&>&关于代码重构的好书籍（吐血推荐）
关于代码重构的好书籍（吐血推荐）
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代码重构 软件复用 设计模式 架构
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评论共有6条
还没看，先评论一下，不知道写的怎么样了
是我想找的，这里面主要写 java
收藏，好好学习一下！
看了一部分 觉得还不错
真心是本好书，我找了挺久的
不是我想找的，我想找的是关于 c c++的，这里面主要写 java
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透射电子显微镜三维重构技术及其在材料研究领域的应用
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透射电子显微镜三维重构技术及其在材料研究领域的应用
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3秒自动关闭窗口概述/电镜三维重构技术
电镜三维重构系统电镜三维重构技术是电子显微术、电子衍射与计算机图像处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术，尤其适于分析难以形成三维晶体的膜蛋白以及病毒和蛋白质-核酸复合物等大的复合体的三维结构。其基本步骤是对生物样品在电镜中的不同倾角下进行拍照，得到一系列电镜图片后再经傅里叶变换等处理，从而展现出生物大分子及其复合物三维结构的电子密度图。 近年来,电镜技术迅速发展,特别是电镜在生物学中的应用,目前已不仅停留在单纯直观的描述,而且已开展了由定性到定量,由平面到空间的立体研究。这对深人了解生物材料尤其是细胞成分的空间相对位置和生物大分子的空间结构及其与功能关系,都有十分重大的意义。与此同时,电镜技术正在逐渐与数学和物理学的有关领域结合起来,从而给生物科学工作者提供了很多定量的信息。其中,用傅里叶变换法(以下简称傅氏变换法)进行生物大分子三维重构的电镜技术就是一个相当突出的例子。&用普通透射式电镜在正常的工作电压(50一80千伏)下,样品厚度不宜超过0.1微米。因此,在观察组织、器官、大细胞时,需先制成超薄切片。在观察蛋白质分子、病毒时,不需切片,但在制片的干燥过程中,颗粒的细节也会彼此叠加,因此用电镜观察得到的结果实际上是一种平面的二维信息,它不能反映出物体结构中原有的内在的空间关系。如希望得到立体结构的信息,就要进行三维重构,即从二维信息中推导出三维信息。 二十世纪七十年代Taylor&K和Glaeser&RM开创了冷冻电子显微术（cryo-electron&,Cryo-ME）[1]，经过近三十年的发展，冷冻电镜技术已经成为研究生物大分子结构与功能的强有力的手段。最近几年冷冻电镜的发展在研究大分子结构上的分辨率已达到10-15&A。虽然不及Ｘ射线晶体学,但它具有许多独特的优势：可以对均一的（如膜蛋白的，二十面体对称的病毒等对称结构）不均一的（如核糖体等）样品用不同的方法进行三维结构重构，可以对生物大分子及其复合物或亚细胞结构进行测定，使小到蛋白质大到真核细胞的三维结构得以确定，分子量大小跨越了12个数量级。通过快速冷冻可以将样品保存在生活状态，其结构更接近功能活性状态；由于快速冷冻可以捕捉到反应过程的瞬时状态从而易于进行时间分辨层面上的研究，从而对一些反应瞬时过程，和反应中间体进行研究，有助于对蛋白质的动力学特性和功能的研究。
三维冷冻电镜技术将更完善的样品制备方法，先进的仪器设备，更好的成像方法和强有力的数据处理和运算方法结合起来，使结构测定的分辨率不断得到提高。样品制备主要采用快速冷冻的方法，以保持其天然活性；仪器设备则可采用场发射电镜和CCD（charge-coupled&detector,电耦合探测器）摄像系统；确定结构的方法主要有电子晶体学、单粒子法和电子断层成像技术，对于数据处理则主要借助各种软件和傅立叶变换的算法进行二位图像的三维重构以获得实物空间的三维结构。本文将在这几个方面介绍冷冻电镜三维重构技术及进展。原理电镜三维重构的思想早在1968年就由D.De&Rosier和A.Klug[2]提出，而冷冻电镜技术则是在1974年首次由Taylor&K,和Glaeser&RM创建。三维冷冻电镜技术主要是将样品保存在或液氦温度下利用透射电子显微镜进行二维成像，再经过对二维投影图像的分析进行三维重构。一、电镜三维重构理论
