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求助：耻垢分枝杆菌的电转，最后长不出菌落是怎么回事，求大神帮忙分析下
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大家好，我最近在电转耻垢分枝杆菌，但最后平板上没有长出菌落来步骤：一、耻垢分枝杆菌感受态的制备
1、 将实验室的M.s菌种接种到2×YT无抗性固体培养基（含0.5%的glycerol）中，待长出单克隆后，挑单克隆至5ml 2×YT无抗性液体培养基（含0.05%的Tween 80）,37℃，180rpm,培养过夜。
2、将上述活化的菌种以1:100的比例接种于200ml 2×YT无抗性液体培养基中，37℃，180rpm培养至OD600值为0.6后，冰浴45min.
3、集菌，4℃，5000rpm，10min 集菌
4、再用冰浴的10%的甘油洗涤3次后，再用甘油重悬至OD600 值0.8.再每管300ul分装，储存在-80°冰箱中二、电转
1、4mm口径电转杯75%酒精泡过夜、生物安全柜中紫外照射0.5h、风干
2、取出感受态冰上融化，加入2ul 的pMV261的重组质粒，冰浴20min,同时将4mm的电转杯于冰上预冷
3、将以上混匀的液体转移至电转杯中，擦干电转杯上的水
4、电转：电转仪器参数设置：电压2500V，电容25uF，电阻1000Ω，口径4mm.电转后观察电转时间18-25ms为好。
5、电转后立刻向内加入1ml
2×YT无抗性液体培养基,混匀后加入到1.5ml Ep管中，至于37℃，180rpm， 2h
6、5000rpm,1min 离心，弃上清 ，剩下的全涂于含50ug/ml Kt的 2×YT固体培养基中，培养3天这些是我实验的步骤，但是不知道为什么最后都长不出克隆来，求大神分析呀。。
不知道邀请谁？试试他们
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是的，短消息配额用完了发不出去
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lyb6968 是的，短消息配额用完了发不出去首先我们用的pMV261是一种穿梭质粒，它并不表达蛋白，用大肠杆菌中我们一般用DH5a使其扩增，我们用耻垢分枝杆菌是相对于结核里的致病菌而言的，因为耻垢和致病菌只差一个基因功能区，而且pMV261电转到上面后，我们构建在其上的基因也可以得到表达。。
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默笙佑 首先我们用的pMV261是一种穿梭质粒，它并不表达蛋白，用大肠杆菌中我们一般用DH5a使其扩增，我们用耻垢分枝杆菌是相对于结核里的致病菌而言的，因为耻垢和致病菌只差一个基因功能区，而且pMV261电转到上面后，我们构建在其上的基因也可以得到表达。。噢～如果不表达蛋白的话我好像还是用不了，我看文献里也是把重组质粒转到了有缺陷的同种菌株内，然后表达出了耐药性，我们没有缺陷菌株，所以只能是想单纯把目的基因转到另一种菌株比如大肠里来表达
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lyb6968 噢～如果不表达蛋白的话我好像还是用不了，我看文献里也是把重组质粒转到了有缺陷的同种菌株内，然后表达出了耐药性，我们没有缺陷菌株，所以只能是想单纯把目的基因转到另一种菌株比如大肠里来表达还是谢谢啦，解答了我好多疑惑
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求问楼主现在在哪里？我需要用电转化仪，但是联系不到构建的公司，方便联系一下吗？
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关于丁香园简介/耻垢分枝杆菌
纤细杆菌，长3.0~5.0，有时弯曲，有分枝或Y形细胞；细胞偶尔膨胀，内有珠状或卵形深染色小体。培育5天后抗酸染色可能不规则(10~80％的细胞抗酸)。蛋培养基稀释接种，培育2~4天后，生长丰茂，菌落细皱至粗褶，乳脂白色。常见光滑有光泽奶油状菌落。有色菌落稀少，但可见于老培养物和不含蛋的培养基上。在油酸卵蛋白琼脂上有粗糙菌落，略呈圆顶形、颗粒状。圆顶状，中央有暗色颗粒，边缘窄、整齐、半透明。
生长特性/耻垢分枝杆菌
&25~45℃生长。少量接种对、小鼠、大田鼠或小鸡无致病性。分离自包皮垢。一度常见于土壤和水中，近来不常分离到。可以种特异性敏感素、免疫扩散和免疫技术鉴定的均一类群。
万方数据期刊论文
中国人兽共患病学报
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申请可获得以下专属权利：
贡献光荣榜处理分枝杆菌的方法
专利名称处理分枝杆菌的方法
相关申请的交互参考本申请是日提出的美国申请08/224,592的部分后续申请，而上述申请又是日提出的美国申请08/222,731的部分后续申请。
背景技术A.分枝杆菌和疾病结核分枝杆菌(MTB)是当今世界上最常见的传染性疾病结核病(TB)的致病因子。世界卫生组织(WHO)报道17亿人(或大约为全世界人口的三分之一)目前正在或已经受到结核病感染(Kochi，A.Tubercle 721-6(1991))。结核病的传染在1991年以全世界新增加8百万病例的速度发生(Sudre，P.et al.，Bull.W.H.O.92))，且世界卫生组织估计在90年代期间将有8千8百20万人将患结核病，在此期间，每年大约将有3百万人死亡(Morbidity and Mortality Weekly Report 42(No.49)96l-964(1993))。1992年，在美国，疾病防治和预防中心(CDC)记录有26，673例结核病患者(Morbidity and Mortality Weekly Report 93))，估计美国有1千万至1千5百万人已受结核病的潜伏感染(Morbidity and Mortality Weekly Report 39(RR-8)9-12(1990))。
MAC复合体的分枝杆菌(主要为鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌)作为人的病原菌的重要性最近由Inderlied，C.B.et.al.，Clin Mi-crobiol.Rer.3)作过评述。在爱滋病病人中，由于它们作为机会病原菌发生，因而增加了MAC感染。大约有43％的爱滋病病人在发病早期，表现为传播的MAC感染(Nightingale etal.，Jour.Infect.Dis.5(1992))。世界卫生组织估计，目前已有近3百万人患有爱滋病，大约有1千5百万人已经感染了人免疫缺陷病毒(HIV)，到2000年，受感染的人的数量可上升为约4千万(世界卫生组织(ducument WHO/GPA/CNP/EVA 93.1)Global Programme on AIDS(1993))。除了与爱滋病有关的传染外，副结核分枝杆菌，作为鸟分枝杆菌的一个亚种(Thorel，M.F.etal.，Int.J.Syst.Bacteriol.90))，被认为与Crohn氏病(即一种肠部炎症)有关(Chiodini，R.J.Clin.Micro.Rev.290-117(1989))。
分枝杆菌的传染在动物上也是一个问题。副结核分枝杆菌也引起反刍动物的肠炎(Thoen，C.O.et al.，Rer.Infect.Dis.1))。这更通常地被称为Johne氏病。检测为Johne阳性的牛被剔除并消毁掉。在威斯康辛州，大约三分之一的牧群受到感染(Collins，M.T.，Hoard’s Dairyman Feb ))，1983年的财政损失估计为5千2百万美元(Arnoldi，J.M.et al.，Proceed-ings，3rd Int.Symp.World Assoc. Vet. Lab. Diag. 3))。在全国范围内，牧群中的发病率一般介于3％至18％之间(Merkal，R.S.et al.，J.Am.Vet.Med.Assoc.(1987))。单这一疾病对奶牛工业造成的财政损失每年超过15亿美元(Whitlock，R.Proceedings of the Third International Colloqium onParatuberculosis pp 514-522(1991)；Whitlock，R.et al.，Proceed-ings of the 89th Annual Meeting of the United Stares Animal HealthAssociation，pp 484-490(1985))。
