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酵母菌菌种保藏技术规程
酵母菌菌种保藏技术规程
起草单位：中国食品发酵工业研究院
前言.................................................................................. 37
酵母菌菌种保藏技术规程................................................................ 38
1 范围................................................................................ 38
2 术语和定义.......................................................................... 38
3 保藏准备工作........................................................................ 38
4 保藏方法............................................................................ 39
附录1 定期移植法...................................................................... 40
1 斜面的制备.......................................................................... 40
2 接种................................................................................ 40
3 培养................................................................................ 41
4 保藏................................................................................ 41
5 菌种的移植.......................................................................... 41
附录2 蒸馏水法........................................................................ 41
1 蒸馏水试管的制备.................................................................... 41
2 制备菌悬液.......................................................................... 41
3 保藏................................................................................ 41
4 恢复培养............................................................................ 41
附录3 液体石蜡保法.................................................................... 41
1 液体石蜡预处理...................................................................... 42
2 斜面培养物的制备.................................................................... 42
3 灌注石蜡............................................................................ 42
4 保藏................................................................................ 42
5 恢复培养............................................................................ 42
附录4 －80℃冰箱冻结法................................................................ 42
1 安瓿管或冷冻管的准备................................................................ 42
2 保护剂的准备........................................................................ 42
3 保藏培养物的准备.................................................................... 42
4 保藏................................................................................ 42
5 恢复培养............................................................................ 42
附录5 液氮超低温冻结法................................................................ 43
1 安瓿管或冷冻管的准备................................................................ 43
2 保护剂的准备........................................................................ 43
3 保藏培养物的准备.................................................................... 43
4 预冻................................................................................ 43
5 保藏................................................................................ 43
6 恢复培养............................................................................ 43
7 注意事项............................................................................ 43
附录6 真空冷冻干燥法.................................................................. 44
1 安瓿管的准备........................................................................ 44
2 保护剂的准备........................................................................ 44
3 冻干样品的制备...................................................................... 44
4 预冻................................................................................ 44
5 真空干燥............................................................................ 44
6 测定水分............................................................................ 45
7 熔封................................................................................ 45
8 真空度检测.......................................................................... 45
9 保藏................................................................................ 45
10 恢复培养........................................................................... 45
参考文献.............................................................................. 45
