓ的合成被一些重金属离子激活以及ＰＣｓ合酶本身也是一种重金属结合蛋白，早期模型假设重金属直接作用于ＰＣｓ合酶来提高酶的活力，但这样同样产生一个问题：为什么该酶可以被如此广泛的重金属所活化。虽然ＡｔＰＣＳ 与Ｃｄ有很高的亲和力（Ｋｄ＝０．５４±Ｏ．２０ｕＭ）和结合力（化学计量比为７．０９±０．９４），但对于另一种同样能提高酶活的重金属铜，它的亲和力则低很多。Ｖａｔａｍａｎｉｕｋ提出重金属不是直接与酶结合，而是作为底物配基（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｌｉｇａｎｄ） 参与了双底物酶取代的转肽反应（ｂｉｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｅｎｚｙｍｅ．ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｔｉｏｎｒｅａｃｔｉｏｎ），该反应中ＧＳＨ和其相应的重金属硫醇作为双底物分别与ＡｔＰＣＳ的 两个位点发生酰基化反应（Ｖａｔａｍａｎｉｕｋｅｔａ１．２００４）。第一个酰基化位点为Ｃｙｓ５６，ＧＳＨ对Ｃｙｓ５６的巯基进行亲电攻击，产生硫酯化中间产物，这一反应过程与金 属离子无关。只在Ｃｙｓ５６位点发生酰基化的ＡｔＰＣＳ的活力很低或者没有活力。 而第二个酰基化位点目前尚不清楚，已排除Ｎ端的Ｓｅｒ和Ｃｙｓ的可能性，推测 可能为一个能够与ＧＳＨ形成氧酯键的氨基酸。Ｃｄ与ＧＳＨ形成的复合物参与 ＡｔＰＣＳ的第二个酰基化位点的反应。由于Ｃｄ的结合，促进了ＡｔＰＣＳ对ＧＳＨ的 Ｇｌｙ的解离速率。因此ＣｄＧＳ２对第二个酰基化位点的亲和力要高于ＧＳＨ对第 一个酰基化位点的亲和力。ＡｔＰＣＳ的两个位点都酰基化后才能具有较高的合酶的活性。二肽转移反应不需要额外的ＡＴＰ，ＧＳＨ与ＣｄＧＳ２的Ｇｌｙ的解离所产生 的能量被保留在酰基化的ＡｔＰＣＳ反应过渡产物中，由于两个酰基化位点位置较 近，ＡｔＰＣＳ得以利用中间产物所保留的能量合成新的肽键，从而完成一个循环 的反应。因此，重金属在酶的活化过程中作为一个整合部分而起作用。任何一 种可以与ＧＳＨ结合成谷光甘肽．重金属复合物的重金属都可以活化ＰＣ的生物合成。Ｒｕｏｔｏｌｏ等人的研究进一步表明拟南芥ＰＣｓ合酶的催化活性中心位于３７２个氨基酸以前的Ｎ端部分（Ｒｕｏｔｏｌｏｅｔａ１．２００４）。Ｎ端不但保守而且稳定，可耐１３郭江波博士论文：利用多基因转化技术获取重金属超富集植物的研究受Ｖ８蛋白酶的消化，Ｃ端３７３－４８５个氨基酸部分则不稳定，但它决定了ＰＣｓ 合酶跟何种重金属离子结合。Ｍａｉｅｒ对保守区的半胱氨酸和谷氨酸残基做了点突变研究之后，同样支持催化中心在Ｎ端的说法，而且指出对酶活性最为重要的是Ｎ端的半胱氨酸残基，Ｃ端可能在结合金属或ＣｄＧＳ２启动时起探测作用 （Ｍａｉｅｒｅｔａ１．２００３）。Ｍａｔｓｕｍｏｔｏｆ发现ＡｔＰＣｓ合酶Ｃ端３５８到３６６与金属硫蛋白和硫氧还蛋白的基序有相似的排列方式，将Ｃ端Ｃｙｓ用Ａｌａ取代后发现，虽然突变的ＰＣＳ可以继续合成ＰＣｓ，但是比对照的效率低，因此推断ＰＣｓ合酶的Ｃ 端可能调节ＰＣｓ的合成速率（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏｆｅｔ ａ１．２００４）。植物中的ＧＳＨ与生物异源物质（Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃｓ）（除草剂、氯化物等）结合 是植物解毒的一条重要途径，这一步ＧＳ轭合反应还与植物内源物质ｒ如生长素、 花色素苷、固醇等）的代谢、转运和储藏有关。就其解毒功能而言，这些被生物 转化的生物异源物质的最终命运是被排出或胞内区隔化，在这之前，它们首先要被代谢，植物中的ＧＳ一生物异源物质代谢的第一步反应是从ＧＳＨ的羧基端 Ｇｌｙ的去除开始，产生Ｓ－ＥＣ．衍生物。最近发现（Ｂｅｃｋｅｔａ／．２００３），植物络合素合酶具有催化这一步反应的多肽酶的活性。这暗示了ＰＣｓ合酶在植物解毒过程 中具有更重要的作用。 ４）ＰＣｓ合酶基因的发现与结构 虽然在１９８９年已分离到部分纯化的ＰＣｓ合酶蛋Ｉ兰ｌ（Ｇｒｉｌｌｅｔａ１．１９８９），但是直到１９９９年，ＰＣｓ合酶基因才被三个独立的研究小组从拟南芥，酵母和小麦中分离得至ｌＪ（Ｃｌｅｍｅｎｓｅｌ ａ１．１９９９；Ｈａ ｅｔ ａ１．１９９９；Ｖａｔａｍａｎｉｕｋ ｅｔａ／．１９９９）。其中，Ｖａｔａｍａｎｉｕｋ和Ｃｌｅｍｅｎｓ的研究小组分别利用拟南芥和小麦的ｃＤＮＡ表达文库来筛选镉抗性基因并得到ＡｔＰＣＳｌ与ＴａＰＣＳｌ；而Ｈａ则利用拟南芥ｃａｄｌ基因缺矢的突变体筛选得到ＡｔＰＣＳｌ基因。拟南芥ＡｔＰＣＳｌ基因编码一个５５ ＫＤ的多肽，含４８５个氨基酸残基。氨基酸同源序列比较显示ＡｔＰＣＳ与裂殖酵母ＰＣｓ合酶（ＳｐＰＣＳ）的Ｎ端具有较高的同源性（４５％），而Ｃ端具有较低的同源性。Ｃ端结构域最明显的特征是半胱氨酸的重复出现，而且经常紧密成对或相邻成对出现。