D.De&Rosier和A.Klug提出的三维重构理论是借助一系列沿不同方向投影的电子显微像来重构被测物体的立体构型；他们提出利用计算机数字图像处理技术进行电子显微像三维重构测定生物大分子结构的概念和方法。电镜三维重构思想的数学基础是傅立叶变换的投影与中央截面定理。中央截面定理的含义是一个函数沿某方向投影函数的傅立叶变换等于此函数的傅立叶变换通过原点且垂直于此投影方向的截面函数。因此电镜三维重构的理论基础是一个物体的三维投影像的傅立叶变换等于该物体三维傅立叶变换中与该投影方向垂直的，通过原点的截面（中央截面）。每一幅电子显微像是物体的二维投影像，倾斜试样，沿不同投影方向拍摄一系列电子显微像，经傅立叶变换会得到一系列不同取向的截面，当截面足够多时，会得到傅立叶空间的三维信息，再经傅立叶反变换便能得到物体的三维结构。这种方法可以在很广泛的范围内应用，从无固定结构特征的细胞器和生物大分子复合物到大分子晶体。在该理论的基础上，R.Henderson和N.Unwin建立了蛋白质电子晶体学。从20世纪70年代至今，蛋白质电子晶体学技术已逐步发展为蛋白质结构解析的的一种实用方法。二、三维冷冻电镜技术
冷冻电镜经过近三十年的发展,。冷冻电镜技术已成为研究生物大分子结构与功能的强有力的武器。这种方法采用高压快速液氮冷冻方法使在玻璃态的水环境中，这种环境接近于生理状态，减少了样品在制备过程中的结构破坏，使我们能够观察到生物大分子在天然状态下的结构。同时冷冻的速度极快，这就有可能把细胞在其生理活动（例如，收缩）的某些特定时刻固定下来，并进而显示此时的结构特点，进而可通过不同功能状态的瞬时构像变化来研究生物分子的功能。冷冻电镜获得的是处于天然状态下未经染色的分子的二维投影像。将样品进行不同角度的倾斜所获得的数据进行综合分析，并依据样品的不同特性使用不同的重构技术获得分子的结构。。由于样品未经染色，很容易受到电子束的损伤。将样品快速冷冻（样品处于玻璃态）并在低温下观察样品，一定程度上可以减少电子束对样品的损伤，因此称为冷冻电镜。为了使样品能够在整个成像过程中受到的辐射总剂量损伤最小，而又能产生可分辨的图像，大约只有10-20e/&A2（液氦温度下：4.3K）或5e/&&A2（液氮温度下：77K）可以用来成像，这样低的辐射剂量会导致图象信躁比（SNR）较低。因此要获得大量的图象来进行矫正和平均以增加SNR从而获得结构信息。场发射枪的应用提高了原始数据的质量，新的软件的应用使远距离显微操做和记录成为可能。电子晶体学，单粒子法，电子断层成像技术分别针对较小的对称结构，较大的不对衬结构和更大的亚细胞结构进行三维重构和功能研究。
相关应用/电镜三维重构技术
冷冻电镜单粒子法&电镜三维重构技术三维冷冻电子显微术已经在确定结构组成和大分子复合物的结构层次方面取得了重要进展。单粒子冷冻电镜技术是获得三位重构图像的重要的方法。单粒子法就是对分离纯化的颗粒状分子进行结构分析。既可以对有二十面对称结构的病毒或螺旋对称结构进行分析，也可以对象核糖体等大的可溶性复合物进行结构分析，还可以对溶解状态的膜蛋白进行分析。其基本原理是通过对相同的生物大分子某方向的投影显微像在时空中经调整后进行叠加，从而提高信噪比，最后将不同投影方向的单颗粒显微像在三维空间进行重构获得单颗粒大分子的三维结构信息。主要步骤可分为以下几点：1、制备化学和结构上均一的生物大分子的冰冻含水样品，2、选择最有可能能够产生最佳图像的最佳的和玻璃态冰厚度的样品，3、设定最佳的参数（比如：欠焦值、放大倍数和电子剂量等）记录这些样品区域的大量图像，4、用手工或半自动程序选择那些离散的分子形成的投影图，5、通过计算不同图像之间的相对方位来重组出复合物的三维结构模型。6、最后可以利用从晶体学或NMR获得的结构将原子坐标定位到密度图中。为了使结构的分辨率接近10&A或更高，也可以对在分离的和复合的大分子环境细微的结构差异进行校正[4&]不用结晶是该方法的最大优点，而且对于研究传统方法不易研究的大分子复合物像核糖体有很大优势。
