怎么样用基因的分子生物学考研技术手段证明外源基因是被整合和表达的

& 基因工程、生物技术的安全性和伦理问题知识点 & “(16分)下面是在农杆菌Ti质粒基础上构...”习题详情
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(16分)下面是在农杆菌Ti质粒基础上构建的植物抗虫基因表达载体的示意图。请据图回答:(1)为了扩大基因表达载体的数量,需将基因表达载体再植入农杆菌中并对农杆菌进行培养,此时,在培养农杆菌的培养基中应加入&&&&,该培养基按用途划分属于。(2)带有抗虫基因的农杆菌进入棉花细胞后,要检测抗虫基因是否插入到棉花的染色体DNA上,常用的方法是&&&&;要检测抗虫基因在棉花体内是否翻译成蛋白质,必需先从转基因棉花中提取蛋白质,再用相应的&&&&方法来确定是否已形成毒蛋白;如果在个体水平上鉴定抗虫基因是否转化成功,可以通过&&&&实验来实现。(3)Ti质粒的分子大小有200kb(千碱基对)左右,然而能进入植物细胞的只有一小部分约25kb(称为T—DNA)。在这一小部分的两端各有一个25bp(碱基对)长的重复序列LB和RB,这两个序列对这一小部分DNA进入植物细胞是不可缺少的。实验证明只要Ti质粒上保留了这两个序列,即使这两个序列之间的其它序列被不同程度地改变(如插入一个外源DNA片段),这一小部分也仍然可以转移并整合到植物的基因组中。①&在构建的T—DNA过程中,还应该具有和&等结构,才能保证进入植物体的抗虫基因能够顺利表达。②Ti质粒不同于其它质粒的最大特点就是它含有T—DNA,如果给你一个不含T—DNA的质粒,你如何把它构建成含有T—DNA的质粒?&&&&&&&&。&
本题难度:一般
题型:解答题&|&来源:2011-~2011学年度黑龙江省哈六中高二下学期期中考试生物试题
分析与解答
习题“(16分)下面是在农杆菌Ti质粒基础上构建的植物抗虫基因表达载体的示意图。请据图回答:(1)为了扩大基因表达载体的数量,需将基因表达载体再植入农杆菌中并对农杆菌进行培养,此时,在培养农杆菌的培养基中应加入___...”的分析与解答如下所示:
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经过分析,习题“(16分)下面是在农杆菌Ti质粒基础上构建的植物抗虫基因表达载体的示意图。请据图回答:(1)为了扩大基因表达载体的数量,需将基因表达载体再植入农杆菌中并对农杆菌进行培养,此时,在培养农杆菌的培养基中应加入___...”主要考察你对“基因工程、生物技术的安全性和伦理问题”
等考点的理解。
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基因工程、生物技术的安全性和伦理问题
与“(16分)下面是在农杆菌Ti质粒基础上构建的植物抗虫基因表达载体的示意图。请据图回答:(1)为了扩大基因表达载体的数量,需将基因表达载体再植入农杆菌中并对农杆菌进行培养,此时,在培养农杆菌的培养基中应加入___...”相似的题目:
科学家将人的生长素基因与大肠杆菌的DNA分子进行重组,并成功地在大肠杆菌中得以表达。过程如下图,据图回答:(1)过程(1)表示的是采取&&&&的方法来获取目的基因。(2)图中(3)过程用人工方法,使体外重组的DNA分子转移到受体细胞内,一般将受体大肠杆菌用&&&&处理,以增大细胞壁的通透性,使含有目的基因的重组质粒容易进入受体细胞。(3)为了检测目的基因是否导入了受体细胞内,请用所给的材料设计一个检测目的基因的实验操作过程。材料与用具:培养大肠杆菌的培养基、青霉素针剂、接种箱、接种环、培养箱等。操作步骤:①&&&&②接种待检测的经转导处理过的大肠杆菌③放入培养箱中培养④观察到的现象:&&&&⑤实验结论:&&&&(4)转基因技术有利有弊,请各举一例加以说明:有利方面:&&&&。有害方面:&&&&。&&&&
下列过程中,不出现碱基互补配对的是DNA分子的复制目的基因与运载体结合以mRNA为模板合成蛋白质RNA通过核孔转移到细胞质中
下列有关生物武器的相关叙述,错误的是&&&&生物武器各类包括病菌、病毒、生化毒剂,以及经过基因重组的致病菌等细菌武器具有传染性强、传播途径广的特点生物武器具有不受自然条件影响的特点中国在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器
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专利名称猪基因组假attP位点及其应用的制作方法