拟南芥和酵母的Ｃ端分别由１０个和７个半胱氨酸，其中的４个与６个是 以相邻成对的形式出现的。然而，这些半胱氨酸并没有明显的位置保守性。小 麦中ＴａＰＣＳ与拟南芥ＡｔＰＣＳ全序列同源性有５５％，其中ＴａＰＣＳ有１４个Ｃｙｓ， 在Ｃ一端结构域有２个Ｃｙｓ残基对。裂殖酵母和粘液菌（ＤｉＯｒｕｏｓｔｅＢｕｍｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）的ＰＣｓ合酶Ｎ端还有端延伸的序列，同样含有Ｃｙｓ簇，这些Ｃｙｓ残基可以具有１４第一章文献综述与Ｃ端的Ｃｙｓ残基相似的功能。图１．３给出了最初得到的四种ＰＣｓ合酶的氨基酸序列比较图。由此得到的初步结果认为，Ｎ．端氨基酸序列中有５个Ｃｙｓ和１个Ｈｉｓ是保守的，据推测ＰＣｓ合酶的活性中心即位于此结构域中。 目前已从多种生物体内特别是一些重金属抗性和超富集植物中克隆了不同的ＰＣｓ合酶基因，包括酿酒酵母（Ｗｕｎｓｃｈｍａｎｎｅｔａ１．２００７）和本实验克隆的大蒜（Ａｌｌｉｕｍ Ｓａｔｉｖｕｍ Ｌ．）的ＰＣｓ合酶基因。最近的实验结果表明，拟南芥的ＡｔＰＣＳ的 第Ｃｙｓ５６对酶的Ｙ―Ｇｌｕ－Ｃｙｓ酰基化有直接或重要作用，其它的四个Ｃｙｓ的突变 不影响ＡｔＰＣＳ的活性（Ｖａｔａｍａｎｉｕｋｅｔａ１．２００４）。翻翻拳薯Ｔａ［互】丑丁［二Ⅱ［互疆￡通二团湖Ａｔｌｌ。。．．。。皇！皇。．囊ｔ一一．．―．．．。．。。。．．．．．．圭．．．．．．。．．。．．．．――．．～。ｌ！ｌ！ｌ。江．．．．。．．ｉ列ｌｌｌｌ Ｉ稽蓼ｓｐｉ钠匠工至疆＝二丁口夏匦匝］别 ＶＡＲＩＡＢＬ鑫Ｃ－ＴＥ蝴Ｌｉ∞瞒￡辩ｖ襄Ｄ Ｎ－狂ｎＷＮＡｑ ＇■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■’■－■ｏ■－■＿■■■＿■■■■■■＿●■■一图１．３四种不同物种的ＰＣｓ合成酶氨基酸序列比较的模式图（引自Ｃｏｂｂｅａ ｅｔｌｌｌｉ ｌ叫Ｉ ｌｌｌｌ翻４１４ａ１．２００２）。ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＦｌ３５１５５ ａｎｄＡｔ，拟南芥（ＣＡＤＩ／ＡｔＰＣＳ Ｉ：ＧｅｎＢａｎｋＡＦ０８５２３０）；Ｔａ，小麦（ＴａＰＣＳ，；ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＦ０９３２５２）；Ｓｐ，裂殖酵 母（ＳｐＰＣＳ；ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．Ｚ６８１４４）；Ｃｅ，线虫（ＣｅＰＣＳ，；ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎＯ．Ｚ６６５１３）。全序列的氨基酸数目列于右侧，半胱氨酸残基的位置以竖线表 示。拟南芥ｃａｄｌ的等位突变体ｃａｄｌ―５属于无义突变，其在Ｎ一端保守区域的下 游翻译提前终止，从而产生一个截短了的多肽（缺少Ｃ一端１０个Ｃｙｓ中的９个），但是，此突变的ＰＣｓ合酶活性并未受很大影响，在Ｃｄ存在时仍表现其催化作用。由此可见，Ｃ．端序列对于ＰＣｓ合酶活性不是必需的。由于Ｖａｔａｍａｎｉｕｋ证明 了重金属如Ｃｄ增强了ＰＣｓ合酶的合成主要原因是成为酶促反应的底物ＧＳＨ．Ｃｄ，因此Ｃ端半胱氨酸残基的主要作用是通过结合重金属．ＧＳＨ复合物并将它们带 入催化中心来提高酶的催化活性。５）ＰＣｓ合酶基因的表达调控 拟南芥中ＰＣＳ基因有两个拷贝，通过ＲＴ－ＰＣＲ方法对拟南芥的两个ＰＣＳ基１５郭江波博士论文：利用多基因转化技术获取重金属超富集植物的研究因的表达进行了分析（Ｃａｚａｌｅｅｔａ／．２００１），ＡｔＰＣＳｌ和ＡｔＰＣＳ２在地上部分和地下部分的转录有明显差别，根中的转录量大于叶中。在根中ＡｔＰＣＳｌ／ＡｔＰＣＳ２大概 是０．５，而在叶中则大于２０。ＡｔＰＣＳＪ在拟南芥叶和幼苗中的表达水平远高于ＡｔＰＣＳ２。用不同重金属处理转基因的酿酒酵母和裂殖酵母ＰＣＳ缺陷型发现， ＡｔＰＣＳＩ和ＡｔＰＣＳ２都可以互补酵母突变，对镉和砷处理产生抗性。但是在裂殖 酵母中Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｎｉ２＋处理后，没有检测到ＰＣｓ的积累，而且Ｃｕ２＋只对ＡｔＰＣＳｌ 有诱导表达的作用，对ＡｔＰＣＳ２则没有明显得诱导。对表达彳垆ＣＳ２的酿酒酵母 用不同重金属处理后，没有发现Ｚｎ２＋、Ｓｂ２＋、Ｃｕ２＋、Ｎｉ２＋诱导产生可检测到的 的表达产物。Ｌｅｅ对ＡｔＰＣＳｌ的启动子分析表明，在拟南芥幼苗发育的早期， ＡｔＰＣＳｌ受Ｃｄ诱导，随着时间的延长，它的表达趋于稳定，不再受Ｃｄ的诱导 （Ｌｅｅｅｔａ１．２００２）。而在小麦根中和胡萝卜悬浮培养细胞中ＰＣＳ基因的ｍＲＮＡ都受Ｃｄ２＋的诱导（ＤｉＴｏｐｐｉ ｅｔ ａ１．１９９８；Ｃｌｅｍｅｎｓ ｅｔａ１．