除以上讨论的微生物外，还有多种分枝杆菌也被认为是人类病原菌，包括麻风分枝杆菌，堪萨斯氏分枝杆菌，海分枝杆菌，偶发分枝杆菌复合物以及许多其他分枝杆菌。Wayne，L.G.et al.，Clin.Micro.Rev.51-25(1992)综述了与该属微生物有关的种种传染。然而，这些感染的数量和损失在规模上与MTB复合物和MAC感染并不一样。例如，麻风病在这类疾病中可能是最常见的全世界估计有5千5百万麻风分枝杆菌病例(Nordeen，S.K.et al.，Int.J.Lepr.93))。总体上认为，这组生物迫使付出巨大的社会代价。B.分枝杆菌的培养和检测当前的对分枝杆菌感染的实验室诊断方案相对较为缓慢。因这些细菌固有的较慢的生长率，必须延长培养。由于这种较长时间的诊断，对怀疑有感染的个人要进行检疫，否则一般会给社会造成显著的危险。
此外，分枝杆菌感染的实验室确诊对每个病人样品需几种培养物。在样品可被报告为阴性之前，每个样品必须培养长达八个星期(对副结核分枝杆菌则须十六周)。需要对每种可疑样品的多重培养的部分原因是由于有可检测数量的分枝杆菌的周期性脱落，以及由于用来钝化腐生微生物的严厉的化学去污造成传染性有机体的丧失。这些程序的效率较低，常常杀死其试图提取的分枝杆菌。例如，通过用推荐的N-乙酰-L-半胱氨酸-NaOH(NALC/NaOH)程序(Kent，P.T.et al.，“Public Health Mycobacteriology，”in A Guideforthe Level III Laboratory，U.S.Department of Health and HumanService，Centers for Disease Control，(1985)pp.31-46)处理已知可杀死28％-33％的现存的分枝杆菌(Krasnow，I.et al..Am.J.Clin.Path. 66)；Kubica，G.P.W.et al.，Am.Rev. Resir.Dis.63))。对培养技术进行补充的现代探针检测的问世(Gonzalez，R.et al.，Diag.Microbiol.Infect.Dis.869-78(1987)改进了进行诊断的时间；然而，尚有进行重要改进的余地。
社会重要性和对培养方法的依赖性两者一起揭示出关键是需要一个分枝杆菌检验方案，该方案减少迂回的时间并增加灵敏度。正由Gen-Probe，Inc.(San Diego，CAJonas，V.et al.，J.Clin.Micro.6(1993)商业化的等温方案和聚合酶链反应(PCR)都具有检测单个分子的潜力(Higuchi et al.，Nature(Lon-don)(1988))。而且，扩增和检测可以在约8小时内完成，这些试剂并不明显地增加费用。如果可获得的话，一种扩增试验将大大增加检测的速度和灵敏度，且可减少分枝杆菌的诊断费用(De Cresce，R.P.et al.，Med. Laboratory Obs. 3))。这些技术可有力地诊断分枝杆菌侵染，其快捷性将对社会产生巨大的财政影响。
然而，正如这里所描述的，研究人员在努力使这些技术如PCR扩增适应分枝杆菌的检测中已面临过多的问题。尤其是还不可能建立一种以某种方式制备供分析的样品的方案，该方案(a)保证真正阳性结果的扩增试验检测，同时(b)不产生错误的阴性结果。Noord-hoek，G.T.et al.，J.Clin.Micro.94)的研究也具体地说明研究人员面临的易变性。这些作者描述了七个实验室参加的盲性研究。所有实验室使用相同的扩增系统，但是利用不同的处理和检测方法。这些结果的原始总结(Noordhoek，G.T.et al.，N.Eng.J.Med.3))一致表明在较低的拷贝数(1000个拷贝)时，相关性变化为2％到90％，平均为54％。由于这些问题，目前尚没有可利用的FDA批准的TB-扩增试剂盒。C.处理分枝杆菌样品的方法一篇与系统设计，样品处理技术和临床研究相关联的有关分枝杆菌-核酸扩增的参考性科技文献综述揭示出高度可变的结果，该结果阻止了FDA批准TB-扩增试剂盒。
已经使用了两种不同的扩增方案；现有为数众多的PCR系统设计方案和许多临床研究，这些都是针对分枝杆菌传染的，绝大多数是针对结核分枝杆菌的(MTB)。典型地说，样品首先作培养处理，然后再进行扩增。因此，在大多数情况下，供扩增的样品制备可被认为是培养处理方案的延续。
有几种该领域已用这种方法推定的原因。首先，获得临床样本是困难的。已诊断为MTB的患者个体一旦诊断后都开始药物治疗。第二，处理MTB样品需要专有的遏制设施和经过适当培训的技术人员。第三，它是最容易获得“培养相关性”结果的途径；即，扩增的阳性和阴性结果与培养为阳性或阴性的结果的相关性。结果，研究人员已典型地处理供培养的样品，然后使用“进一步”处理供扩增的沉淀的方案。通过这种方式，利用实际的临床标本，遏制也不能被突破，工作流程不被打断，病人的护理也不遭致破坏，与当前的方案的相关性是可行的。以上所述的“进一步”处理涉及多种样品制备和细胞裂解技术。
表1总结了35篇发表的文章，利用来自17个不同国家的样品，评价了临床实验室中扩增技术的效果。表1中的文章是按年代顺序描述的。已作了各种努力以便准确地代表原文的意思。然而，在某些情况下存在模棱两可的解释，某些文章有与众不同的特征。在随后的注释中着重进行了阐明。
核酸扩增结果与培养结果的相关性被选择为比较表1中所示的研究的基础。利用这种观点，该分析揭示出了猜不透的谜按照表1中概括的方法，用于扩增的样品绝大多数情况下来源于用来接种培养物的“菌蕾”。假设有与培养有关的扩增的灵敏度，一种培养物阳性/扩增阴性(例如，错误的阴性扩增)并没有直观意义。几个作者提出了“正确的相关性”(见表1中注释C)。例如，如果获得几个错误的阴性，可通过对靶DNA作进一步的提纯，稀释抑制剂，对同一样品多次扩增，对同一病人的不同样品多次扩增，或对扩增的样品重新扩增来对结果进行解析；从而得出正确的结果。
这引入了一个有趣的窘境。Jackson，J.B.et al.，J.Clin.Mi-cro.8(1993))成功地提供了HIV-PCR质量保证组(包括11个实验室)。报告的灵敏度说明，所有实验室都具有在106个人细胞背景下可日常鉴定HIV基因组2个拷贝的能力。这里综述的表1的研究强烈地说明TB-扩增技术的灵敏度是相似的。从表1研究的讨论显而易见的是，尽管用于分枝杆菌检测的这些扩增技术的灵敏度预期比培养的或涂片的数量级大，但离期望有一致的偏差。虽然某些反常是由于抑制作用并因此也容易解释，但许多反常现象是“不能解释的”。将会十分清楚的是，即使使用内标物来检测抑制剂，这些不能解释的偏差也是合理平常的，照此给在临床实验室中为检测分枝杆菌的核酸扩增技术的合法性造成一个重大的障碍。例如，当为阳性或怀疑为阳性时，可以重新检查，一般地阴性则不重新检查。由于经常会出现假阴性，实验室无法知道哪些样品为真正的假阴性，哪些样品需要“重新分析”。结果，由于诊断出现了错误的阴性，病人的护理也遭致破坏。因此，为了讨论此处发表的技术的目的，利用了该技术的不正确的数据。这些偏差-假阴性-是余下要讨论的焦点。
表1文献报导的培养结果与核酸扩增结果的相关性表1中的每一例研究，处理方案都为缩写(见脚注A)，评价的临床样本的数量与相应的培养物和扩增阳性样品(见脚注B)相应的数量一起阐述，并表示出了“未校正的”培养相关性(见脚注C)。选择了35个研究，是因为提出的扩增结果与培养结果之间有明显的可比性。Shankar，P.et al.，Lancet 1)；de wit，D.et al.，Tu-bercle and Lung Dis.792)，和Kaneko，K，et al.，Neurology 8(1990)的研究被省略，是因为据此没有明显的可比性。