技术领域本发明属于生物技术和生物医学工程领域,具体涉及猪基因组的假attP位点及其应用。
背景技术运用各种分子手段将外源基因整合于猪基因组,赋予猪特定的性状,是推动猪用于基础科学、农业和医学研究的有效途径。从位点特异性的角度考查,外源基因的整合手段可分为非定点和定点两类。非定点型包括裸DNA显微注射、病毒介导、转座子等。虽然病毒介导和转座子在基因转移效率上有较大提高,但是由于识别位点的严谨性较低,整合特异性没有实质性改进,因此难以对整合位点进行严格控制,外源基因的表达也难以预期(马元武等.转座子SleepingBeauty和PiggyBac.中国生物化学与分子生物学报,) :783-787)。为了克服上述不足,各种定点型技术应运而生。基因打靶是最为准确的整合策略,但其依赖于同源重组,而自然条件下重组频率很低;此外,猪胚胎干细胞(ES)与诱导多能干细胞(iPS)技术目前尚未成熟,因此通过基因打靶实现外源基因的定点整合难度非常大(闻益波等.猪诱导性多能干细胞技术的研究进展及应用前景.遗传,) :307-313.)。研究人员随即转向位点特异重组技术(SSR, site-speccificrecombination),其中应用最为广泛的是Cre/LoxP、FLP/FRT系统。二者隶属于位点特异重组酶的酪氨酸家族,作用机理相似,均介导可逆重组反应,这就决定了二者介导外源基因定点整合的净效能仍然较低;而且实际使用中还需将其识别序列“预置”于基因组的特定位点,从可操作性的角度来讲难度反而增大(Nern A, et al. Multiple new site-specificrecombinases for use in manipulating animal genomes. Proc Natl Acad Sci U SA, ) :. )。ZFN (锌指核酸酶)和TALEN (转录激活样因子核酸酶)对识别模块(DNA结构域)和功能模块(FokI核酸酶)进行了巧妙结合,可借助细胞内的双链断裂(double-strand break, DSB)和非同源末端连接(non-homo logous end joining, NHE J)介导外源基因的定点整合,但实际中要设计和筛选高特异性和高亲和性的核酸酶并不容易(Gabriel R, et al. An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nucleasespecificity. Nat Biotechnol, ) :816-823.)。现实的困境促使研究人员开始探询外源基因在猪基因组内高效定点整合的新策略。在自然界,存在一类能够催化不可逆重组反应的位点特异修饰酶,成员包括4C31、TP901-1、Bxbl、U153等,其中以Φ C31整合酶的研究背景最为清晰。&i)C31整合酶来自链霉菌噬菌体,属于位点特异重组酶的丝氨酸家族,可催化两个不同的识别位点attB (细菌附着位点,bacterial attachment site)和attP (卩遼菌体附着位点,phageattachment site)之间的特异重组(Thorpe HM, et al. In vitro site-specificintegration of bacteriophage DNA catalyzed by a recombinase of the resolvase/invertase family. Proc Natl Acad Sci USA, ):.)。attB和 attP位点的主要特征是各在中间位置有一段“TTG”,作为重组“枢纽“,侧翼是两个反向重复序列。重组之后生成的是attL和attR杂合位点,不能再作为(i)C31整合酶的底物。因此该反应是单向性的,重组之后的基因结构非常稳定,这是该酶具有高效催化活性的一个重要原因。实验证实attB和attP最小活性序列长度分别为34bp和39bp (Groth AC, et al. Aphage integrase directs efficient site-specific integration in human cells.Proc Natl Acad Sci U S A, ) : .)。作为原核生物附着位点的 attB和attP,理论上在动物基因组内不会出现,但是研究发现&i)C31整合酶具有修饰未改造动物基因组(unmodified genome)的能力,这是因为动物基因组内存在与野生attP位点具有一定相似度的天然序列,被称为“假attP位点”(pseudo attP site),可作为&i)C31整合酶的锚定位点,介导外源基因的定点整合。