１９９９），在小麦根中ＴａＰＣＳｌ的ｍＲＮＡ水平会因Ｃｄ２＋的处理而上升，印度芥菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ］ｕｎｃｅａ）叶子中的ＰＣＳ基因也受 Ｃｄ＋的诱－导（Ｈｅｉｓｓｅｔａ１．２００３）。ＰＣＳ基因表达可能也存在组织特异性，番茄的根ｅｔ ａ１．和茎中可检测到ＰＣ合酶的活性，而在叶片和果实中没有检测至Ｕ（Ｃｈｅｎ１９９７）。在大蒜中，原位杂交结果显示ＰＣ合酶基因ＡｓＰＣＳ的表达主要集中在根 的表皮与韧皮部（姜瑛楠２００３）。这说明，ＰＣｓ合酶的基因表达受重金属离子的 诱导，而且与植物的发育阶段和组织部位相关。最近的研究表明：在Ｙ射线照射下，大麦幼苗中植物络合素的合成增加了 （Ｄａｎｉｌｉｎｅｔａｌ．２００４），这说明植物络合素合酶基因除了受重金属的诱导之外，还可能受到射线的诱导。 ＪＡ作为一种重要的植物激素，可以与细胞内有ｂＺＩＰ结构的转录因子协作调节植物的基因表达，对机械刺激、干旱、伤口、紫外线伤害等产生应答。但是从现有的实验结果看，没有直接的证据证明ＪＡ在重金属信号转导中起作用， 虽然有实验发现用ＪＡ处理植物可以模拟重金属胁迫（Ｘｉａｎｇｅｔａ１．１９９８），但已有的对ＰＣＳ的结构分析推断，虽然ＰＣＳ有亮氨酸的重复结构，但是没有直接证据证明它有类似ｂＺＩＰ的功能。因此，有可能重金属胁迫的信号通路与ＪＡ不一样。ＪＡ可以调节ＧＳＨ的合成，可能间接影响ＰＣｓ的表达（图１．２）。１６第一章文献综述１．２．２植物抗氧化酶系现在有足够的证据表明，过量的重金属如Ｆｅ”，ｃｕ＋，Ｃｄ２＋可以对细胞产生 过氧化毒害（ＤｅＳｃｈｒｏｄｅｒ ｅｔ Ｖｏｓ ｅｔ ａ１．１ ９９２；Ｍａｌｅｃｋａ ｅｔ ａ１．２００１；Ｂｏｏｍｉｎａｔｈａｎ ｅｔ ａ／．２００３ａ；ｅｔ ａ１．２００５；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａ／．ａ／．２００３；Ｍｉｔｈｏｆｅｒ ｅｔ ａ１．２００４；Ｂａｎｊｅｒｄｋｉｊｅｔ２００６；Ｍａｋｓｙｍｉｅｃａ１．２００７）。过渡金属如Ｆｅ和Ｃｕ可以诱发细胞内的自氧化和Ｆｅｎｔｏｎ反应可以使抗氧化酶系中的很多酶失活，例如，０２’可以直接抑止过氧化氢酶（ＣＡＴ）的活性（Ｋｏｎｏ （Ｃａｓａｎｏｅｔ ｅｔ ａ１．１ ９８２），ＨＯ‘可以将Ｃｕ．Ｚｎ超氧化物歧化酶片段化ａ１．１９９７）。最近Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ等研究铜诱导的氧化胁迫下一种软水草细胞内抗氧化物和植物络合素的反应发现，只有在中等胁迫强度下，该植物细胞内ＳＯＤ、ＡＰＸ、ＧＰＸ、ＣＡＴ、ＧＲ的蛋白和酶能够被显著诱导（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａｅｔ ａ／．２００６）。其他的不能直接和细胞内氧代谢直接作用的重金属，如Ｃｄ、．Ｎｉ、Ｚｎ也 可以诱导植物细胞内产生氧化胁迫（ｄｅｌＲｉｏ ｅｔ ａ／．１９９２；＂ＣＬ，ｕｂａｅｔ口，．１多９４：Ｃｕｙｐｅｒｓ ｅｔ ａ１．１ ９９９；Ｓｃｈｕｔｚｅｎｄｕｂｅｌ ｅｔ ａ１．２００ １；Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａ１．２００４；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａ１． ２００５；Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａ１．２００６；Ｔｓａｎｇａｆｉｓ ｅｔａ１．２００７），但是应答反应的趋势依赖与被分析植物种类和组织器官，以及处理用的重金属和作用强度。一般说来，这些重 金属都会在一开始诱导植物出现严重的ＧＳＨ耗竭（ＳｃｈｕｔｚｅｎｄｕｂｅｌＯｒｔｅｇａ．Ｖｉｌｌａｓａｎｔｅ ｅｔ ａ１．２００５；Ｈｅｒｂｅｔｔｅ ｅｔｅｔ ａ１．２００２；ａ１．２００６）。ＧＳＨ是维持细胞内氧化还原平衡的重要组成成分之一，而且还与细胞周期调控、氧化物脱毒、还原硫的转 运相关，细胞内短期严重的ＧＳＨ耗竭可能会积累过量的活性氧，并干扰植物的 发育（Ｋｏｃｓｙｅｔａ１．２００１）。因此，植物抗氧化酶系可能在一定程度上能够应对重金属胁迫，但是当重金属浓度较高或作用时间较长以后，抗氧化酶系细胞质耐受作用就有限了。当植物根系在受到重金属胁迫时，可以发生明显的木质化过程，使得植物根尖生长点后移，诱发植物组织产生类似抗病反应的ＨＲ反应以阻断重金属向其他植物细胞迁移的路径（Ｓｃｈｕｔｚｅｎｄｕｂｅｌｅｔａ１．２００１），这可能暗示植物的抗氧化酶系的作用主要是在植物非质体途径，产生的超氧自由基引发植物细胞壁木质化程度增加可能是植物耐受重金属胁迫的一种应急方式（ＭｉｔｈｏｆｅｒＰｆａ／．２００４）。１．３提高植物耐受、积累重金属的遗传工程植物修复一般选择生物量大、生长快、能够耐受重金属胁迫、地上部分能１７郭江波博士论文：利用多基因转化技术获取重金属超富集植物的研究够积累高浓度的重金属及适口性低的植物来清除污染物。