由于低剂量的电子辐射使得图像的信躁比(SNR)非常低，要提高信躁比，就必须采集更多的图像数据，通常要求&10&000张，才能满足分子分辨率的要求，而要获得原子分平（~4&A）的结构需要上百万张图像[5，6]，若要人工处理这些数据将是一项耗时乏味的体力活，也因此成为冷冻电镜获得高分辨图像的一个瓶颈，因此需要发展自动化采集单离子图像的方法，该方法发展将成为冷冻电镜领域里一项重要课题。Nicholson,&W.V.等人在2001年的综述中把几种不同的单粒子选择方法归纳为五类[7]:1、Template-based&方法;2、edge&detection-based&方法;3、Intensity&comparision方法;4、Texture-based方法;5、Neural&network方法。近来大量研究小组在该领域里取得了重要的进展，出现了一些改进的方法，比如learned-based&方法[8],TYSON&local&variance方法[9],&两步法等[10]。Journal&of&Structural&Biology&145&(2004)&这一期集中介绍了在单粒子法中图像自动采集方法的研究进展。尽管运用冷冻电镜单粒子法还无法获得足够高分辨率的三维结构以建立条带结构模型，但测定的结构中可达到的分辨率已小于10&&A。随着计算机图象处理技术的发展尤其是图象自动采集技术的应用，数据收集会越来越快，分辨率也会逐步提高。
想要将三维冷冻电镜方法建立为测定三维结构的常规方法理论上，除了在颗粒图像选择方法上建立自动化技术外，还需要在各个步骤进行改进，实现自动化过程。包括样品制备，数据收集，结构校正，以及将X-ray图与电镜密度图重叠已获得更全面的信息。其中一些已取得了一定的进展.&图像探测技术对分辨率也有很大影响新一代的4K×4K&CCD（charge-coupled&detector）照相机可以在120KV电压下在10-15&A分辨率水平上进行扫描拍摄图像，并且可以在低放大倍数下从中央记录图像并确定玻璃化冰的厚度。
冷冻电镜单粒子法使我们在分子水平对生命过程有了新的认识。核糖体是一个由多种结构相互作用形成的RNA，他的结构解析是对这种技术应用的最好说明。从7&0年代Ｆrank开始对核糖体进行单以来&,二十多年的努力使得大肠杆菌70Ｓ核糖体1.5ｎｍ分辨率的三维结构已经得到揭示&
从这个三维结构模型中我们可以清楚地分辨出各RNA、蛋白组分和它们之间的连接关系。虽然一系列核糖体的三维晶体结构已有报道,&但单颗粒分析对于研究核糖体在蛋白合成过程中的结构变化仍是唯一有效的手段[12]。由于冷冻电镜可以捕捉到生物分子在不同活性状态下的瞬时构像，我们可以通过分子的构像改变来了解某个生命活动过程。转录的基本过程，mRNA剪接与移位便是成功的例子[13].核糖体合成蛋白质的整个循环过程中的不同&中间状态也已通过冷冻电镜确定。通过这些不同状态的密度图，我们可以确定tRNA和延长因子结合的顺序过程，同时也可描述自身的构像变化。这些运动是mRNA转位和链延长的基础。
理解生物大分子和大的复合物的反应机制是当今生物学领域里的一项重要目标。而完成这项任务的途径便是通过鉴定关键反应的中间过程并把握其特征。实间分辨（time-resolution）的冷冻电子显微镜便是一种方法，可使空间分辨率达1nm左右，时间分辨率达到数毫秒。冷冻电镜是仅有的从总体上来讲适合于在快速时间分辨率上研究大分子及其复合物的构象变化的一种方法。快速冷冻以捕捉反应中间体的可能性许多年以前就已经清楚了，但是只有在引入了喷雾方法以快速混合样品中的大的和小的分子并形成足够薄的样品以利于进行显微成像之后才变为可行。第二代时间分辨冷冻电镜仪器使用分档器和电喷雾技术[14]，运用冷冻电镜来研究生物大分子及其复合物的瞬时反应的构像。通过在几毫秒到几十秒的时间内将反应物快速冷冻以捕捉反应中间过程。将样品点到电镜铜网上并在液态乙烷中冷冻后使用计算机控制之后的显微步骤。为了获得最大的时间分辨率，在冷冻前可向已覆盖有一薄层反应物的铜网上喷洒含有另一种反应物的液滴。该过程是在电场作用下进行的电喷雾，每个载网需1-2μl的溶液进行喷雾，产生小于1μm的雾状液滴。第二种方法是冷冻前先将两种溶液用搅拌器混匀再点到载网上，这种方法用于反应时间大于1s的反应物。蛋白质反应的结构变化可以在10-15&s内发生，但像结构域的变化幅度较大，在毫秒刻度范围内发生，通过冷冻电镜可获得中等分辨率（~1nm）的解析。也可以通过X-ray和NMR技术获得原子分辨率的结构解析。