(A)除了Hermans，P.W.M.et al.，J.Clin.Micro.3(1990)，DEWit，D.et al.，J.Clin.Micro.1(1990)，Del Portillo，P.et al.，J. Clin. Micro.8(1991)，Irula，J.V.et al.，J.Clin.Micro.4(1993)，可能还有Thierry，D.et al.，J．Clin.Micro.3(1990)外，所有的研究都是首先处理培养的样品。一般地，使用所有的样品处理技术都总结于Kent，P.T.et al.，“Public Health Mycobacteri-ology”in A Guide for the Level III Laboratory，U.S.Department ofHealth and Human Services，Centers for Disease Control，1985，pp.31-46。用来描述临床样品处理的符号如下“NALC”指Kubica，G.P.W.et al.，Am.Rev.Resir.Dis.63)描述的N-乙酰-L-半胱氨酸/氢氧化钠液氏/清除方案。按照Hirsch，S.R.et al.，J.Lab.Clin.Med.69)，“DTT”是指利用二硫苏糖醇处理分枝杆菌。“SDS”(十二烷基磺酸钠)是指Eng-baek，H.C.et al.，Scand J. Respir.Dis.67)的方案。“Fic/Hyp”是指按Boyum(Boyum，A.J.Clin.Lab.Invest.21(Suppl.97)77-109(1968)的方法后供提纯外周血单核细胞(PBMC)的聚蔗糖/泛影纳制剂梯度方案。“NaOH”指作者特定的氢氧化钠清除方案，或者为直接引用作者未陈述清楚的特定的清除方案。“OxAc”指使用草酸(Corper，H.J.et al.，J.Lab.Clin.Med.30))。“PEG”指作者特定的使用聚乙二醇沉淀。“TriPO4”指Collins，et al.，Organization and Practice in TuberculosisBacteriology，Buttersworth，London，1985的三磷酸方法。处理的样品总是离心产生一个“菌蕾”(沉淀)。用水或磷酸盐缓冲液(PBS)重新悬浮菌蕾，然后取等份样进行培养和涂片。剩余的沉淀然后作扩增处理。附加于处理设计的下标“P”指在作进一步的供扩增处理之前对重新悬浮的沉淀再次离心，它是研究中使用的离心沉淀。附加于处理设计的下标“S”指通过离心澄清上清液，它是研究中使用的上清液。在培养处理之后，几个作者比较了不同的制备供扩增的样品的方案只包括供实际研究用于制备样品的方案。文章中限定了比较样品制备的那些研究，也讨论了这些发现的结果。使用了下列缓冲液缩写于“TE”＝Tris/EDTA，“TX”＝Tris/Triton-X100，“TEX”＝Tris/EDTA/Triton-X100和“NonI”＝Tris/Tween20&NP-40。下标“W”指用括号里的缓冲液的洗涤步骤。“GenBuf，”“IDEXXBuf”和“PCRBuf”指分别用Gen-Probe缓冲液或IDEXX缓冲液(其成分未知)或PCR缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，2.5mM MgCl2，0.45％Tween 20，0.45％NP-40)悬浮/重新悬浮样品。“CHCl3，”“HCl”和“perCl”分别指在处理步骤中包括氯仿，盐酸和高氯酸。“PrK”和“LZ”指用蛋白酶K和/或裂解酶对样品进行酶解消化，包括煮沸或在极端温度下处理的任何步骤简化为在规定的时间内95℃。“Org/ppt”指有关有机化合物(包括苯酚，氯仿，和/或异戊醇)或其组合的任何抽提方法，紧接着用乙醇或异丙醇沉淀核酸。在这方面，有许多变化，但是所有方法均与Ma-niatis，T.et al.，“Molecular Cloning A Laboratory Manual”，ColdSpring Harbor Laboratory，New York，1982，pp458-463)中的方法相似。“TMA”指用沉淀DNA的季铵或与Baess，I.Acta Path.Microbiol.Scand.Sect.B 74)的方法相似的多糖。“GuSCN/Si”指按(例如)Boom，R.et al.，J.Clin.Microbiol.90)描述的在硅存在时用异硫氰酸胍从样品纯化DNA。“Sonic”是指经对样品进行声处理(在有或没有玻璃珠存在时)释放DNA。
(B)在某一指定的研究中，使用的临床样品总数量的后面先是紧接着培养阳性的数量，然后是扩增阳性的数量。该栏中其他的脚注指描述该研究有关的特征。
(C)表示出扩增结果和培养结果之间未校正的相关性(如，扩增阳性样品的数量也是培养阳性，被培养阳性的总数量相除)。几个作者进一步地考查了不一致的结果(如，“假阴性”或“假阳性”)，或结合病人情况来分析，发表了校正的结果。该栏中列出的相关性指未校正的结果。如果发表的结果与该栏目中列出的结果存在偏差，括号中的数量用适当的脚注解释了这种差异。
(D)Shankar，P.et al.，Lancet 0)没有明确地阐述用来处理供培养或PCR的样品的方案。然而，Manjunath，N.etal.，(Tubercle 1))阐明他们发表的文章是Sbankar，P.et al.，Lancet 0)研究的最初工作的最终看法。因此，为了讨论的目的，假定处理条件与Manjunath，N.et al，Tuber-cle 1)的条件一致。
(E)Hermanns，P.W. M.et al.，J. Clin. Micro.3(1990))的研究直接处理供扩增的原始样本(如，样本不作培养处理，沉淀被分开作培养和PCR分析)。
(F)Pao，C.C.et al.，J.Clin.Micro.0(1990)没有给出PCR的未经校正的结果。然而，他们确实认为“如果最初的结果为阴性，第一次扩增反应混合物的一部分(通常为1/5)可以再扩增32个循环……”因此，最初的可能是假阴性。
(G)在Sj_bring et al.，J.Clin.Micro.4(1990)研究中对应于这一假阴性PCR结果的斜线只产生单一菌落。其他三个培养/PCR阳性样本直接处理进行扩增。
(H)DEWit，D. et al.，Tubercle and Lung Dis.92)的研究只使用胸膜液体。原始的样本直接通过PEG沉淀，并用于扩增。
(I)Thierry，D.et al.，J.Clin. Micro.3(1990)指出“DNA从0.2到1ml的原始的或氢氧化钠清除的临床样本中抽提出……”因此，为了讨论的目的，假定样本可以直接用于扩增。
(J)Pierre，C.et al.，J.Clin.Micro.91)讨论了处理临床样品的两种方法。他们没有明确地阐明哪种方法用于研究。然而，他们确实提出“在某些情况下，样品的一部分……”用第二种非离子溶解方法进行处理。他们同时阐明在这些样品中发现了更多的抑制剂。因此，为了讨论的目的，假定有机抽提是该研究中使用的最初方案。
(K)Pierre，C.et al.，J. Clin.Micro.91)利用了一个“重新扩增”方案，其中把试管打开，一部分转移到一个新的PCR混合物中重新扩增。用最初的扩增，其结果为79.2％，重新扩增后结果为100％。
(L)Del Portillo，P. et al.，J. Clin. Micro. 8(1991)的研究直接处理痰进行扩增。
(M)Brisson-Noёl，A.et al.，Lancet (1991)检验了514个样本，但只有446个进行了PCR和培养。
(N)Brisson-Noёl，A.et al.，Lancet (1991)使用的系统是针对65Kd蛋白质设计的，可扩增多数分枝杆菌。在141个培养的阳性样本中，130个为MTB，111个为MOTT(非结核病分枝杆菌)。在141个样本中，126个通过PCR扩增为阳性，6个为假阴性，9个含有抑制剂。因此，与培养的相关率为89.4％(126÷141＝0.894)。报道的相关率为97.4％，包括用抑制剂清除样品和对病人的资料进行分析(如临床高度怀疑PCR为阳性/培养阴性的样品)。
(O)Sritharan，V.et al.，Mol Cell.Probes 1)实际上比较了8种释放供PCR的DNA的不同方法。该研究选择煮沸的方法。
(P)Sritharan，V.et al.，Mol.Cell.Probes 1)阐述的相关性为100％，代表3个样品的重新扩增，这些样品在第一次PCR时为假阴性。未校正的相关性为96.0％。
(Q)Van der Giessen，J.W.B.et al.，J.Clin.Microbiol.9(1992)比较了设计来检测牛粪中副结核分枝杆菌的3个PCR基本系统(McFadden，J.J.et al..Mol.Microbiol.7)；Van der Giessen，J.W.B.et al.，J.Med.Microbiol.92)；Vary，P.H.et al.，J. Clin.Microbiol.90))。其中之一为得自IDEXX(Vary，P.H.et al.，J.Clin.Microbiol.90))的商业上已应用的试剂盒。在该研究中，他们分二个不同的批次用所有三种方法检测了87个样品。培养物只检测一次(培养_＝30)，而每个PCR运行二次，因此有二组数值。
(R) Buck，G.E.et al.，J.Clin. Micro. 4(1992)实际上比较了4种不同的释放DNA供PCR分析的方法。所示的声处理的方法被选择用于研究。此外，该研究中所有的样品已知为TB-阳性，所有样品也为涂片阳性。