酵母菌是一类重要的微生物资源，广泛应用于各种酿酒、酱油、制醋、单细胞蛋白、焙烤、石油脱蜡、甘油、维生素、酶制剂、生物制药和基因工程等领域，是微生物学研究及生物技术产业持续发展的重要基础，也是微生物多样性的重要组成部分。
为妥善、安全、规范地保藏酵母菌菌种,避免死亡和污染，保持其原有性状基本稳定，特制定《酵母菌菌种保藏技术规程》，以确保酵母菌菌种的长期安全保藏。
本技术规程提供了保藏酵母菌菌种常用的几种方法，重在规范酵母菌菌种保藏的实际操作和日常维护，对从事酵母菌菌种保藏工作的人员提供了系统且具操作性的指导。
主要内容包括酵母菌保藏所用的定期移植法、蒸馏水法、液体石蜡法、－80℃冰箱冻结法、液氮超低温冻结法和真空冷冻干燥法，对每种保藏方法所使用的实验材料和具体操作流程进行了规范。
在编写过程中，尽可能收集了国内外各方面的资料，借鉴其中有益的经验，也有不少编写者实际工作中积累的经验，初步形成了该技术规程的征求意见稿。
本规程主要起草人：程池、李金霞、姚粟、杨梅、胡海蓉&
酵母菌菌种保藏技术规程
本规程规定了酵母菌菌种保藏的技术和程序。
本规程适用于酵母菌菌种的保藏。
2　术语和定义
下列术语和定义适用于本规程
2.1　定期移植法 subculturing
亦称传代培养保藏法，指将菌种接种于适宜的斜面培养基上，最适条件下培养，待得到健壮的菌体后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的一种短期菌种保藏方法。
2.2　蒸馏水法 preservation in distilled water
指将欲保藏的菌种细胞悬浮于无菌蒸馏水中，密封后置于4～6℃保存的一种菌种保藏方法。
2.3　液体石蜡法 preservation in liquid paraffin
亦称矿物油保藏法，定期移植保藏法的辅助方法。指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培养至待得到健壮的菌体后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于低温（4～6℃）干燥处进行保存的一种菌种保藏方法。
2.4　－80℃冰箱冻结法 preservation at －80℃
指将菌种悬浮于保护剂中，在－80℃冰箱中冻结保存的一种长期菌种保藏方法。
2.5　液氮超低温冻结法 preservation in liquid nitrogen
指悬浮于保护剂中的菌种经程控降温后，移置于－196℃的液氮或－150℃左右的液氮气相中保存的一种长期菌种保藏方法。
2.6　真空冷冻干燥法freeze-drying
指将欲保藏的菌种细胞或孢子悬浮于保护剂中，经预冻后在真空条件下使水分升华，再经真空封存后保存的一种长期菌种保存方法。
3　保藏准备工作
待保藏的酵母菌菌种必须进行分离纯化，得到纯培养后再进行保藏。
3.2　工具、材料
接种针或接种环、吸管、镊子、75%酒精棉球、酒精灯、试管架、量筒、烧杯、平皿、标签、波美计等。
3.3.1　试管
选用平口试管，规格一般为15&150mm。
3.3.2　安瓿管
制安瓿管的材料应为中性玻璃，质地软硬度要适当。管的内径为8mm，长度不小于100mm。
3.3.3　冷冻管
带螺旋口的塑料冷冻管，其螺旋口分为外螺旋和内螺旋两种，规格为1.8mL。
3.4　器皿的清洗
菌种保藏工作所用的器皿要求清洁、透明、无破损、无裂痕。
3.4.1　新玻璃器皿的清洗
新玻璃器皿表面常含有游离的碱性物质，可先用去污粉或洗衣粉洗刷，再用自来水洗净。然后浸泡于1%～2%的盐酸溶液中数小时，再用自来水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗2～3次，干燥后备用。
3.4.2　使用过的玻璃器皿的清洗
用过的玻璃器皿应尽快洗涤。先用自来水洗至无污物，再用去污粉或洗衣粉刷洗干净，用自来水冲干净后再用蒸馏水洗2～3次。洗净的玻璃器皿，不应在器壁上带有水珠，否则表示尚未洗干净，应再按上述方法重新洗涤。
沾染微生物的试管，经灭菌后倒出内容物，将器皿放在热水中，加适量洗衣粉洗涤，用自来水冲洗干净，干燥后备用。
附着有油脂、石蜡等有机物质的器皿，采用去污粉擦除、有机溶剂溶解或洗液浸泡等方法处理后，再按2）项洗涤。
3.4.3　冷冻管的清洗
检查冷冻管是否渗漏。用0.05%的亚甲基蓝水溶液在4℃浸泡30～45分钟，冲洗干净，弃去含有蓝色染料的冷冻管，其余的冷冻管备用。
用蒸馏水将冷冻管漂洗干净即可。
3.5　碘液的配制
称取碘（I2）11g，碘化钾（KI）22g，用少量蒸馏水使碘溶解，然后定容至500mL，储存于棕色瓶中，配制成原碘液。
吸取原碘液2.00mL，加碘化钾20g用蒸馏水溶解并定容至500mL，储存于棕色瓶中。
高压灭菌锅、烘箱、恒温培养箱、水分测定仪、普通冰箱、－80℃冰箱、液氮罐、冷冻干燥设备、程控降温仪、超净工作台或无菌室等。
4　保藏方法
以下保藏方法除4.2不适合于分解石蜡的酵母菌菌种外，其它方法均适用于所有酵母菌菌种。