现已在人、小鼠、果蝇、大鼠、牛、鸡等多个物种内发现了假attP位点。分析相关研究发现该类定点整合反应具有两个重要特点(I)基因整合效率高。Thyagarajan等将含有attB位点的荧光素酶报告载体和&tC31整合酶表达载体共转染人胚肾293细胞。经过抗药性筛选,稳定克隆的数量增加了 8. 6倍,荧光素酶的表达水平比无Φ C31组至少高10倍。这比Cre酶或FLP酶介导的整合入LoxP或FRT位点的活性高 10 100倍(Thyagarajan B, et al. Site-specific genomic integration in mammaliancells mediated by phage Φ C31 integrase. Mol Cell Biol,):.) 。在牛细胞内,&i&C31整合酶介导外源基因平均整合率是无&i)C31组的2. 7倍,在小鼠NIH 3T3细胞内,比率达到15. 47倍,而在鸡原生殖细胞(PGCs)内的整合率则提高20倍(Ma Qff, et al. Identification of pseudo attP sites for phage Φ C31 integrasein bovine genome. Biochem Biophys Res Commun, ):984-988;LeightonPA, et al. Genetic modification of primordial germ cells by gene trapping, genetargeting, and Φ C31 integrase. Mol Reprod Dev, ) : .)。(2)位点特异性好。动物假attP位点的数量有限,而且&i)C31整合酶有作用于“整合热点”的倾向性,整合特异性高。&tC31整合酶可在小鼠体外培养细胞、胚胎以及个体三个层次,有效识别同一位点mpsLl(Chr2)介导基因定点整合,该位点是小鼠基因组的整合热点(OlivaresEC,et al.Site-specific genomic integration produces therapeutic Factor IXlevels in mice. Nat Biotechnol, 2002,20(II):;Hollis RP, et al. Phageintegrases for the construction and manipulation of transgenic mammals. ReprodBiol Endocrinol, ) :79-83. )。BF4 (4q31)是牛基因组的整合热点,74% 的整合事件集中于该位点(57个克隆点中有42个是整合于BF4位点)(0u HL, et al. A Φ031integrase—mediated integration hotspot in favor of transgene expression existsin the bovine genome. FEBS Journal,
(I) : 155-163.)。此外整合酶还具有自主作用和介导单拷贝外源基因整合的优势。上述突出特点使得该酶在基因功能研究、基因治疗、生物反应器、转基因生物研制等领域展现出巨大潜力。然而,与此形成强烈反差的是,该酶在猪基因组修饰方面的研究尚无公开报道。发明人于2012年3月I日检索PubMed,以关键词“PhiC31 integrase”查询,检出文献113篇;以关键词“PhiC31 integrase pig “查询,检出文献为O篇。分析文献的发表时间,发现有关&i)C31整合酶的研究呈现迅速增长的态势年间为8篇,年间增至38篇,年间达到67篇。发明人查询到国家自然科学基金委近12年()共资助有关&i&C31整合酶的研究项目4项,均为近5年内立项,但没有与猪基因组修饰相关的项目。发明人登陆中国国家知识产权局(SIPO)和美国专利商标局(USPTO)网站,查询到与&i)C31整合酶有关的专利分别为10件和13件,均未涉及猪的研究。上述查询显示有关4C31整合酶的研究正逐渐引起重视,但其应用范畴有待拓宽。因此,本发明的目的在于分离和鉴定猪基因组假attP位点,并阐释其功能特征,为猪转基因技术提供新策略。
本申请的发明人通过构建含有attB序列的绿色荧光蛋白表达载体,并将其与4C31整合酶表达载体按照一定的摩尔比例转染猪肾PK15细胞,以G418筛选单克隆转基因细胞系。提取转基因细胞系的基因组DNA,采用热不对称PCR,分离外源基因的整合位点。通过与野生型attP位点比对,得到猪假attP位点。本发明所要解决的第一个技术问题是提供猪基因组内可被链霉菌噬菌体&i)C31整合酶识别的假attP位点,其40bp的识别序列为5’ CCAAGGATTTGGATTTCATC Tgt