(S)Victor et al.，J. Clin.Micro.7(1992)分散所有的沉淀，或者直接进行扩增，或者通过蔗糖密度梯度进一步提纯样品。两种方法的结果都可用于讨论。
(T) Fauville-Dufaux et al.，Eur. J. Micro. Inf. Dis. 92)阐明样本通过用SDS或三磷酸处理。他们没有进一步区分哪种样品通过哪种方法处理。
(U)Fauville-Dufaux et al.，Eur.J. Micro.Inf. Dis. 92)使用的一对引物是针对85个序列的抗原而设计的。结果，他们的系统能够扩增大多数分枝杆菌种。在206个处理的样品中，92个为培养阳性。在这92个样品中，84个通过PCR最初为阳性(91.3％)。在92个样品中，82个被鉴定为MTB。在这82个样品中，只有74个通过PCR最初鉴定为阳性(90.2％)。而8个非阳性样品看来含有抑制剂，3个样品可以被稀释至可以观察到阳性信号的水平。因此，通过分析，作者阐明82个中的77个(93.9％)可通过PCR作正确的鉴定。作者报道其相关性为93.9％。
(V)Wilson，S.M.et al.，J.Clin.Micro.93)比较了2种不同的释放DNA供PCR分析的方法。该研究中对所有的样品均使用两种方法，因此有两个相关性。此外，Wilson. S.M.et al.，J.Clin. Micro.93)使用套有“一个试管”的方案。
(W) Wilson，S.M.et al.，J.Clin.Micro.93)指出GuSCN/Si方法的相关性为75％，氯仿方法的相关性为92％。这代表“病人的结果”。该栏中指出的相关性代表发表的“单个样本”结果的相关性。此外，该研究中所有的样品都重复二次，以消除偏差。
(X) Folgueria，L. et al.，J. Clin. Micro. 1(1993)比较了两种不同的释放DNA供PCR分析的方法。所示的煮沸法被选择用于研究。该研究中所有的样本已知为TB-阳性。
(Y)Folgueria，L.et al.，J. Clin. Micro.1(1993)阐述的培养和PCR之间的相关性为100％，并且代表需要对抑制剂稀释的7个样品。未校正的相关性为90.7％。
(Z)Kocag_Z，T.et al.，J.Clin.Micro.8(1993)比较了两种不同的制备供PCR分析的沉淀的方法。所示的煮沸法被选择用于该研究。
(α)Kocag_T，T.et al.，J.Clin.Micro.8(1983)使用的“金标准”为“临床上高度可疑”。尽管对这一标准阐述的相关性给定为87％，但与培养的相关性为100％。
(β)Forbes，B.A.et al.，J. Clin. Micro. 4(1993)最初测定了173个样品，使PCR尽可能完善。他们然后检测了727个样品。这两个研究的资料可用于讨论。
(γ)Forbes，B.A.et al.，J.Clin. Micro. 4(1993)阐明检测的727个样品的相关性为87.2％。这一灵敏度包括病人的资料与分析型PCR阳性/培养阴性样品相结合。表2中的此项工作表明80个MTB培养阳性，67个被PCR挑选出。因此，未校正的灵敏度为83.8％。
(δ)Irula，J.V.et al.，J.Clin.Micro.4(1993)只使用血样做研究。此外，该研究的目的是鉴定与MTB相对的鸟分枝杆菌。
(ε)Clarridge，J.E.et al.，J. Clin. Micro.6(1993)阐述了几个培养相关性数值。培养阳性MTB样本的实际数量被认为是218个，该组内PCR阳性的数量为181个(见表2中的此项参考)。因此，记载的供讨论的未校正的相关性为83.0％(ξ)MiyaZaki，Y.et al.，J. Clin. Micro. 2(1993)使用一个套用的PCR系统(如，第一次反应的样品实际上被转移至新鲜的PCR混合物中，重新扩增)并鉴定了56个中的54个为培养阳性(96.4％相关性)。然而，有10个样品为培养阴性/涂片阳性/PCR阳性。包括了这10个样品在内，作者阐述的相关性为97.0％(64÷66＝0.970)(η)Jonas，V.et al.，J.Clin.Micro.6(1993)的研究只使用了Gen-Probe已商业化的专有的扩增方案。
(θ)在Jonas，V.et al..J.Clin.Micro.6(1993)的研究中，其中的119个培养阳性样本中，只有95个被扩增挑选出(79.8％)。有21个样本为培养阴性/扩增阳性。作者认为，这21个样本中只有17个为真正的阳性。包括这17个样本在内的结果表明扩增鉴定的136个中的112个为真正的阳性。这增加了对报道的灵敏度82.4％。
(ι)在Abe，C.et al.，J.Clin.Micro.4(1993)的研究中，所有的样本被平分，以使得自Gen-Probe方法(Gen)的结果可以与得自KoLk，A.H.J.et al.，J.Clin.Micro.5(1992)描述的PCR系统的结果可以比较。
(κ)Abe，C.et al.，J.Clin.Micro.4(1993)分析了几个不一致的结果，认为Gen-Probe方法的相关性为91.9％，PCR的相关性为84.2％。忽视这些差异的解析给出相关性分别为90.6％和81.3％。Gen-Probe扩增的灵敏度似乎好于PCR获得的灵敏度。
(λ)Miller et al.，J.Clin.Micro.94)使用的主要扩增方案正由Gen-Probe商业化。然而，他们确实把这些结果与Eisenach et al.，J. Clin.Micro.5(1988)的PCR系统获得的结果进行了比较。虽然按Gen-Probe方法对所有750个样品进行了扩增，但只有那些被认为为阳性的样本(156个)才通过PCR进行扩增。
(μ)Miller et al.，J. Clin.Micro.94)的研究中，156个样本为“经过培养证明和/或临床诊断[具有]结核病。在这156个样本中，只有142个实际上为培养阳性。利用Gen-Probe方案，156个中的131个(83.9％)样本为阳性。因而，“用用同一处理的沉淀的不同等份样重新检测样本增加到检测出156个中的142个(91.0％)。”以这一方式提出的实际数据几乎不可能确定这一数量是否代表与培养的相关性。156个阳性的PCR扩增最初鉴定出122个(78.2％)样本。重复PCR测定鉴定出了143(92.3％)个样本(PCR的灵敏度似乎勉强比Gen-Probe方法要好)。还有一些涂片阳性的样本，它们最初经两种方法的检测为阴性。所有涂片阳性样本经过重复检测进行鉴定。
(υ)Pfyffer et al.，J.Clin.Micro.94)通过两种不同的方法(NALC和SDS)产生沉淀，并用Gen-Probe的方法扩增了所有的沉淀。对每一类方法，样本都是独特的(例如，同一样本通过一种或其他方法但不是两种方法进行处理)。
(ξ)在Pfyffer et al.，J.Clin.Micro.94)的研究中，42个NALC样本为培养阳性，39个(92.9％)通过扩增进行了鉴定。36个SDS样本为培养阳性，35个(97.2％)经扩增进行了鉴定。然而，作者解析了扩增阳性/培养阴性结果，并认为NALC沉淀扩增正确地鉴定了49个中的46个为“真正的阳性”(93.9％)，SDS沉淀的扩增正确地鉴定了39个中的38个为“真正的阳性”(97.4％)。
(π)Bodmer et al.，J.Clin.Micro.7(1994)使用Gen-Probe扩增方案。
(_)指示了作者讨论抑制作用或抑制剂是造成假阴性的因素的那些研究。
(_)指示了作者讨论低拷贝数是引起假阴性的因素的那些研究。
(§)指示了作者讨论的统计漏失(dropouts)现象或与统计漏失一致的现象(这将包括“不能解释的”结果)，或讨论由凝块加剧引起的反常结果的可能性的那些研究。
(ψ)指示了观察为培养阳性/涂片阳性/扩增阴性样品的例子的那些研究。D.表1的研究对表1中发表文献报道的数据研究表明，不管什么系统设计或样品处理技术，在结果方面都变化很大。这些研究确实包括所有可能来源的样品；包括痰，支气管洗涤物，胸膜液，胃气，脑脊椎液，尿，活组织检查物，骨髓，浓肿及渗出液，血，血清，腹膜液及排泄物。使用两种不同的扩增方案30个研究仅使用PCR，3个研究用Gen-Probe(Jonas，V. et al.，J. Clin. Micro. 6(1993)；Pfyffer et al.，J. Clin. Micro. 94)；Bodmer et al.，J.Clin.Micro.7(1994)正商业化的等温的、逆转病毒类型的、专有的扩增方案，两个研究比较了两种扩增技术(Abe，C.et al.，J. Clin.Micro.4(1993)；Miller et al.，J.Clin.Micro.94)。33个研究针对MTB的检测，一个研究是针对鸟分枝杆菌诊断检测(Irula，J.V.et al.，J.Clin.Micro.4(1993))，一例研究是试图检测副结核分枝杆菌(Vander Giessen，J.W.B.et al.，J. Clin. Microbiol. 9(1992))。在大多数样本类型中，不管是什么靶标，处理技术或扩增技术，都能发现假阴性结果。