4.1　定期移植法
参见附录A。
4.2　蒸馏水法
参见附录B。
4.3　液体石蜡法
参见附录C。
4.4　－80℃冰箱冻结法
参见附录D。
4.5　液氮超低温冻结法
参见附录E。
4.6　真空冷冻干燥法
参见附录F。
附录1 定期移植法
1　斜面的制备
酵母菌保藏一般用5&B&麦芽汁琼脂培养基或YEPD培养基，其它特殊培养基可另行配制。
1.1　5&B&麦芽汁琼脂培养基
1.1.1　称取一定量的大麦芽粉，加入4倍量温度为60℃的清水，在55℃水浴锅中保温糖化4～6小时，并间歇性搅拌。
1.1.2　用玻璃棒蘸一滴糖化液于白色比色盘内与碘液反应，碘呈色反应为无色时糖化完毕。
1.1.3　用纱布过滤，将滤液煮沸，再用纱布或脱脂棉过滤，得到澄清的麦芽汁。或于糖化液中加入适量蛋清（每500g大麦芽粉的糖化液加入一个鸡蛋的蛋清），煮沸，过滤，也可得到清澈透明的麦芽汁。
1.1.4　用波美计测量麦芽汁浓度（一般为8～10&B&），加水稀释成5&B&的麦芽汁，pH值自然。
1.1.5　按1.5%～2%比例加入琼脂，煮沸使琼脂溶解，补足所蒸发水分。
1.1.6　将培养基趁热分装，每管分装量约为试管高度的四分之一（4～5mL）。分装过程中，应注意勿使培养基沾污管口，以免造成污染。
1.1.7　分装好的试管加棉塞或橡胶塞，外面包扎一层牛皮纸并注明培养基名称及配制日期。
1.1.8　121℃蒸汽灭菌15～20分钟。灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。
1.1.9　将斜面放入培养箱中，30℃培养1～3天。
1.1.10　无菌落长出后将斜面保存于4℃。空白斜面应尽快使用。
1.2　YEPD培养基
1.2.1　培养基组成
酵母提取物
1.2.2　配制过程
1.2.3　在烧杯中放入约500mL水，按A1.2.1要求称量各种药品，依次放入烧杯中溶解，最后补足1000mL。
1.2.4　按A1.1中5)～10)所述制备空白斜面。
2.1　打开超净台或无菌间的紫外灯灭菌20～30分钟。
2.2　关闭紫外灯，用75%酒精擦拭操作台面进行消毒。
2.3　点燃酒精灯，用75%酒精擦手进行消毒。
2.4　一只手夹住原菌种平板或试管及待转接斜面试管(斜面朝上)，另一只手将棉塞从试管口拔出，操作应在火焰无菌区域进行。
2.5　在火焰上将接种针的金属丝部分烧红灭菌，然后将要伸入试管部分的针柄也反复通过火焰灭菌。
2.6　将接种针水平通过火焰并插入原菌试管或平皿内，先在管壁上或未长菌体的培养基表面冷却，然后再用接种针轻轻沾取少量菌体，将接种针自原菌种试管或平皿内抽出，抽出时勿碰管壁，也勿通过火焰。
2.7　在火焰旁将沾有菌体的接种针迅速伸入待接空白斜面试管内，自斜面底部向上划一直线，使菌体沾附在斜面培养基上。划线时尽量不要划破培养基表面。
2.8　接完种后将接种针由试管内抽出，同时将试管口在火焰上灼烧一下，塞上棉塞。注意不要用试管口去迎棉塞，以免试管口在移动时造成污染。
2.9　接种针在放回原处前应在火焰上彻底灭菌。放下接种针后，再用右手将棉塞进一步塞牢，避免脱落。最后将已接种好的斜面试管放在试管架上。
2.10　接种完毕后及时在试管上标明菌株编号和日期，也可在接种之前标明。
将接完种的斜面放入培养箱中，28～30℃条件下进行培养3天。特殊菌种可在其最适条件下培养至稳定期。
4.1　培养好的斜面于4～6℃保存，根据不同要求每3～6个月移植一次。对于某些菌种，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉等，必须1～3个月移植一次。
4.2　保藏湿度用相对湿度表示，通常为50%～70%。
4.3　微生物菌种保藏期间，要定期检查菌种存放设施的温度和湿度、菌株有无污染、棉塞有无霉变，如发现异常应重新移植培养后更换。
4.4　每株菌种应保藏相继的三代培养物，以便对照，也可减少因意外和污染造成的损失。
5　菌种的移植
5.1　将斜面培养物转接到另一空白斜面上，在适宜条件下进行培养。
5.2　微生物菌种移植过程，要对菌株编号及培养基分别进行核对，避免发生错误。
5.3　微生物菌种移植培养后，应与原保藏菌株的培养特征和菌株登记信息对照，检查无误后再存放。
附录2 蒸馏水法
1　蒸馏水试管的制备
每支试管分装5mL蒸馏水，加棉塞，121℃蒸汽灭菌30分钟。也可选用带螺旋盖的试管，灭菌时不要将盖旋紧。
2　制备菌悬液
2.1　参照附录A制备斜面培养物。
2.2　无菌条件下用接种环从斜面培养基上或纯化后的平板培养基上取一环酵母细胞移入蒸馏水中，将细胞打散使其均匀分散在蒸馏水中。
2.3　用无菌的橡胶塞代替棉塞塞紧，如用带螺旋盖的试管则将螺旋盖旋紧。
直立放置于4～6℃条件下贮藏。一般可保藏1～2年。
4　恢复培养
移接或再培养时，无菌条件下用接种环蘸取保藏菌液移接在新鲜培养基上活化培养。
附录3 液体石蜡保法
1　液体石蜡预处理
1.1　选用优质化学纯液体石蜡，将液体石蜡分装到试管中加塞，用牛皮纸包好，采用以下两种方式进行灭菌：