但是天然存在的可以耐受和超积累重金属的植物一般都生长缓慢，生物量低，难以直接用于环境中重金属污染的植物修复。解决此问题的有效途径是培育工程植物，将可耐受和超积累重金属生物的相关基因转移到那些生物量大、适生性强但不能自然积累重金属的目标植物中，再种植到被污染的环境中清除污染物（Ｇｉｓｂｅｒｔ ２００３）。 生物细胞内有许多基因与重金属吸收、络合、转运及区隔化相关。将这些 基因通过遗传工程手段转入目标植物，来提高目标植物耐受、积累重金属的能 力，是一个改良目标植物使之可用于植物修复的切实可行的策略（见表１．２）。ｅｔ ａＬ１．３．１提高植物合成重金属络合物的能力植物细胞内可以络合重金属离子的有机化合物很多，如苹果酸、草酸等，还有一些小肽类的化合物，如金属硫蛋白（ＭＴ）、ＧＳＨ、ＰＣｓ，也都可以络合 重金属离子。１９９４年，Ｐａｎ等将鼠源的ＭＴ－－Ｉ基因转入烟草中提高了转基因植物耐受Ｃｄ胁迫的能力（Ｐａｎ ｅｔａｌ．１９９４）。但是研究发现，在不同的启动子驱动下，ＭＴ转基因植物对同一重金属离子的敏感性不同（Ｉｖａｎ合酶启动子的功能。Ｓｔｅｆａｎｏｖ１９９７），例如核酮糖二磷酸羧化酶启动子会被高浓度的Ｃｄ抑制，而高浓度的Ｃｄ可以诱导甘露糖植物络合素做为一种重要的维持细胞内离子平衡的小肽，一直是研究者关 注的重点（Ｇｒｉｌｌｅｔ ａ１．１９８５；Ｇｒｉｌｌ ｅｔ ａ１．１９９１；Ｒａｕｓｅｒ １９９５；Ｒｅａ ｅｔａ１．２００４；Ｃｌｅｍｅｎｓ２００６；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａ１．２００６；Ｍａｋｓｙｍｉｅｃ ｅｔ ａＬ ２００７；Ｓｕｎ ｅｌａ１．２００７）。很多实验结果证实超表达植物络合素合酶（ＰＣＳ）基因可以提高植物耐受并积累重金属的能力，但是也有报道相反的结果（Ｌｅｅｅｔａ１．２００３）。分析超表达ＰＣＳ基因有时导致转基因植物对镉更敏感的原因，认为可能是内源ＧＳＨ的耗竭限制了ＰＣＳ合 成（Ｐｏｍｐｏｎｉ ｅｔａｌ．２００６）从而降低了植物对Ｃｄ的抗性。而且在不同的启动子驱动 下，转基因植物对相同的重金属的敏感性有较大的差另ｌＪ（Ｌｉｅｔ ａ１．２００４；Ｇａｓｉｃ ｅｔａ１．２００７）。因此有研究者将目光转向与ＰＣｓ合成相关途径基因的超表达研究。 考虑到ＰＣｓ合成前体是ＧＳＨ，研究人员将细菌来源的ＧＳＨ合成途径的关键酶基因ｙ－ＥＣＳ和ＧＳ分别在印度芥菜中超表达后提高了转基因植物耐受、积累重 金属Ｃｄ的能力（Ｚｈｕｅｔ ａ１．１９９９ａ；Ｚｈｕ ｅｔａ１．１９９９ｂ），而且提高ＧＳＨ的合成能力ｅｔ后可以增加遏兰菜吸收Ｎｉ和抗氧化胁迫的能力（Ｆｒｅｅｍａｎ１８ａ１．２００４）。最近有研第一章文献综述究者将硫代谢途径关键酶丝氨酸已酰转移酶（ＳＡＴ）基因、），－ｅｃｓ和ＰＣＳ同时 转入烟草中（Ｗａｗｒｚｙｎｓｋｉｅｔａ１．２００６），提高了转基因烟草积累Ｃｄ和合成巯基的能力。但是与对照野生型比较，只是在转基因植株根部能够积累比较多的Ｃｄ， 而地上部分的积累并未增加多少。为了使植物地上部分能够积累重金属，研究 者采用植物组织特异性表达的启动子驱动ＡｔＰＣＳｌ在拟南芥叶片中表达（Ｐｅｔｅｒｓｏｎｅｔ ａｔ２００６）。研究者将ＡｔＰＣＳＩ回复转入ＡｔＰＣＳｌ基因突变缺失的拟南芥突变体ｃａｄ中，发现可以在叶片中检测到ＰＣＳ蛋白的活性，而根中没有。但 是无论在野生型还是ｃａｄ突变体叶片中特异表达ＡｔＰＣＳｌ基因，都不能达到使 Ｃｄ只在地上部分积累的目的。Ｌｉ等将细菌来源的ｙ－ＥＣＳ在ｃａｄ突变体茎中特异表达后，虽然转基因植物的茎和根中都可以检测到ＥＣ和ＧＳＨ，但只能在茎中检测到ＥＣＳ蛋白活性，因此推测植物细胞内巯基小肽是通过韧皮部向下运输的（Ｌｉｅｔａ／．２００６）。同时有研究者证实ＰＣｓ和Ｃｄ可以通过木质部由根部地上运ｅｌ输（Ｇｏｎｇａ／．２００３），也可以通过韧皮部由茎向根部转运（Ｃｈｅｒｔｅｔａ／．２００６）。基于此，似乎利用植物组织特异性启动子驱动ＰＣＳ表达并不能达到使重金属离子 只在地上部分积累的效果。 将植物细胞中合成有机酸类和有络合能力的化合物的关键基因在目标植物 中超表达也是提高植物耐受、积累重金属的有效选择（ＢｏｏｍｉｎａｔｈａｎＩｎｇｌｅ ｅｌ ａ１．２００５；Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ｅｌ ａ／．２００３ｂ；ａ／．２００５）。１．３．