表1中报道的研究样品数量从7个到1,166个样本。与培养的相关性范围为3％到100％。35个研究中的9个(26％)声称100％的相关性。然而，绝大部分，9个中的7个(78％)包含的样品数量不到100个(n＜100)样本。只有两个研究(Manjunath，N.et al.，Tu-bercle 1)；Pao，C. C. et al.，J. Clin. Micro. 0(1990)使用了100多个样品(然而，Pao，C.C.et al.，J.Clin.Micro.0(1990)可能已经重新扩增以努力证实阴性样品见表1中的脚注F)。或者，35例研究中的26例(74％)表现了不到100％的相关性。在这一组中，26个中的20个(77％)使用样品的数量大于100(n＞100)。在扩增-培养相关性和样品大小之间似乎有一种相反的相互关系一般地，研究中包括的样品数愈多，相关性则愈低。
表1中，35例研究中的32例(91％)表现出扩增能够检测培养阴性样本中分枝杆菌DNA的存在(剩下的3个研究中的2个已知仅为阳性样本)。这些32个中的2个比培养阳性的数量大二倍多(Ir-ula，J.V.et al.，J.Clin.Micro.4(1993)；Pao，C.C.et al.，J.Clin.Micro.0(1990)，非常接近这一数量的三倍(Kolk，A.H.J.et al.，J.Clin.Micro.5(1992)；Manjunath，N. et al.，Tuberck 1)；MiyaZaki，Y.etal.，J.Clin.Micro.2(1993))。31位作者直接指出(或参考实验事实指出)在理想的体外条件下，他们的系统具有检测10个或低于10个拷贝存在的能力。余下4个的灵敏度范围为15至40个拷贝(Altamirano，M.et al.，J.．Clin.Micro.6(1992)；Hermans，P.W.M.et al.，J.Clin.Micro.3(1990)；Pao，C. C.et al.，J.Clin. Micro.0(1990)；Soini，H. et al.，J.Clin. Micro.8(1992))。培养为阴性的样品，通过扩增为阳性，它们更容易比培养阳性-扩增阴性样品得到解释与培养相反，PCR不需要有生命力的有机体。例如，已知处理是杀死有机体，药物治疗可能已经使生命力受到损害，结合有降低生命活力的低拷贝数可能都有助于前一类样品。不管系统参数如何，扩增相对于培养或涂片都应该具有相对优越的灵敏度。
在35例研究中，使用8个不同的方法处理原来的样本。7个研究通过用N-乙酰-L-半胱氨酸/NaOH(NALC)处理供培养和扩增的样品，6个研究使用十二烷基磺酸钠(SDS)，3个研究使用氢氧化钠(NaOH)，2个研究使用二硫苏糖醇(DTT)；草酸(OxAC)，聚乙二醇(PEG)和聚蔗糖-泛影钠制剂(Fic/Hyp)梯度方法各使用一次。一个研究实际上是比较了由NALC与SDS进行处理(Pfyffer et al.，J.Clin.Micro.94)。三个研究避免使用培养沉淀，直接处理供扩增的样品。在获得的100％相关性的9个研究中，3个使用NALC，3个直接处理供扩增的样品，一个研究使用SDS，一个研究使用草酸和一个研究使用PEG。记住这些研究中的7个利用的样品数量不到100(n＜100)，在原来的样品如何处理和理想的相关性之间得不出什么结论。Pfyffer et al.，J.Clin.Micro.94)的研究比较了NALC和SDS处理，结论是这两种方法都不优越。
供扩增的处理的沉淀的制备(或直接为样品)分为7个基本类型(i)16例研究使用了Maniatis，T. et al(“Molecular Cloning ALaboratory Mannual，”Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1982)，pp458-463)描述的有机物抽提和酒精沉淀方法变化的方法；(ii)2个例子使用了Higuchi，R.Amplification 21-3(1989)描述的酶解和煮沸方案(Lz/Prk_95°/15′)，6个例子简单地煮沸样品；(iii)10个例子使用了声处理(声的)；(iv)3例使用Boom，R.et al.，J.Clin.Microbiol.90)描述的离液序列高的试剂和玻璃珠，和2个使用了把DNA结合于硅上的类似的方案；(v)一例使用了蔗糖梯度分级分离(Victor，T.et al.，J.Clin.Micro.7(1992)；(vi)一例使用了de Lamballerie，X.et al.，Res.Microbiol.(1992)描述的Chelex-100；和(vii)一例(Van der Giessen，J.W.B.et al.，J.Clin.Microbiol.9(1992))使用了制造商(Vary，P.H.et al.，J.Clin.Microbiol.90))建议的柱层析方法。总数多于35个是因为Van der Giessen，J.W.B. et al.，J. Clin. Microbiol.9(1992)，Victor，T. et al.，J. Clin. Micro.7(1992)，Wilson，S.M.et al.，J.Clin.Micro.93)和Abe，C.et al.，J.Clin.Micro.4(1993)，Miller etal.，J. Clin. Micro.94)和Pfyffer et al.，J.Clin.Micro.94)的研究用不止一个方案处理所有样品，并对每种方法进行了分析。声称100％相关性的9个研究中的8个通过有机物抽提/乙醇沉淀方法来分离DNA。然而，也利用有机抽提方法的8个研究相关性的变化为55.9％到98.4％。声称100％相关性的一例研究是通过煮沸法进行处理(Kocag_z，T.et al.，J.Clin.Micro.8(1993))。此外，利用同一方案的6个研究报道的相关性在78.9％和95.9％之间。7个研究实际上是比较了制备供扩增的培养物沉淀的方法。他们的结论有如下不同Pierre，C.et al.，J.Clin.Micro.91)选择有机物抽提/乙醇沉淀；Wilson，S.M.et al.，J.Clin.Micro.93)简单地用氯仿处理；Folgueria，L.et al.，J.Clin.Micro.1(1993)优选酶裂解/煮沸法；Kocag_z，T.et al.，J.Clin.Micro.8(1993)和Sritharan，V.et al..Mol.Cell.Probes 1)选择简单的煮沸方法；Forbes，B.A.et al.，J.Clin.Micro.4(1993)和Buck，G.E.et al.，J.Clin.Micro.4(1992)确定声处理为最适方法(只有Kocag_z，T.et al.，J.Glin.Micro.8(1993)的研究达到100％相关性)。看来假阴性的发生不仅不依赖于用来制备扩增样品的方案，而且围绕这一问题也有争议。
两个研究实际上比较了扩增方法Abe，C.et al.，J.Clin.Mi-cro.4(1993)表明Gen-Probe方法只是勉强地比PCR要好(见表1中脚注κ)，而Miller et al.，J.Clin.Micro.94)测定的结果却相反(见表1中脚注μ)。显然，两种扩增技术对TB感染的临床诊断并没有赋予显著优点。E.PCR抑制剂在报道相关性低于100％的文献中，17例研究把扩增“抑制剂”认为是假阴性的起作用的因子(见表1中带有“_”上标的那些作者)。血(Panaccio，M.et al.，Nucl，Acids Res.1)，粪(Allad，A.et al.，J.Clin.Microbiol.7(1990))，痰(Hermans，P.W.M.et al.，J.Clin.Micro.3(1990)；Shawar，R.M.et al.，J.Clin.Micro.3))和尿(Khan，G.et al.，J.Clin.Pathol.91))都含有PCR抑制剂。此外，就痰，支气管洗液和气管呼气。这些样品的粘度(粘液含量)与疾病状态之间有直接的关系结核早期病人有最多的粘痰，这些样品带有扩增抑制剂的可能性最大。Hermans，P.W.M.et al.，J.Clin.Micro.3(1990)和Shawar，R.M.et al.，J.Clin.Micro.3))指出在有痰存在时，灵敏度分别下降5-20倍和5倍。