121℃湿热灭菌30分钟，置40℃恒温箱中干燥或170℃烘箱中蒸发水分。
160℃干热灭菌2小时。
1.2　将灭菌的液体石蜡冷却至室温备用。
2　斜面培养物的制备
参照附录A。
3　灌注石蜡
将无菌的液体石蜡在无菌条件下注入培养好的新鲜斜面培养物上，液面高出斜面顶部1cm左右，使菌体与空气隔绝。
为避免加石蜡油时各菌株间的交叉污染，最好每株菌种用一管液体石蜡油。
4.1　注入液体石蜡的菌种斜面以直立状态置低温（4～6℃）干燥处保藏，保藏时间1～2年。
4.2　保藏期间应定期检查，如培养基露出液面，应及时补充无菌的液体石蜡。
4.3　保藏场所应保持干燥，避免棉塞生霉。
5　恢复培养
在移接或再培养时，挑取少量菌体移接在新鲜麦芽汁琼脂或其它适宜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次。
附录4 －80℃冰箱冻结法
1　安瓿管或冷冻管的准备
1.1　将安瓿管或冷冻管按3.4步骤清洗干净，晾干。
1.2　激光打印标签，标签上标明菌株编号和保藏日期，大小约为10&20mm，标签在管内的位置应距离管底约10mm左右，标签上有字的一面面向管壁。也可直接将菌株编号和保藏日期直接喷码在安瓿管或冷冻管表面，安瓿管表面的喷码要经160℃固定20分钟才能进行灭菌。
1.3　塞好棉塞或旋上盖子，121℃蒸汽灭菌15～20分钟，60℃烘干备用。
2　保护剂的准备
选用分析纯甘油制备保护剂。用蒸馏水配制10%的甘油溶液作为保护剂，每支试管分装5mL，121℃蒸汽灭菌15～20分钟。
3　保藏培养物的准备
3.1　斜面培养物的制备参照附录A，要求培养至静止期或成熟期。
3.2　无菌条件下将灭过菌的10%甘油5mL用无菌吸管注入到培养好的斜面中，用吸管刮取斜面上的菌体，注意不要将培养基刮破。
3.3　将菌体与保护剂混匀后用吸管注入到安瓿管或冷冻管内，每支分装约0.5～1mL，菌悬液中细胞浓度应不低于106个/mL。
将安瓿管或冷冻管直接置－80℃冰箱中保藏，可保藏2～5年。
5　恢复培养
5.1　从冰箱中取出安瓿管或冷冻管，立即置于38～40℃水浴中复苏并适当快速摇动，直到内部结冰全部溶解为止。安瓿管复苏所用时间为40～60秒，冷冻管复苏所用时间为60～120秒。
5.2　用70%酒精棉球将安瓿管或冷冻管擦拭干净，无菌条件下打开，将菌悬液转移至麦芽汁或其它适宜培养基上，28～30℃或在其适宜温度下培养。
附录5 液氮超低温冻结法
1　安瓿管或冷冻管的准备
1.1　将1.8mL冷冻管洗净，晾干。
1.2　激光打印标签，标签上标明菌株编号和保藏日期，大小约为10&20mm，标签在管内的位置应距离管底约10mm左右，标签上有字的一面面向管壁。也可直接将菌株编号和保藏日期直接喷码在冷冻管表面。
1.3　塞好棉塞或旋上盖子，121℃蒸汽灭菌15～20分钟，60℃烘干备用。
2　保护剂的准备
选用分析纯甘油制备保护剂。用蒸馏水配制10%的甘油溶液作为保护剂， 每支试管分装5mL，121℃蒸汽灭菌15～20分钟。
3　保藏培养物的准备
3.1　斜面培养物的制备参照附录A，要求培养至静止期或成熟期。
3.2　无菌条件下将灭过菌的10%甘油5mL用无菌吸管注入到培养好的斜面中，用吸管刮取斜面上的菌体，注意不要将培养基刮破。
3.3　将菌体与保护剂混匀后用吸管注入到冷冻管内，每支分装约1mL，菌悬液中细胞浓度应不低于106个/mL。
3.4　将冷冻管盖子旋紧后放入冻结器内。
可采用以下两种方式进行预冻：
将控温系统先预冷到4℃，再将盛有保藏物的冷冻管放入其中，以每分钟1℃的降温速率使温度降至－35℃。
将冷冻管置－20℃至－40℃冰箱中冷冻，1～2小时取出放入液氮罐中快速冷冻，这样冷冻速率大约每分钟下降1～1.5℃。
5.1　立即将预冻后的冷冻管转移至处于液氮中的储存器中，置于液态氮的气相或液相保藏。一般气相中温度为－150℃，液相中温度为－196℃。
5.2　用此法可保藏酵母菌5～8年。
6　恢复培养
6.1　将冷冻管立即放置38～40℃水浴中复苏并适当快速摇动，直到内部结冰全部溶解为止，整个复苏过程约需50～100秒。
6.2　用75%酒精棉擦拭冷冻管。
6.3　将冷冻管盖子旋开，无菌条件下将内容物转移至麦芽汁或其它适宜培养基上，28～30℃或适温下培养。
7　注意事项
7.1　操作时要注意安全，带防护面罩和手套，防止冻伤。
7.2　冷冻管于液相中存放时一定要拧紧螺帽。
7.3　运送液氮时要用专用特制的容器，绝不可用密闭容器存放或运输液氮，切勿使用保温瓶存放液氮。
7.4　注意存放液氮容器的室内通风，防止过量氮气使人窒息。
7.5　防止冷冻管破裂爆炸，如液氮渗入管内，当从液氮容器取出时，液态氮体积膨胀约680倍，爆炸力很大，要特别小心。
7.6　注意观察液氮容器中液氮的残存量，定期补充液氮。
附录6 真空冷冻干燥法
1　安瓿管的准备
选用中性玻璃材质的安瓿管。先用2%盐酸浸泡8～10小时，自来水冲洗至pH值为中性，再用蒸馏水洗2～3次，置烘箱中烘干备用。