２改变重金属转运相关蛋白的表达和作用方式植物中与重金属转运相关的蛋白主要是重金属ＡＴＰａｓｅ（ＨＭＡｓ）家族、 Ｎｒａｍｐｓ（ｎａｔｕｒａｌｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｍａｃｒｏｐｈａｇｅｐｒｏｔｅｉｎ）家族、ＣＤＦ（ｃａｔｉｏｎｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ，ｉｒｏｎｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）家族、ＺＩＰ（ｚｉｎｃ―ｒｅｇｕｌａｔｅｄｒｅｇｕｌａｔｅｄｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ－ｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎ）家族、ＹＳＬ（Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｔｆｉｐｅｌ．Ｌｉｋｅ）家族、ＣＯＰＴ家族和ＡＢＣ超家族。ＨＭＡｓ和ＣＤＦ家族负责外排离子，以及离子的跨膜转运和运送离子进入细胞器（Ｂａｘｔｅｒ ｅｔａ１．２００３；Ｄｅｌｈａｉｚｅ ｅｔａ１．２００３）。负责将离子由环境中或是细胞１：Ｍａｓｅｒ器中跨膜转运进入细胞质的家族主要是Ｎｒａｍｐｓ、ＺＩＰ、ＣＯＰＴ以及植物特有的ＹＳＬ（ＹｅｌｌｏｗＳｔｒｉｐｅ １．Ｌｉｋｅ）家族（Ｌａｓｓｗｅｌｌ ｅｔ ａ１．２０００；Ｃｕｒｉｅ甜ａ／．２００ｅｔ ａ１．２００１）。而ＡＢＣ超家族在离子外排和吸收中都有作用（Ｂｏｖｅｔ臼ａ／．２００３；Ｍｏｏｎｓ２００３；Ｋｉｍ ｅｌａ１．２００７）。拟南芥ＨＭＡｓ家族有八个同源基因，其中ＨＭＡＩ～ＨＭＡ４是负责１９郭江波博士论文：利用多基因转化技术获取重金属超富集植物的研究Ｚｎ／Ｃｄ／Ｐｂ／Ｃｏ二价离子的转运，ＨＭＡ５－－－－ＨＭＡ８负责Ｃｕ／Ａｇ单价阳离子的转运（Ｂａｘｔｅｒ ｅｔ ａ／．２００３；Ｗｉｌｌｉａｍｓｅｔａ／．２００５）。Ａｔ ＨＭＡ２和Ａｔ ＨＭＡ４酵母功能互补实验、异源表达、反向遗传学分析以及基因定位研究表明，这两个基因负责将重金属离子泵出细胞质膜，推测是参与植物木质部装载或卸载，将重金属离子由根部向地上部分转运的关键基因（Ｍｉｌｌｓ甜ａ／．２００３；Ｅｒｅｎ ｅｔ２００４；Ｖｅｒｒｅｔ ｅｔ ａ１．２００４；Ｈｕｓｓａｉｎ ｅｔ ａ／．ａ１．２００４ａ；Ｍｉｌｌｓ ｅｔ口正２００５）。ｅｔ ａＬ拟南芥中已经分离的ＣＤＦ家族基因有１２个（Ｄｅｌｈａｉｚｅ２００３），其中研究的比较多的是ＭＴＰｌ基因。ＭＴＰｌ一开始命名为ＺＡＴＩ，其超表达可以提高植 物耐受Ｚｎ胁迫的能力（ｖａｎｄｅｒ Ｚａａｌ ｅｔａ／．１９９９）。后来拟南芥突变体、ＧＦＰ定位和蛋白生化研究表明，该基因编码产物是植物液泡膜蛋白，推测可能是参与Ｚｎ 区隔化过程（Ｄｒａｇｅｒ ｅｔ以２００４；Ｋｏｂａｅｅｔ ａ／．２００４；Ｄｅｓｂｒｏｓｓｅｓ－Ｆｏｍ＇ｏｕｇｅ ｅｔ ａ１．２００５）。对能够超富集Ｎｉ／Ｚｎ的植物遏蓝菜（Ｔｈｌａｓｐｉ ｇｏｅｓｉｎｇｅｎｓｅ）研究表明，遏蓝菜能够超积累Ｎｉ／Ｚｎ的原因就在于其细胞内ＴｇＭＴＰｌｂ基因的表达高于敏感植物 （Ｐｅｒｓａｎｓｅｔａ１．２００１）：超表达该基因，可以使拟南芥突变体回复对Ｚｎ的抗性。ｅｔ ａ１．１９９６；Ｌｉ ｅｔ酵母细胞中属于ＡＢＣ蛋白家族的ＳｃＹＣＦＩ（Ｌｉ ＳｐＨＭＴｌ（Ｏｒｔｉｚｅｔａ１．１９９７）和ａ１．１９９２）也是参与酵母细胞质中重金属离子区隔化过程，将ＳｃＹＣＦｌ在拟南芥中超表达后，显著提高了转基因植物对Ｃｄ，Ｐｂ的耐受和积累 能力（Ｓｏｎｇｅｔ ａ１．２００３；Ｔｏｎｇ ｅｔａ１．２００４）。ｅｔ拟南芥中有６个ＮＲＡＭＰ（Ｍａｓｅｒ ８个ＹＳＬ同源蛋ｔ刍（Ｃｕｒｉｅｅｔ ａＬａ１．２００１），１６个ＺＩＰ（Ｌａｓｓｗｅｌｌｅｔ ａＬ ｅｔ ａＬ２０００），１９９５；２００１），５个ＣＯＰＴ蛋Ｉ刍（Ｋａｍｐｆｅｎｋｅｌ ａ１．２００４）。Ｓａｎｃｅｎｏｎ ｅｔ ａ１．２００３；Ｓａｎｃｅｎｏｎ ｅｔＮＲＡＭＰ是一类广泛存在的金属转运蛋白，植物中ＮＲＡＭＰ家族蛋白与包括铁在内的多个金属离子转运有关，将ＡｔＮＲＡＭＰｌ在酵母突变体中表达可以回 复转化子铁吸收的能力，而且超表达ＡｔＮＲＡＭＰｌ的植物对铁的毒害耐受能力也有提高（Ｃｕｒｉｅｅｔａ／．２０００）。２０第一章文献综述表１．２部分植物耐受重金属转基因研究一览表（引自Ｋｒａｍｅｒ Ｕ ２００１；Ｋｒａｍｅｒ ２００５）ＺＩＰ蛋白家族可以通过转运金属离子进入细胞质中调节离子平衡，现在已 经鉴定的ＺＩＰ蛋白超过１００多个（ＧｒｏｔｚＮ．１９９８；Ｇｕｅｒｉｎｏｔ２０００）。对超富集Ｚｎ／Ｃｄｅｔ ａ１．的植物遏兰菜研究表明，ＴｃＺＮＴｌ蛋白与其根部吸收较多Ｚｎ有关（Ｐｅｎｃｅ２１郭江波博士论文：利用多基因转化技术获取重金属超富集植物的研究２０００）。拟南芥ＡｔＩＲＴｌ属于ＺＩＰ蛋白家族，是拟南芥根表面主要负责吸收Ｆｅ的转运蛋白（Ｖｅｒｔ ｅｔ ａ／．２００２），在酵母中表达后使转化子对Ｃｄ吸收增加并对Ｃｄ 胁迫敏感（Ｐｌａｚａｅｔａ１．２００７），因此植物Ｆｄ＋和Ｃｄ可能是利用相同的或部分重叠的吸收途径（Ｋｏｒｓｈｕｎｏｖａ甜ａ／．１９９９）。ＹＳＬ是植物特有的一种金属离子转运蛋 白，负责非禾本科植物根细胞吸收土壤中的Ｆｅ”（Ｃｕｒｉｅ纠ａ／．