在表1中陈述的供处理的42种方法中，只有12个不体现某种形式的缓冲液的相互交换。例如，有机物抽提/沉淀，沉淀带的洗涤或使用离液序列高的试剂(GUSCN/Si)的方案在某些时候都需要缓冲液的相互交换。然而，沉淀的声处理却不需要交换缓冲液。这十二个研究中，没有一个可以获得100％的相关性，在这一组中的九个把抑制剂认为是假阴性的作用因子。抑制剂似乎来源于样品和用于处理的溶液，这两种来源对临床扩增技术的实施提出了明显挑战。F.低拷贝数，统计漏失和“不能解释的”结果统计漏失，也称为“样品偏斜”，是由于低拷贝数引起的；在一个具有极低拷贝数的样品中，从中取出一些等份，存在着某些等份不含靶标的可能性。这些等份，当被解释为假阴性时，是“真正的扩增阴性”。表1中的8个研究描述了一种可由这类样品偏斜解释的现象(见表1中带有§下标的那些作者的名字)。正如下面讨论的，聚集作用会大大加剧这种现象。
在报道的相关性不到100％的文献中，15个是把“低拷贝数”直接地认为假阴性结果的决定因子(见表1中带有下标_的那些作者)。15个中的6个，加上3个其他的，给出的一些例子中，其阴性扩增样品为培养阳性和涂片阳性(见表1中带有下标ψ的那些作者的名字)。据报道，酸快速染色的检测限为每毫升痰中有7,800至9,500个有机体(Hobby，G.L.et al.，Antimicrob.Ag.Chemother.494-104(1973)；Yeager，H.et al.，Amer.Rev.Resp.Dis.(1967))。Clarridge，J.E.et al.，J.Clin.Micro.6(1993)对假阴性作了广泛的分析(见这篇文献的表7)。在详细分析的37个假阴性样品中，26个显示出漏失，而11个为“真正的”PCR阴性。这些37个中的9个为涂片阳性这些9个中的4个含有抑制剂，3个没有作抑制剂检验，2个发现没有抑制剂。在这最后2个样品中，一个是真正的PCR阴性。Shawar，R.M.et al.，J.Clin.Micro.3)也报道培养阳性-涂片阳性-PCR阴性样品没有发现抑制剂。如果样品不含抑制剂，且为涂片/，培养阳性，“低拷贝数”不可能是实际的可能性。Shawar，R.M.etal.，J.Clin.Micro.3)把这类假阴性称为“不能解释的”。G.离心期间分枝杆菌的分层分枝杆菌的浮力性质早在1924年就已明确(Andrus，P.M.etal.，Am. Rev.Tuberc.399(1924))。从此之后，几例研究着重解决沉淀分枝杆菌的困难(Hanks，J.H.et al.，J.Lab.Clin.Med.38)；Hata，Jr；D.et al.，Dis.Chest 50)；Klein，G.C.et al.，Am. J. Clin. Pathol. 52)；Ratman，S.et al.，J. Clin.Microbiol.86)；Rickman，T.W.et al.，J.Clin.Microbiol.80)；和Robinson，L.et al.，J.Lab.Clin.Med.1)。在几种情况下，培养上清液被认为是标准的实施方法。
虽然几个研究报道了上清液部分含有涂片阳性物质(HanRs，J.H.et al.，J.Lab.Clin. Med.38)；Rickman，T.W.et al.，J.Clin.Microbiol.80)，另一个研究指出，所有样本的88.8％和82.4％分别在2000rpm和3000rpm下离心，上清液为培养阳性(Klein，G.C.et al.，Am.J.Clin. Pathol.52))。事实上，同一研究指出，分别在2,000rpm和3,000rpm下离心的所有样本的2.2％和2.7％中，沉淀为培养阴性而上清液为培养阳性。在当代实验室手册中，还讨论了对上清液部分的分析(Kent，P.T.et al.，“Public Health Mycobacteriology”in AGuide for the level III Laboratory，U.S.Department of Health andHuman Service，Centers for Disease Control，(1985)pp.31-46；Sommers，H.M.et al.，“Mycobacterium，”inManual of ClinicalMicrobiology，E.H.Lennetteet al.，eds.，4th ed.，Am.Soc.Mi-crobiol.，Washington，D.C.(1985)，pp.216--248)。
样品数量和相关性之间相反的关系可由浮力现象有效地解释。大量的样品需要成批处理。在成批处理过程中，最早和最后样本检查之间花费的时间要增加。随着这一时间的增加，浮力有大量的时间发生作用。有人认为这种浮力来源是这些有机体的高类脂含量(Silverstolpe，L.Nord.Med 40/22(1948))。H.细胞壁和表面张力对分枝杆菌回收的影响分枝杆菌细胞壁的性质决定了其生存顽固性。显微照片显示出非常复杂的30-40nm厚的结构(Rastogi，N.et al.，Antimicrob.Agents Chemother.81))。多达细胞壁干重60％的为类脂(Joklik，W.K.et al.，Zinsser Microbiology 20th edition，Appleton&Lange，Norwalk，CT(1992)，pp.499)。
分枝杆菌的细胞壁有三个不同的层次(i)肽葡聚糖，(ii)阿拉伯半乳聚糖，和(iii)糖脂(细胞壁的综述见McNeil，M.R.et al.，Res.Microbiol.(1991)。霉菌酸，具有高度的疏水性，主要由碳氢链组成(∑＝C76-C80)，广泛地用于阿拉伯半乳聚糖和糖脂层的构建。在Takayama，K.et al.，“Structure and Synthesis ofLipids，”inThe Mycobacteriaa Source Book，Part A，G.P.Kubicaet al.，eds.，Marcel Dekrer，Inc.New York，NY(1984)，pp.315-344。中评述了霉菌酸的结构和种类分布。
结核分枝杆菌在生长过程中形成“索状”(索状为大量有机体的凝块或聚集物)，在MTB毒性和索状形成体之间存在着直接的关系(Joklik，W.K.et al.，Zinsser Microbiology 20th ed.，Apple ton &Lange，Norwalk，CT(1992)，pp.503)。MAC复合有机体在其细胞壁中具有另外的糖脂(C-mycoside)(Brennan，P.J.Rev.Infect.Dis.11(Supp.2)s420-s430(1989)中总结了serovars之间的区别)。在培养物中，虽然MTB复合有机体看来可以形成致密的凝块，鸟分枝杆菌却以一种更弥漫的，单个细胞方式生长(Dubos，R.J.et al.，J.Exp.Med.46))。
Dubos，R.J.Proc.Soc.Exp.Biol.Med.45)观察发现，通过加入山梨聚糖单硬脂酸的聚氧亚烷基衍生物(Tween60CAS_No.)可以改善培养的MTB的标志菌膜生长。这一观察后来被扩展到用来说明其他的类似的衍生物可以使MTB表现为“迅速”、“弥散”和“浸没的”生长特征(Dubos，R.J.etal.，J.Exp.Med.46))。吐温-80(CAS_No.)被发现在这方面是最有活性的。这些作者认为浸没的生长是由于细胞表面的“可湿性”。术语“可湿性”在上下文中只使用于表面张力上。这些研究的结论是菌膜生长导致了蜡层和水相之间的表面张力以及加入吐温80可减轻这种物理相互作用。
如果表面张力把有机体局限于表面，这与形成菌索结合起来可以解释异常结果病情很重的病人被具有菌索形成性质的有机体感染。此外，大菌索产生涂片阳性结果，培养物也很快变为阳性。大菌索也将加剧样品偏离因为大菌索以单一拷贝分布，但具有成千上万拷贝的潜力。结果，正如Klein，G.C.et al.，Am.J.C1in.Pathol.52)所认为的，微生物将很容易地在上清液部分涌出，从而加快了样品偏离现象。此外，菌索化也将使细菌产生分层，以致出现涂片/培养阳性和扩增阴性结果。