激光打印机打印标签，标签上标明菌株编号和保藏日期，大小约为10&20mm，标签可插入管内或贴于管外，也可直接喷码在安瓿管表面，位置应距离管底约5mm左右，喷码要经160℃固定20分钟才能进行灭菌。
塞好棉塞，将同一菌号的安瓿管包在一起，121℃灭菌30分钟，备用。
2　保护剂的准备
2.1　蒸馏水配制12%脱脂牛奶作为保护剂，每支试管分装2～5mL，加塞，再包一层牛皮纸捆好。
2.2　灭菌锅加热至水沸腾，再将包好的试管放入灭菌锅内，113℃蒸汽灭菌20分钟。
2.3　打开放气阀缓慢排出蒸汽，气压降到0时打开灭菌锅，取出灭完菌的脱脂牛奶试管，迅速放入凉水中冷却。
2.4　冷却后的脱脂牛奶试管于30℃培养2天，经无菌检查合格后备用。
3　冻干样品的制备
3.1　斜面培养物的制备参照附录A，要求培养至成熟期或稳定期。
3.2　无菌条件下将12%的脱脂牛奶用无菌吸管注入到培养好的斜面中，用吸管刮取斜面上的菌体，使菌体均匀地悬浮在保护剂内，注意勿将培养基刮破，也不可使菌悬液产生较多的气泡，菌悬液中细胞浓度应不低于106个/mL。
3.3　用长的无菌毛细滴管将菌悬液分装到无菌的安瓿管内，每支分装0.1～0.2mL。操作时要把带有菌悬液的长毛细滴管直接插入安瓿管的底部，勿使菌液沾在管壁上。
从制备菌悬液开始，经分装到进行预冻之间的时间不宜超过1小时。可采用以下几种方式预冻：
分装完成后将安瓿管立刻放入－35～－40℃冰箱预冻1小时，使菌液完全冻结。
可采用分段式预冻，先将分装好的安瓿管置－20℃冻30分钟，再放入－80℃冰箱冻30分钟。
采用离心式冻干装置时勿需预冻。
5　真空干燥
5.1　预冻后将安瓿管放入真空箱中，开动真空泵进行干燥。
采用无制冷设备的冻干装置，在开动真空泵后应使真空度在15分钟内达到66.5Pa，随后逐渐达到26.6～13.3Pa，在此条件下，样品将保持冻结状态，其中水分则不断升华，干燥才能顺利地进行。
采用离心式冻干装置，在安瓿管放于离心架上后，先开动离心机，再开动真空泵。
当样品基本干燥后，真空度将达到2.67～4Pa，此时如冻干装置具有后干燥设备，则打开油扩泵，使样品进一步干燥1～2小时。
使用具有温度控制设备的冻干装置，在冻干过程中当真空度达到26.6Pa时，样品中水分大量升华，这时可以开始加温，以便加速样品中水分升华。
5.2　终止干燥时间应根据下列情况判断：
安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状
真空度接近空载时的最高值
样品温度与管外温度接近
选用1～2支对照管，其水份与菌悬液同量，当其水分完全蒸发时视为干燥完结
选用一个安瓿管，装1%～2%氯化钴，如变深兰色，可视为干燥完结
整个冷冻干燥过程大约需要17～20小时。冷冻干燥完毕后，取出样品安瓿管置于干燥器内，备用。
6　测定水分
对经过真空干燥的样品进行水分含量测定，检查其干燥的程度。方法如下：
精确称取干燥后的样品0.5g以上，放于真空干燥器中，维持60℃干燥至恒重。或将干燥的制品保持真空度133Pa干燥至恒重。 也可将样品置105℃烘箱中烘至恒重。样品至恒重后按下式计算其水分含量：
样品中水分%=(失去的重量/样品的重量)&100%
一般水分含量在1%～3%时可进行熔封。如水分高于3%则需继续进行真空干燥，直到符合要求为止。
7.1　将安瓿管的中上部用火焰烧软，拉成细颈。
7.2　将安瓿管装到多歧管上，开启真空泵，当真空度达到1.33Pa时，再继续抽几分钟，用火焰在细颈处熔封，严格的密封会使安瓿管上产生一个小窝。
7.3　拉管时注意火焰不要离菌体太近，以免影响菌体的活力。
8　真空度检测
用高频电火花检查各安瓿管的真空情况，如管内呈现灰蓝色光，说明真空度符合要求。检查时高频电火花应射向安瓿管的上半部，切勿直接射向样品，以免影响其中的菌种。
将封好的安瓿管于4～6℃下避光保藏，一般可保藏8～10年。
10　恢复培养
冻干保藏菌种需用时在无菌条件下按以下步骤进行恢复培养：
10.1　用75%酒精棉球擦拭安瓿管。
10.2　将安瓿管顶部烧热。
10.3　立即用无菌棉签蘸无菌水，在顶部蘸一下，顶部出现裂纹，用镊子轻叩，敲下已开裂的安瓿管的顶端。
10.4　用无菌吸管吸取0.3～0.5mL麦芽汁液体或其它适宜液体培养基滴入安瓿管中，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状。
10.5　取0.1～0.2mL菌体悬浮液，移植于适宜的固体斜面或平板培养基上，剩余的菌液，注入麦芽汁液体或其它适宜液体培养基内，28～30℃或适温下培养。
[1] Cletus P. Kurtzman, Jack W. Fell. The Yeasts, a Taxonomic Study. 4th edition. Amsterdam: ELSEVIER SCIENCE B. V.,1998
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