２００１）。非禾本科 植物细胞中没有植物高铁载体，因此可能是ｎｉｃｏｔｉａｎａｍｉｎｅ先与Ｆｅ”形成复合物 后，由ＹＳＬ蛋白转运进入植物细胞质（Ｃｏｌａｎｇｅｌｏ 都存在Ｃｕ高亲和吸收蛋白Ｃｔｒ家族（Ｋａｍｐｆｅｎｋｅｌｅｔ ｅｔａ１．２００６）。真核细胞生物中 ａ１．１９９５），但植物中只有拟南芥中的ＣＯＰＴｌ研究的比较透彻。植物叶片细胞反义抑制ＣＯＰＴｌ表达可以显著降低其吸收和积累Ｃｕ（Ｓａｎｃｅｎｏｎｅｔａ１．２００４），而且转基因植物表现出花粉不育、根加长的特征可以通过外加Ｃｕ恢复。拟南芥基因组大约编码１３０种ＡＢＣ转运蛋白，但是只有很少部分清楚其 功能（Ｋｉｍｅｔａ１．２００７），现在研究比较透彻的只有ＡｔＭＲＰ３、ＡｔＡＴＭ３、ＡｔＰＤＲ８ｅｔ ａ１．１９９８；ＤｅＲｉｄｄｅｒ ｅｔ的功能（Ｔｏｍｍａｓｉｎｉａ１．２００６；Ｋｉｍｅｔａ１．２００６）。Ｋｉｍ等将ＡｔＰＤＲ８基因超表达后发现转基因株系比野生型更耐受Ｃｄ／Ｐｂ的胁迫，但细胞 内相对积累更少的重金属。而ＲＮＡｉ抑制株系和Ｔ－ＤＮＡ插入突变体的表现都恰好与超表达株系相反，比野生型对重金属胁迫更敏感，而且积累较高浓度的Ｃｄ／】Ｐｂ。结合ＧＦＰ定位实验，研究者推断ＡｔＰＤＲ８是负责将细胞质中Ｃｄ／Ｐｂ离 子外排出细胞的转运蛋白。 综上所述，为了培育能够超积累重金属的转基因植物，我们应该选择那些 像ＴｅＺＮＴｌ、ＳｃＹＣＦｌ这样能够将金属离子泵入细胞质中的转运蛋白，而不是像 ＡｔＰＤＲ８那样泵出的蛋白。１．３．３改变相关代谢途径在植物细胞中引入新的代谢途径是一个很好的提高植物耐受、积累重金属的策略。最成功的例子就是将Ｅ ｃｏｌｉ中编码分解甲基汞的关键酶基因ｍｅｒＡ、ｍｅｒＢ同时在拟南芥中超表达显著提高了植物修复有机汞污染的能力（Ｂｉｚｉｌｙｅｔａ１．１９９９；Ｂｉｚｉｌｙ ｅｔ ａ１．２０００）。ｍｅｒＢ编码有机汞裂解酶，负责将有机汞转化为Ｈ９２＋。ｍｅｒＡ编码汞还原酶，可以将Ｈ９２＋还原为单质汞，最后通过气孔排出植物体。 双价转基因拟南芥可以比野生型耐受的有机汞浓度提高约５０倍，比单价ｍｅｒＢ拟南芥提高了１０倍。Ｄｈａｎｋｈｅｒ等将细菌来源的砷酸还原酶（ＡｒｓＣ）和Ｙ－ＥＣＳ第一章文献综述在拟南芥中表达，ＡｒｓＣ转基因株系虽然可以积累更多砷但比野生型更敏感，而 Ｙ－ＥＣＳ比野生型更加耐受砷酸盐。同时将这两个基因在拟南芥中表达，转基因 植物不仅比单价株系能够积累更多的砷，还可以耐受较高浓度的砷酸盐胁迫 （Ｄｈａｎｋｈｅｒｅｔ ａ１．２００２；Ｄｈａｎｌｄａｅｒ ｅｌａ１．２００３）。生物体在逆境环境下产生高浓度的甲基乙二醛可引发蛋白质和核酸修饰以 及细胞毒性。乙二醛酶以还原型谷胱甘肽为辅助因子，经过半硫代缩醛中间体 把甲基乙二醛转化成Ｄ哥Ｌ酸。乙二醛酶途径中包含了乙二醛酶Ｉ（ｇｌｙｏｘａｌａｓｅ Ｉ）和乙二醛酶ＩＩ（ｇｌｙｏｘａｌａｓｅ ＩＩ）２种酶。Ｓｉｎｇｌａ．Ｐａｒｅｅｋ等研究者将乙二醛酶Ｉ、ＩＩ在烟草中超表达后，双价转基因植物比单价和野生型更能耐受不同重金属的胁迫（Ｓｉｎｇｌａ－Ｐａｒｅｅｋｅｌａ／．２００６）。１．３．４提高植物抗氧化胁迫的能力重金属离子进入植物细胞后会对细胞膜系统和细胞器产生氧化毒害，因此， 提高细胞的抗氧化能力也是改良植物耐受重金属能力的选择之－－（Ｍａｌｅｃｋａ２００ １；Ａｄａｍｉｓ ｅｌｅｔ ａ１．ａ１．２００４；Ｍａｙ甜ａ１．２００５；Ｓｉｎｇｈｅｔ ａ１．２００６；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａ１．２００６）。Ｚｈｕ等将细菌来源的ＧＳ和ｒ－ＥＣＳ在印度芥菜中超表达后，转基因植物 对Ｃｄ耐受能力增３Ⅱ（Ｚｈｕ ｅｔａ１．１９９９ａ；Ｚｈｕ ｅｌａ１．１９９９ｂ）。Ｅｚａｋｉ等将谷胱甘肽一Ｓ一转移酶和过氧化物酶在拟南芥中超表达后，转基因植物耐受Ａｌ毒害和氧化胁迫的能力显著增力ｌｌ（Ｅｚａｋｉｅｌ ａ１．２０００；Ｅｚａｋｉ ｅｔ ａ１．２００１；Ｅｚａｋｉ ｅｌａ１．２００４）。很多研究者还从其他方面来改良目标植物，如利用植物根际微生物能够吸 附重金属来提高植物耐受重金属胁迫的能力（Ｓｃｈｕｔｚｅｎｄｕｂｅｌ ａ１．２００７）。ｅｌ ａ１．２００２；Ａｕｄｅｔ ｅｔ植物耐受重金属的相关基因很多，越来越多的研究者倾向于构建双价或多 价转基因植物，这些成功的基因工程技术范例证实了将微生物一整套代谢途径转入植物中，培育用于植物修复的工程植物是可行（Ｐｅｒｓｉｄｉｓ １９９９）。但到目前为 止，哪几类基因、如何组合可以尽可能最大程度的提高植物耐受、积累重金属 的能力，尚无成功的范例。 芽殖酵母大约只有１０％的基因有内含子（Ｚｈａｎｇｅｌａ／．１９９４），而且酵母合成２０种必需氨基酸的密码子使用的偏好性（ｃｏｄｏｎ ｂｉａｓ）和植物的相似（表１．３）。因此 将真核微生物酿酒酵母中与重金属络合物合成途径关键酶基因以及液泡漠上重 金属转运蛋白（ＹＣＦＩ）转入植物拟南芥中是可行的。可以从表１．