如果异常的结果是表面张力和凝聚引起的，那么通过加入非离子去垢剂就可以克服表面张力和凝集作用，这些试剂应改进培养相关性似乎是合乎逻辑的表1中的5个研究使用非离子去垢剂，在扩增之前洗涤沉淀(Clarridge，J.E.et al.，J.Clin.Micro.6(1993)；Irula，J.V.et al.，J.Clin.Micro.4(1993)；Kolk，A.H.J.et al.，J.Clin. Micro.5(1992)，Shawar，R.M.et al.，J.Clin.Micro.3)；and Sritharan，V. et al.，Mol.Cell.Probes 1))。在这一子集中，与培养的相关性范围为78.9％至95.5％。早在1941年，人们即认识到，降低表面张力的因子在通过离心以增加细菌的回收上是无效的(Robinson，L.et al.，J.Lab.Clin.Med.1)。I.MAC复合有机体独有的问题在表1的35例研究中，27个使用了MTB扩增和/或检测的特异序列。6个研究使用了属特定引物，但是设计却优选扩增TB复合有机体。只有Irula，J.V.et al.，J.Clin.Micro.4(1993)的研究针对鸟分枝杆菌，只有Van der Giessen，J.W.B.，J.Clin.Microbiol.9(1992)针对副结核分枝杆菌。Irula使用了一种不同的分离技术，使比较很困难。然而，虽然分离出了PBMC，但事实上它们在Tris/EDTA/Triton X-100中要经历一个洗涤步骤如果在洗涤过程中PBMC具有溶解作用，细菌将与上清液一起可能被弃掉。无论如何，可能预期PBMC分离是一种特别有效的捕获有机体的方法。Van der Giessen的研究比较了三个PCR基本系统(McFadden，J.J.et al.，Mol.Microbiol.7)；Van der Giessen，J.W.B et al.，J.Med. Microbiol.92)；Vary，P.H.et al.，J.Clin.Microbiol.28(1990)，这些系统设计用来检测牛粪中的副结核分枝杆菌(其中之一是IDEXX已商业化的可用的试剂盒(Vary，P.H.et al.，J.Clin.Microbiol.90))。他们的结果比表1中描述的任何其他的东西要更糟，并且似乎显得是假性降低。这些结果指那些MAC复合有机体，其多余的类脂成分给扩增处理提出一个更加不明确的复杂问题。J.分枝杆菌的内在特性阻碍了扩增技术的开发显然，有两种主要的假阴性来源。首先，在多种多样的样品类型中有丰富的抑制剂，制备的溶液在改进扩增反应的效率方面也起一定作用。第二类是由于分枝杆菌的内在特性。尽管这些特征的来源似乎很明显，但这些特异反应性对灵敏度的影响是如此的普遍，以致Noordhoek et al.，J.Clin.Micro.94)认为“我们将不能推测解释七个实验室中PCR灵敏度的极端差异的可能因素……”这些有机体的菌索化和浮力性质使它们以一种无效的方式分层，且随上清液一起被倾去。该情形的一个极端的例子造成“不能解释的”结果培养阳性和涂片阳性的样品面对多次扩增似乎为真正的阴性，但不含抑制剂。显然，这些特征的来源和性质尚待充分的解释。然而，以这些有机体的内在特征为基础的这些现象正是本文描述的方法所解决的问题。
发明概要认识到目前用于后续分析和培养的分枝杆菌制备方法中的问题，并认识到需要一种快速、便宜但准确的方法用来准备检测分枝杆菌用的生物和非生物的样品，本发明发明人研究了制备这些分枝杆菌样品的提取方法。
这些研究在分枝杆菌的检测的处理方法方面达到了顶点，包括经培养检测，特别是经例如扩增，尤其是核酸扩增方法检测，首次有效克服了本领域认识到的产生假阴性和统计漏失的问题。本发明发明人发现本文称为“类SB-18去垢剂”的两性离子去垢剂令人惊奇和出人意料地分散分枝杆菌。所有类SB-18去垢剂明显破坏这些有机体的浮力性质。对于MTB复合体中的分枝杆菌，其聚集作用强，分散似乎成为提高回收效率主要的动力。对于其它以单个细胞生长的分枝杆菌，例如MAC复合体，提高回收的动力似乎是通过去垢剂的积聚抵消浮力。对于那些既非MTB复合体又非MAC复合体的分枝杆菌，在样品制备方案中，包含这些去垢剂可消除本领域类似的导致假阴性扩增的问题。
发明人还发现，当给分枝杆菌除气时，原先无补偿浮力能力的另外的去垢剂同样可改善回收。推测，除气消除浮力，使表面张力成为限制有机体在培养基表面的唯一剩余因素。若给出适当条件，绝大部分去垢剂具有克服表面张力的能力。尽管这些去垢剂不能消除MTB复合体中的聚集，因而不能消除样品偏差的现象，但是它们确实能通过离心提高收集效率。发明人指出，对于MAC复合有机体和其它主要以单个细胞生长的分枝杆菌，有一种特殊类型的去垢剂与限制除气相结合，可有效地提高回收效率。
本发明的方法一般适用于任何微生物，特别是在其细胞壁中含有分枝菌酸或类分枝菌酸脂类的那些微生物，如包括棒状杆菌(具有含棒状杆菌酸的脂)和诺卡氏菌(具有含诺卡氏菌酸的酯)。本发明的方法也普遍适用于供任何微生物检测的生物样品的处理。
附图简要说明附图说明
图1是点杂交(印迹)实验，表明NALC/NaOH样品提取液对PCR的抑制作用。
图2是描述“处理试验”的一个草图设计用来模拟处理临床样品中分枝杆菌的体外方案。
图2A是点杂交结果，表明当用水为提取液时，如图2所示的体外处理过程中结核分枝杆菌的回收效率。
图3表示向提取液中加入0.1％TritonX-100的效果。
图4是描述“聚集试验”的草图设计用来估测去垢剂分散结核分枝杆菌能力的方案。
图4A表示试图分散分枝杆菌的点杂交结果。显示了三种有代表性条件下的数据水、0.1％吐温80和2mM的SB-18。
图5表示在提取液中包含2mM的SB-18时体外处理鸟分枝杆菌和结核分枝杆菌的效果。
图6表示提取液中用不同的SB-18的离子同系物体外处理结核分枝杆菌的点杂交结果。
图7表示在提取液中用不同的SB-18系列去垢剂时体外处理结核分枝杆菌的点杂交结果。
图7A表示在提取液中用不同的SB-18系列去垢剂时体外处理鸟分枝杆菌的点杂交结果。
图8表示在提取液中用椰子树羧基甜菜碱(例如，类SB-18去垢剂)体外处理结核分枝杆菌的点杂交结果。
图9表示当提取液中用含有各种电荷组合和结构关系的甜菜碱时体外处理结核分枝杆菌的点杂交结果。
图9A表示当提取液中用有各种“桥”结构的甜菜碱时体外处理结核分枝杆菌的点杂交结果。
图9B表示当提取液中用有各种烷基和烷基“连接键”结构的甜菜碱时体外处理结核分枝杆菌的点杂交结果。
图9C表示当提取液中用具有完全来源于天然油的疏水结构域的甜菜碱时体外处理结核分枝杆菌的点杂交结果。
图9D表示当提取液中用具有完全来源于天然油的疏水结构域的甜菜碱时体外处理结核分枝杆菌的点杂交结果。
图10表示可预测的对测定条件的修改可使遭到破坏(compro-mised)或无功能的甜菜碱在体外处理结核分枝杆菌中起作用。
图11是用以研究真空压力在体外处理中作用的实验方案草图。
图11A表示真空压力对体外处理结核分枝杆菌和鸟分枝杆菌的作用。
图12表示在体外处理过程中为使Triton X-100提高回收效率需延长结核分枝杆菌的除气。
图13表示Brij 96，一种SB-18和吐温80的近似十八烷基的非离子结构同系物表现出的类SB-18活性。
图14表示鸟分枝杆菌有限的真空除气揭示了近似十八烷基去垢剂在通过离心改善回收方面有一定程度的功效。
图15描述了用于这些实验中的真空除气装置的设计。
图16是设计用来比较图11所示的SB-18处理方法和NALC/NaOH处理方法的实验方案草图。
图16A提供了按图16的方案时结核分枝杆菌的生长曲线。
图16B提供了图16的样品进行PCR时的扩增结果。
优选实施方案的详细描述本发明提供了一种制备供微生物检测或培养用的样本的方法。这些微生物具有漂浮(有“浮力”)在液体培养基上，和/或在生长过程中形成菌索或成团的特征。
“样本”是指任何用于检测或培养微生物的材料，特别是分枝杆菌，包括，但不局限于生物样品和非生物样品。
“生物样品”是指取自动物(包括人)或植物的样品。特别重要的动物来源的生物样品包括那些来自反刍动物(如牛或羊类动物)或鱼及鸟类动物。术语生物样品拟包括来自加工或未加工的食品(例如包括蛋、奶酪，牛奶和其它畜牧产品)，植物或细胞培养来源(如单细胞或成纤维细胞培养物)的样品。
“非生物样品”指来自非生物(例如环境来源的土壤、水、锯末和空气)的样品。
“沉淀”指以浓缩分枝杆菌的方式经过处理和/或澄清，并由此可用作以后检测处理的样本。
“洗涤”指把所需要的样品与溶液相接触，所述溶液一般为含近似十八烷基或类SB-18去垢剂溶液。
“分枝菌酸结构”指β-羟基酸在α位被中等长度的α-链取代，这是本领域所熟悉的(Goren，M.B.Bact.Rev.6本文一并参考)。
“类SB-18去垢剂”指能促进以定性方式物理收集具有分枝杆菌酸结构的微生物供后续检测用的甜菜碱。术语“类SB-18”与“类甜菜碱”同义。本发明中的类SB-18去垢剂能够分散分枝杆菌菌索(和团块)，并且/或者补偿分枝杆菌浮力。分散作用通过增加用于检测的等份中含有微生物的可能性使检测便利。分散菌索的类SB-18去垢剂的烷基链长度大于16个碳原子，18-20个碳原子是优选的。本发明的类SB-18去垢剂，通过在某种程度上补偿自然浮力，尤其是通过促进去垢剂向细胞中运动，也具有有利于分枝杆菌(如象以不成团结块方式生长的MAC有机体)收集的能力。补偿浮力的类SB-18去垢剂最好具有超过12个碳原子的烷基链，优选的是16-20个碳原子。