gtatgctcagtactttt3’ (SEQ ID No. I);该位点在猪基因组的定位是I号染色体,watson链,坐标 4220126。本发明所要解决的第二个技术问题是提供上述假attP位点用于在猪基因组内整合外源基因,操作步骤包括(I)构建、制备含有attB位点的外源基因表达载体和Φ C31整合酶表达载体;
(2)将上述2种载体按照5:1的摩尔比例转染猪细胞;(3)G418加压筛选单克隆转基因细胞系。利用本发明提供的假attP位点,可以将外源基因在&i)C31整合酶的介导下以较高效率整合于猪基因组内。该假attP位点位于猪基因组的基因间隔区,不影响内源基因的表达,不影响猪细胞的正常生理功能,是一个安全位点。本发明将有力促进外源基因定点整合技术在转基因猪研究和生产中的应用。除非特别指出或是单独定义,本文所使用的科学和技术术语具有本发明所属领域技术人员共知的、无歧义的相同含义。本文所提及的所有已公开的专利申请和参考文献均已通过完整引用的方式并入本申请中。
图I含attB位点的绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-Cl-attB酶切鉴定右侧泳道为Lamda DNA marker,左侧泳道为AseI酶切pEGFP_Cl_attB载体产物,可见400bp的插入片段释放出来,证明attB核心序列已经成功构建到外源基因表达载体上。图2整合pEGFP-Cl-attB的猪转基因细胞系荧光照片右侧照片为单克隆转基因细胞系的亮视野,左侧为该细胞系的荧光照片。显示所有细胞发出均匀绿光,证明该细胞系的EGFP表达一致、强烈。图3染色体步移产物电泳图M为Ikb DNA ladder (Fermentas),右侧依次为步移第一轮、第二轮、第三轮的PCR产物。第二轮可见清晰的特异产物,第三轮可见单一、锐利的特异产物。图4整合位点的测序信号图
下划虚线表示猪基因组序列,下划实线表示pEGFP-Cl-attB序列。测序结果表明pEGFP-Cl-attB在attB枢纽处断裂整合到了猪基因组的特定位点。图55'整合位点的确认在整合位点的5'两侧设计跨界引物,扩增猪基因组DNA与外源基因之间的片段,反证外源基因的插入位置。M为DL2000 DNA Ladder,I号泳道为水作模板,2号泳道为pEGFP-Cl-attB表达载体作模板,3号泳道为未修饰猪基因组DNA为模板,4号泳道为IOng转基因细胞系基因组DNA为模板,5号泳道为IOOng转基因细胞系基因组DNA为模板。显示在转基因细胞系中,PCR扩增出540bp的特异片段,而在所有阴性对照中均无该片段。证明外源基因的插入位置与理论分析相符。图63'整合位置的确认在整合位点的5'两侧设计跨界引物,扩增猪基因组DNA与外源基因之间的片 段,反证外源基因的插入位置。M为DL2000 DNA Ladder,I号泳道为水作模板,2号泳道为pEGFP-Cl-attB表达载体作模板,3号泳道为未修饰猪基因组DNA为模板,4号泳道为50ng转基因细胞系基因组DNA为模板。显示在转基因细胞系中,PCR扩增出IlOObp的特异片段,而在所有阴性对照中均无该片段。证明外源基因的插入位置与理论分析相符。图7猪转基因细胞系EGFP表达量培养基和PK15上清为阴性对照,转基因细胞系的EGFP表达量由GloMax Jr荧光计测定。显示整合于本发明提供的猪假attP位点处的外源基因其EGFP表达量为阴性对照的50倍,证明该假attP位点可维持外源基因的高效表达。图8猪假attP位点的染色体定位利用BLAT工具,将本发明提供的猪假attP位点定位于猪基因组,发现该位点位于猪I号染色体的基因间隔区,其5’端邻近基因为L0C,3’端邻近基因为L0C。
具体实施例方式本发明以含有attB位点的绿色荧光蛋白表达载体为外源基因,以猪肾PK15细胞为宿主细胞,实施链霉菌噬菌体&i)C31整合酶介导的外源基因定点整合,并通过染色体步移技术分离得到猪基因组中可被链霉菌噬菌体&i)C31整合酶识别的假attP位点。在此基础上,对该位点的序列特征、基因组定位、外源基因表达等做出分析,阐明了该位点的功能特性。以下结合实施例和附图对本发明做详细的阐释。需要指出的是,本实施例仅用于解释本发明,而非对本发明的权利要求做出限制或限定。实施例I含attB位点的绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-Cl-attB的构建(I)主要试剂与材料来源pBCPB+载体购自 Addgene, pEGFP-Cl-EGFP 购自 Clontech。Lamda DNA marker和AseI限制性内切酶购自Fermentas。高保真DNA聚合酶KOD Plus及其配套的缓冲液(10 X buffer),dNTP, MgSO4均购自东洋纺生物科技有限公司。重组载体按照北京天根生物科技有限公司提供的小提中量超纯质粒抽提试剂盒说明书进行。DNA割胶回收试剂盒购自Qiagen公司。测序委托深圳华大基因有限公司完成。