２发现，将微生郭江波博士论文：利用多基因转化技术获取重金属超富集植物的研究物基因转入植物，似乎转基因效果更佳。这可能是目的基因在不同界生物体内异源表达发生共抑制沉默（ｃｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）的几率小一些（Ｐａｌａｕｑｕｉｅｔ ａ／．１９９８；Ｔｓａｉ ｅｔ ａ１．１９９８；Ｈｓｉｅｈ ｅｔ ｅｔａ／．１９９８；Ｑｕｅａ／．２０００）。外源基因异源表达发生共抑制与ｅｔ外援基因和内源同源基因的序列相似性、以及内源基因的表达情况有关（Ｔｓａｉａ／．１９９８）。所以将在分类学上跨度较大的物种的基因转入目标工程植物，可能会提高外源基因的表达效率。第一章文献综述表１．３酿酒酵母与拟南芥合成２０种必须氨基酸的密码子使用偏好比较注：（?）代表密码子使用频率（‰）（数据来源于密码子数据库： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｒｔ／）。表中引用的常用氨基酸引自文献（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔａｌ．１９９０）。２５郭江波博士论文：利用多基因转化技术获取重金属超富集植物的研究１．４本论文立题依据植物修复是近年来提出的一种低成本、无二次污染、可原位操作的、非常有应用价值的污染物清除的生物技术，其未来市场需求巨大。然而自然界存在的天然超富集植物存在生长缓慢、生物量低、局域性分布的缺点，且只能对单 一重金属积累，限制其直接大规模的用于植物修复。因此研究人员一直试图通 过转基因手段将重金属富集能力引入生物量大、适生性强的植物，弥补天然超富集植物在应用上的不足，以用于环境中重金属污染的清除。目前已报道的转基因植物研究多是单个基因的表达，对重金属富集的效果与实际应用的要求相去甚远。在充分认识和阐明植物耐受金属胁迫和超富集重金属的分子机理的前体下，将不同生物来源的与富集重金属相关的细胞质络合、转运和区隔化作用相关的基因（图１．４）在目标植物体内同时表达，可以探讨 培育多基因转化植物可行性。培育多基因转化的工程植物有助于深入研究植物 对重金属耐受和积累的分子机理和植物修复技术的实际应用。由于对酵母重金属吸收和转运相关基因功能的研究较为深入，本论文选择 酵母中功能和作用机理已清楚的基因作为目的基因。而且酵母基因与植物基因 编码蛋白使用相似的密码子，因此没有密码子偏好性的影响。酵母与拟南芥的分类学地位相差较远，转基因沉默的危险相对低一些。本论文的目的就是将来源于酿酒酵母的谷胱苷肽合成关键酶Ｙ一谷氨酰氨半胱氨酸合成酶（ＧＳＨ，）、 以及酵母液泡膜转运蛋白ＹＣＦ Ｉ的基因（ｒＣＦ，）分别与来源于大蒜的植物络合素合酶的基因似妒傩Ｉ），一起转入模式植物拟南芥中，研究不同基因组合对转基因植物耐受、积累重金属能力的影响，探讨通过多基因转化技术改良目标植 物的可行性及其实际应用价值。目前已知的植物在细胞学水平能够耐受并积累重金属的机制，是进入细胞内的金属离子可以与细胞内的小肽化合物等形成络合物后被转运进液泡中与细胞其他的膜结构隔离，从而降低了金属离子对细胞可能的伤害（图１．４）。但是， 无论是与小肽形成的复合物或是游离的金属离子都需要克服从液泡到细胞质的 金属离子浓度梯度，换言之，金属离子是逆浓度梯度进入液泡中的。因此，仅依靠离子化学浓度梯度提供动力的自由扩散显然不能高效地将重金属离子转运 入液泡。定位在液泡漠上的金属离子转运蛋白只能将在其作用范围内的金属离 子捕获后转运进入液泡，而那些游离在其作用范围之外的金属离子是如何定向地转运到这些蛋白的作用范围之内的，现在仍然不清楚。推测生物细胞中存在２６第一章文献综述一种机制能够将细胞质内的重金属离子及其复合物主动逆离子浓度梯度转运进 入液泡中储存。 细胞内的囊泡流（膜流，ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｓｔｒｅａｍｉｎｇ）是细胞转运代谢物很重要 的方式之一，但是一直以来鲜有研究者注意到植物细胞中的重金属离子及其复 合物的定向转运是否与此过程有关。本论文试图将酿酒酵母中与二价阳离子囊 泡转运相关的ＳＭＦ２基因在拟南芥中超表达，研究转基因拟南芥对不同金属离 子的耐受和积累能力的变化，希望能够对囊泡转运是否参与了重金属离子定向 转运入液泡的过程进行探索。图１．４本研究立题依据图解 ＨＭ：重金屑离子；ＨＭＣ重金属高于与ＧＳＨ和ＰＣｓ的络台物：ＰＣＳ：ＰＣｓ台酶；ＧＳＨＩ：ＧＳＨ合成关键酶。第二章利用多基因转化技术培育能够超富集重金属的转基因拟南芥第二章利用多基因转化技术培育能够超富集重金属的转 基因拟南芥２．１前言植物细胞能够耐受并积累重金属离子的机制是植物细胞内有机酸和小肽类 化合物可以与进入细胞的金属离子结合，而后游离的重金属离子及其复合物被转运进入植物液泡中储存起来，使细胞的内膜系统和细胞器免受重金属离子的 攻击。植物络合素在细胞内离子平衡方面的重要作用已经为广大研究者接受，而且许多研究者将植物络合素合酶异源超表达以期获得能够耐受并超积累重金属的转基因工程植物。