冷冻电镜获得的生物大分子复合物的7-9&A分辨率的结构信息中包含了单个蛋白质成分或结构域的生物信息，因此能够指导形成一种完整的复合物的折叠模型。用这种方法已获得了大稻毒6-8&A的结构，结合生物信息学提出了其主要衣壳蛋白的折叠模型。&电子断层成像技术
电子断层成像技术可用来研究细胞器或细胞结构，以及一些巨大的超分子复合物。对于电子断层成像技术，有两方面很重要，第一，是使用透射电镜进行断层成像，获得三维物体的二维投影像；第二是低温保存生物样品的天然状态。通过对同一样品每间隔一定角度拍摄一幅照片，通常是在-70°到+70°的角度之间，得到几十幅代表同一结构不同角度下的二维投影像，然后对这一系列投影像对正，用加权背投影的方法获得样品的空间结构。然而获得足够的一系列倾斜样品的证明是对技术上的一个挑战。主要问题是究竟需要多少断层图。我们获得的断层图像的分辨率依赖于样品的厚度和获得的相应投影图像的数量。这样，如果想获得厚度为0.25μm样品的分子分辨率（0.5nm）的图像，大约需要160张相同空间的投影图。该方法显示的是完整结构系统的静态结构信息，而冷冻电镜单粒子法是从成千上万的单粒子图象中重构出超微分子结构，是以生物分子的功能动力学为特点。样品制备同样很关键。冷冻含水技术虽说日趋成熟，但对电子断层成像来说仍面临挑战：1、样品的厚度超出了冷冻电镜的适用范围，这就要求有特殊的设备，采用高压冷冻或高速冷冻（slam-freezing）2、冰冻含水样品很难制成超薄切片，世界上只有少数几个实验室能做到，3、该技术需要对同一样品进行重复照射，自组装断层成像技术使电子辐射累计量达最低减少对样品的损伤。然而，这样的保护措施（样品不被固定也不染色）也有一定的弊端：包埋在无定型冰中的生物样品产生的投影像对比度很低，而且随着样品的厚度增加而降低。为此，通过在非常规的欠焦状态下成像已获得较高的对比度，也就是10nm或更高。另一种解决的方法就是通过滤掉非弹性散射电子来减少电子束对样品的损伤，对于较厚的样品可以使用较高的加速电压比如300KV以增加其穿透能力。
电子断层成像术的主要优势在于解决不具备周期性或全同性的生物大分子复合体系或细胞器的结构&,如线粒体、高尔基体、细胞等&,这些不具全同性的粒子结构是无法用其他方法解析的。通过电子断层成像术得到的细胞结构&,现在已能到&5ｎｍ左右的分辨率&,在这个分辨率下分子量大于&400ｋＤ的结构可以精确定位在细胞中。
电子断层成像技术构建的的全新结构，向传统教科书上的观点发起挑战。传统观点认为线粒体内膜向内突出形成冠状的嵴，而断层成像显示为内膜向内突起形成管腔结构。迄今为止，电子断层成像技术已广泛应用到快速冷冻（plung-freezing）的样品研究中去。自从快速冷冻和制作较厚的冷冻切片成为常规技术以来，快速冷冻法已已运用到800nm厚的样品上。分离的线粒体常以500-1000nm的大小出现，这就允许使用快速冷冻方法制备样品由于冷冻电镜的优越性，有望将断层成像技术应用到高压冷冻的组织上来。
冷冻电子断层成像技术对于观察处于细胞内天然状态的生物大分子复合物的三维空间状态有着独特的优势。该方法是基于对保存在玻璃样冰中的处于天然状态的细胞经过不同的倾斜角度进行电子显微成像，再将这些电子显微像进行三维重构。5-8nm的分辨率图像已经获得，并且分辨率还在不断提高。既然许多细胞内的生命活动都是由在20-50nm范围内的复合物来执行，那么目前的分辨率足够获得他们的断层图像。然而，其他成分产生的噪音信号和细胞内各成分的密度叠加使解释工作变得困难。最近断层图像数据可以在真核细胞外进行采集，断层成像技术已开始揭示真核细胞在天然状态下其内部结构的分子水平分辨率的三维结构。这些观察代表了几年来在自动数据采集，图像重构和低温保存技术进步的一个巅峰。Baumeister小组报道了将冷冻电子断层成像技术第一次因应用到完整的体外真核细胞上的结果。该研究描述了Dictyostelium&discoideum.