扩增attB 序列的引物为 AttB-F:gtcattaatCGCCATTCAGGCTGCGCA(SEQ ID No. 2),AttB-R:gtcattaatCTCGGCCTCGACTCTAG (SEQ ID No. 3)。下划线序列表示 AseI 酶切位点。引物由上海英骏生物科技有限公司合成,以干粉形式分装、运输、保存。引物用TE缓冲液(ρΗ=8· O)稀释为10 μ mo I/L的溶液,_20°C保存备用。(2)操作步骤-以KODPlus扩增attB序列,反应体系组成为
1.猪基因组内可被链霉菌噬菌体4C31整合酶识别的假attP位点,其特征在于,其40bp 的识别序列为5’CCAAGGAirTGGAITTCATC Tgt gtatgctcagtactttt3’ ;该位点在猪基因组的定位是I号染色体,watson链,坐标4220126。
2.权利要求I所述假attP位点用于在猪基因组内整合外源基因,其特征在于,操作步骤包括
(1)构建、制备含有attB位点的外源基因表达载体和4C31整合酶表达载体;
(2)将上述2种载体按照5:1的摩尔比例转染猪细胞;
(3)G418加压筛选单克隆转基因细胞系。
本发明公开了猪基因组假attP位点及其应用,属于生物技术和生物医学工程领域。本发明从猪基因组中分离到1个假attP位点,与野生型attP位点有40%的序列相似度,具有回文序列特征。该位点能被链霉菌噬菌体фC31整合酶所识别,从而介导含attB位点的外源基因以较高的效率整合于此位点。经蛋白含量测定,该位点维持EGFP基因的表达水平是无外源基因组的50倍。本发明为猪转基因的定点整合与高效表达提供了新的技术方案,为猪功能基因组研究提供了新策略,因此具有重要的科学价值和广阔的应用前景。
文档编号C12N5/10GKSQ
公开日日 申请日期日 优先权日日
发明者毕延震, 郑新民, 乔宪凤, 刘西梅, 马卓, 张龙, 周荆荣, 华文君, 李莉, 肖红卫, 张立苹, 华再东, 魏庆信 申请人:湖北省农业科学院畜牧兽医研究所关注今日:59 | 主题:521825
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【求助】转染后如何证明外源基因整合到基因组了?
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这个帖子发布于7年零114天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我做了转染,用RT-PCR、细胞免疫荧光技术及Western blot均能检测到外源基因的表达。可是修稿的意见是如何证明转染的外源基因整合到基因组了?我不知道该怎么办了,因为看了很多发表的转染的文章也没有做这个证明啊。请高手指点我该如何修稿。
不知道邀请谁?试试他们
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那你有没有对细胞筛选啊?比如G418筛选,转染后如果RT-PCR、细胞免疫荧光技术及Western blot均能检测到外源基因的表达,说明瞬时转染成功。稳定转染的话还要进一步筛选的,筛选以后还要做一下RT-PCR、细胞免疫荧光技术及Western blot检测外源基因的表达水平,才能证明外源基因整合到基因组了。
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筛选以后还要做一下RT-PCR、细胞免疫荧光技术及Western blot检测外源基因的表达水平,才能证明外源基因整合到基因组了。 请问下,我的质粒是PcDNA3.1,带有MYC的,我该如何检测?只可惜我没有myc抗体
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哈哈哈,难道要你做southern?
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