我们实验室已从大蒜中克隆了大蒜的植物络合素合酶的编 码基因ＡｓＰＣＳ，（姜瑛楠２００３），而且在拟南芥中超表达后能够显著提高转基因 拟南芥耐受和积累ｃｄ的能力（张海燕２００５）。谷胱甘肽是植物合成植物络合素的底物（Ｒｕｅｇｓｅｇｇｅｒ ｅｔ ａ１．１９９０），因此虽然单纯只在植物细胞内超表达植物络合 素合酶基因可以提高植物耐受和积累重金属离子的能力（ＣｌｅｍｅｎｓＶａｔａｍａｎｉｕｋｅｔ ａ１．１９９９；ｅｔ ａ１．１ ９９９；Ｓｃｈｍｏｇｅｒ ｅｔ ａ１．２０００；Ｇｉｓｂｅｒｔ ｅｔ ａ１．２００３；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａ１． ｅｔ２００６），但是也有一些转基因植物表现为对重金属胁迫敏感（Ｌｅｅａ１．２００３）。究其原因，可能是重金属胁迫诱发的氧化反应和超表达植物络合素合酶后合成植 物络合素均需要更多的还原型谷胱甘肽，两者共同作用引起谷胱甘肽耗竭（Ｌｅｅｅｔａ１．２００３），从而使植物细胞内氧化还原平衡被打破，细胞内高还原势不能维持（Ｏｇａｗａ ２００５），最终表现为转基因植物对重金属胁迫敏感。因此，我们考虑 到谷胱甘肽是植物应对重金属胁迫的一种关键的化合物，将酿酒酵母细胞中谷 胱甘肽合成的关键酶基因，ＧＳＨ １，连同大蒜植物络合素合酶基因ＡｓＰＣＳ，在拟南芥中超表达，以期能够有效的提高转基因植物耐受并积累重金属的能力， 同时探讨超表达植物络合素合酶基因后合成过量的ＰＣｓ是否会引起细胞内谷胱甘肽浓度下降。２００３年有研究者将酿酒酵母基因ＹＣＦ，在拟南芥中超表达，提高了转基因植物积累和耐受Ｃｄ和Ｐｂ的能力（Ｓｏｎｇｅｔａ１．２００３）。ＹＣＦ Ｉ蛋白定位在酵母细胞液泡膜上，能够将多种物质，包括一些金属离子和小肽转运进入液泡中，缺失郭江波博士论文：利用多基因转化技术获取重金属超富集植物的研究ｙ（万，基因的酵母细胞对Ｃｄ２＋敏感（Ｓｚｃｚｙｐｋａ 母细胞区隔化重金属离子相关的蛋白。ｅｌ ａＬ１９９４）。因此，ＹＣＦ Ｉ是与酵细胞络合和区隔化是植物耐受、积累重金属的细胞学基础，是一个相互关 联的系统。以往的研究者多是就一个过程研究，从未有研究者将这两个过程同 时整合在植物细胞内研究。本文拟通过基因工程手段，同时在拟南芥中将络合化关键基因么妒ＣＳ １和区隔化关键基因ＹＣＦ Ｉ超表达，试图将这两个过程整合在植物细胞内并放大，提升植物细胞耐受、积累重金属离子的能力，期望能够 培育出可以用于植物修复的工程植物。２．２材料与方法 ２．２．１植物材料与菌株１）植物材料：拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ），生态型为Ｃｏｌｕｍｂｉａ型，２２℃，１６ｈｒ光照培养： ２）菌株：大肠杆菌：ＤＨ 农杆菌：ＧＶ３１０１； 酿酒酵母茵（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）：￥２８８Ｃ（ＭＡＴＱ５ Ｑ，ＤＨｌ０Ｂ，ＴＯＰｌ０；ＳＵＣ２ ｒｅａｌ ｍｅｌ ｇａｌ２ＣＵＰｌ，日本国京都大学Ｙｏｓｈｉｈａｒｕ Ｉｎｏｕｅ教授惠赠） ３）质粒载体：ｐ１３０１一Ｍ丁一彳妒ＣＳ Ｉ（Ｋａｎ‘，Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ抗性，携带ＡｓＰＣＳ，）ｐＧＥＭ―Ｔｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ公司，Ａｍｐ‘，用于Ｔ／Ａ克隆）； ｐＣＡＭＢＩＡｌ３０１（Ｋａｎｒ，Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ抗性，用于植物表达载体改造）； ｐＳＮｌ３０１（Ｋａｎ‘，用于植物表达载体改造）； ｐＹＬＳＶ（Ｃｈｌ‘，用于酵母基因克隆）。２．２．２实验方法２．２．２．１植物总ＲＮＡ的提取 １）取１００ ｍｇ植物材料，于液氮中研磨至粉状，加入ｌ ｍｌ Ｔｆｉｚｏｌ试剂，上下 颠倒数次；２）１２０００转／ｍｉｎ离心５分钟，取上清； ３）酚仿混合液（１：１）抽提两遍，离心取上清；２９第二章利用多基因转化技术培育能够超富集重金属的转基因拟南芥４）加入ｌ体积的异丙淳，沉淀５分钟；５）１２０００转／ｒａｉｎ于４。Ｃ离心５分钟，去上清； ６）７０％乙醇洗沉淀两遍； ７）室温下干燥１０分钟； ８）沉淀溶于２０“ｌ，电泳检测。２．２．２．２ｅＤＮＡ的合成（ＴＯＹＯＢＯ ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ逆转录酶）１）在０．２ｍｌ无ＲＮＡ酶的ＰＣＲ管中先加入０．５｜ｌ ｇ总ＲＮＡ，２．５｜Ｉ ｌ随机引物（９ｍｅ０（２．５ｎＭ）； ２）混合均匀，７２℃热浴５ ｍｉｎ，随后置于冰上５ｍｉｎ； ３）再加入４ ｕ ｌ反应缓冲液（５×），８｜ｌ ｌ ｄＮＴＰ（２．５Ｍｍ），ｌ１ｐ