粘菌的离散细胞特点。Dictyostelium细胞的冷冻电子断层了核糖体、蛋白酶proteasomes，和通过肌动蛋白相关蛋白在空间上将肌动蛋白纤维连接而形成的网络结构。电子晶体学X-ray晶体学与生物电镜的结合形成电子晶体学，综合了三维密度图和傅立叶变换数学理论，这可追述到D.De&Rosier和A.Klug对尾部的螺旋结构的研究工作上[2]。通过获得已制好的结构规则的二维晶体的高分辨率电子密度图，我们可以解析出它的原子水平结构，螺旋对称样品或二十面体对称的病毒结构可用此方法获得高分辨率的结构。到目前为止。电子晶体学仍只能对二维晶体样品的结构研究达到原子或接近原子的分辨率水平[18]，要利用电子显微学方法测定蛋白质的结构，首先必须得到在二维方向上高度有序且足够大的蛋白质二维晶体。二维晶体的三维傅立叶变换在中表现为一系列的衍射点,晶体的结构信息就存在于这些衍射点中。晶体的振幅可直接从电子衍射谱测出,而相位可以从电子显微像的傅立叶变换得到,将两者整合并进行逆傅立叶变换就获得了晶体相应投影方向的结构密度图。其三维重构则是通过倾转样品,拍摄不同转角下的电子衍射谱和电子显微像,获取不同转角下的振幅和相位信息,最后将这些信息在三维倒易空间中拟合,并加入相应的晶体学对称,通过逆傅立叶变换得到实空间的晶体结构。
自从D.De&Rosier和A.Klug于1968年第一次用该技术重构出Ｔ4尾部的三维空间结构以来[2],共有4种膜蛋白的原子分辨率的结构通过电子晶体学方法确定下来,即(bacreriorhodopsin)[18]、植物捕获光能复合体Ⅱ&(plant&light&narvesting&complexⅡ)[19]、水通道(aquaporin)和乙酰胆碱受体(acetylcholine&receptor)。还有一些得到了0.4~0.9nm分辨率的三维结构,如视紫红质(rhodopsin)、植物光系统ＩＩ反应中心(plant&photo&systemⅡ&reaction&centre)、H+ATP酶、微体谷胱转移酶(microsomeal&glutathion&transferase)、蛋白转运通道(SecYEG)、间隙连接子(gap&junction)及Ｎａ+&Ｈ+转运蛋白(NhaA)等。还有一些水溶性蛋白,如微管蛋白(tubulin)也通过电子晶体学的方法得到了高分辨率(0.35nm)的三维结构。另外一大批膜蛋白或水溶性蛋白获得了1～2nm低分辨率的结构。以上高分辨率的结构都是以片状的二维晶体为对象解析出来的。但有一些蛋白并不形成这种片状的二维晶体,而是形成螺旋对称的管状晶体,如肌质网钙ＡＴＰ酶及乙酰胆碱受体等。另有一些蛋白在体内就以螺旋对称的纤维形式存在,如肌动蛋白及一些病毒粒子(如烟草花叶病毒)。这类呈螺旋对称的结构其优势在于一张照片中包含了各个角度的蛋白像,因此不需要倾转样品,在数据收集上相对简单。而缺点就是含有的晶胞数较少、信噪比低,分辨率没有典型的二维晶体高,至今最高分辨率是乙酰胆碱受体0.&40ｎｍ分辨率的三维结构。
电子晶体学一个不可比拟的优势在于通过这种方法得到的是膜蛋白和膜相关的水溶性蛋白在膜环境中的结构信息,和Ｘ射线晶体学相比更反映生理状态下的真实结构。下面,我们将以植物的光系统Ⅱ捕光叶绿素a/b蛋白复合体为例说明电子晶体学研究的优势。植物的光系统Ⅱ捕光叶绿素a/b蛋白复合体(LHCⅡ)是高等植物及绿藻体叶绿体中类囊体膜上含量最多的整合型膜蛋白复合体,它最重要的生物学功能是吸收光能并传递到光反应中心,这是光合作用的第一阶段。解析LHCⅡ的结构对于从本质上探索光合作用的过程和机理具有非常重要的意义。到目前为止,还没有植物LHCⅡ的三维结晶化及结构解析的报道,对于该结构解析最好的结果来自于电子晶体学。Kuhlbrand等人从豌豆的叶绿体中分离纯化了LHCⅡ,采用重组脂双层法得到了大面积的高度有序的LHCⅡ的二维晶体。通过对冷冻样品的电子晶体学分析得到了0.34ｎｍ分辨率的原子模型[7],此分辨率下的模型可提供大量的原子间位置关系和相互作用的信息,能帮助人们了解这个蛋白复合体光能吸收和能量传递的机制。
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