“类SB-18活性”指有利于破坏菌索(由此使微生物均匀分散到溶液中的能力)，或补偿浮力(从而实质上有利于此类微生物通过离心定量收集)的能力或这两种能力。例如，假若微生物在生长期间成团，例如MTB有机体，用类SB-18去垢剂处理通过补偿浮力和使有机体在整个处理溶液中更加均匀地分散便有利于检测。这种双重功能是去垢剂的“类SB-18活性”。具有这些特性的类SB-18去垢剂的例子包括任何本文描述的具有这些性质的甜菜碱。或者通过举例说明，或者与举例说明的甜菜碱结构相类比，包括具有表2和表3所示的和/或本文描述的结构的类CB、类SB、类HSB、类pB、类StB、类So、类Rev-B、类A、类cAB和类ImB去垢剂。
“除气”是指以一定的时间和温度将样品或沉淀置于真空下，以抵消含诸如分枝菌酸、诺卡氏菌酸或棒状菌酸的分枝杆菌酸结构的微生物的浮力。勿需下列解释的支持，相信除气去除了细胞壁中堵住的CO2，因此去除了这些有机体的某些自然浮力。在40℃-42℃下将样品置于600mmHg下60分钟为优选的，并且当用类SB-18去垢剂时有利于微生物收集；然而，相同温度和真空下延长除气时间将使任何去垢剂有利于检测。
因此，根据本发明的方法，浮力可用三种方式抵消或在细胞内积聚去垢剂，或通过除气，或二者兼有。有些去垢剂，并非是甜菜碱，在除气存在不存在时均有利于检测。例如，非离子线性去垢剂如Brij96(多氧乙烯10油基醚(C18∶1E10)(CAS_No.)有类似甜菜碱的头部基团的直径。这些“类rod(rod-like)”去垢剂进入细胞空间不受阻(与吐温80相比)，因此能迅速封闭在细胞内，由此补偿浮力。因此，这里“类rod”去垢剂是指本发明的方法中，在不除气条件下，表现类SB-18活性的非离子去垢剂。其它非离子类rod去垢剂预期也将以此方式补偿浮力。其它去垢剂，如十八烷基的离子去垢剂、十八烷基三甲基铵溴化物(TMA-18CAS_No.)或苄基二甲基十八烷基铵溴化物(BenzDMA-18)比它们的短链同系物更大程度地有利于检测，但只是在除气前提下。勿需下列解释的支持。相信一些去垢剂由于它们的“近似十八烷基”结构而易于在细胞内积聚。
这里用的“类rod”指具有类似的甜菜碱“轴比”的去垢剂分子，这里轴比的定义为“主轴对次轴的比值…”(MeGraw-Hill Dictio-nary of Scientific and Technical Terms，5th ed.，Parker，S.P.ed.McGraw-Hill，Washington，D.C.(1994)，P.168)主轴指延伸的烷基链(如，疏水结构域如表2中定义的R1)，次轴指头部基团直径。据定义，主轴与次轴互相垂直。
“近似十八烷基去垢剂”指具有一个类似于类SB-18十八烷基部分的类十八烷基部分，优选地为12-20个碳原子，最优选的为18-20个碳原子的去垢剂分子。其可用在本发明的方法中观察到类SB-18活性，但不需要两性离子功能起作用。它包括，但不限于，表现类SB-18活性的不需要除气的棒状去垢剂或需要除气的阳离子去垢剂。当用于MAC复合有机体时，本发明的方法中近似十八烷基去垢剂很有用；近似十八烷基去垢剂包括类SB-18去垢剂。并非所有近似十八烷基去垢剂都是类SB-18去垢剂，但所有类SB-18去垢剂都是近似十八烷基去垢剂。
“CAS_登记号”或“CAS_No.”指化学文摘社登记号，2540 Olen-tangy River Road，PO BOX 3012，Columbus，Qhio，本文涉及的所有CAS_登记号和结构式见表13。处理供检测的样本正如这里和最优选方案中所例证的，微生物是分枝杆菌，如这里进一步例证的，本发明对用于后续检测的、外层细胞壁中含有分枝菌酸结构的、成团的微生物样品处理的方法通过分枝杆菌的MTB复合体的处理和检测来例证。如同这里进一步例证的，本发明对用于后续检测的、在外层的细胞壁中含有分枝菌酸和可漂浮的微生物样品的处理方法通过分枝杆菌的MAC复合体的检测来例证。虽然这里特别例证了分枝杆菌属成员，但要知道这里所讲的和本发明的方法对于任何在漂浮和/或成团和/或胞壁中有分枝菌酸结构方面有相似特征的有机体的样品的制备方面都有用。
根据本发明的第一实施方案，通过把样品或沉淀置于含缓冲的类SB-18去垢剂的培养基中，或在不除气时在具有类SB-18活性的近似十八烷基去垢剂(如类rod去垢剂)的培养基中对样品(或者，制备的样品沉淀)进行处理。在微生物不以成团形式生长(例如MAC有机体)的情况下，这一步通过一定程度上补偿自然浮力而有利于收集。在微生物成团生长(例如MTB有机体)情况下，这一步既通过补偿浮力，又通过使有机体更均匀地分散于处理液中而有利于收集。本发明方法的第一实施方案中，无除气步骤，用类SB-18去垢剂解聚成团微生物，尤其是分枝杆菌，特别是MTB复合体。
根据本发明的第二实施方案，通过把样品或沉淀进行除气步骤，例如暴露于真空，对样品(或制备的沉淀)进行处理。在本发明的第二实施方案中，分枝杆菌(如那些MAC复合体)，只是简单除气，然后测定。如下面进一步描述的，洗液成分可能是，但绝不限于，水或水相缓冲液。
根据本发明的第三实施方案，将样品(或制备的沉淀样品)进行除气步骤和含去垢剂洗涤步骤。在第三实施方案中，任何去垢剂，但特别是那些近似十八烷基去垢剂，最优的是类SB-18去垢剂，可以和真空步骤合用；另外，任何去垢剂，但特别是那些近似十八烷基去垢剂，最优的是类SB-18去垢剂，可用于首先的洗涤步骤，根据所需用途，随后或同时进行除气步骤。第三实施方案对于分枝杆菌种类未知样品，或怀疑至少含有一种MTB和MAC复合体的样品特别有用。
与样品或沉淀相接触的液体介质，如洗涤液，除了所需去垢剂外，如果需要可包含其它组分，例如二硫苏糖醇(DTT)和酶(如糖苷酶和DNA酶)，以帮助溶解特定生物物质(如痰)，或帮助去除样品中不理想的特征。DTT和酶(如糖苷酶与DNA酶)是减少生物液体粘度的有用因子。
如果需要，可进行多于一次的洗涤步骤，多步洗涤可以连续依次(一个接一个)或被其它操作步骤隔开。这种多步洗涤步骤可以包含其它试剂。到另外的处理步骤需要加入其它试剂例如进一步清除样品污染的试剂的程度时，可用这种步骤。这样的多步洗涤步骤可含有不同的去垢剂或含有相同的去垢剂。在同一洗涤步骤中联用不同的非类SB-18去垢剂普遍降低单个去垢剂的效力。然而，当达到这些去垢剂与类SB-18或与近似十八烷基去垢剂一定的组合在本发明方法中保持效力的程度时，这种结合可以应用。
在本发明的任一实施方案中，测定分枝杆菌存在用的样品可首先通过需要作为第一处理步骤的任何标准生物学步骤提取，例如，Kent(Kent，P.t.et al.，”Public Health Mycobacteriology”in A Guidefor the level III laboratory，U.S.Department of Healtn and HumanService，Centers for Disease Contral(1985)，pp.31-46)推荐的步骤之一，特别是实施例2，4和6所示的NALC/NaOH分离步骤。沉淀的一部分首先移出用于培养和涂片。剩余沉淀进一步处理，用任何用于随后检测的实施方案处理，所述实施方案是通过用扩增(核酸或信号)或免疫检测或任何能区分样品中目标分枝杆菌存在的方法检测。然而，正如下面和实施例中讨论的，现在本领域中所用标准技术的处理很可能使样品中的分枝杆菌收集和/或检测遭到破坏。特别当这些分枝杆菌数目低时。因此，应用本发明的方法本身即使在样品中分枝杆菌数目少时实质上也可以定量，当现行不能提供本发明的去垢剂和除气的方案联用时，可能早已使分枝杆菌的回收遭到破坏。也可能以避免低效率回收的方式修改Kent P，t.et al〔上述〕的现行方案，例如通过用合适的试剂中和氢氧化钠或草酸，或Kent P.t.et al〔上述〕描述的任何去垢剂，然后在离心前加入类SB-18或近似十八烷基去垢剂处理；或通过加入适当缓冲的类SB-18或近似十八烷基去垢剂以作为离心前按本发明的方法进一步处理的中和缓中液起作用；或通过离心前对中和的样品简单除气。这些经过修改的方案使得仍然使用现行方法时，类SB-18活性和/或除气提高通过离心的收集效率。
因此，在实施例13例证的高度优选的实施方案中，将一个欲测定分枝杆菌存在的样品用于本发明的方法中，对分枝杆菌直接分离以直接扩增和/培养检测，而不经任何标准的初步方案处理。更确切地说，样品或直接使用，或澄清或者(如必要的话)用本领域中已知的常规分离技术(如离心，过滤，凝胶排阻层析或离子交换层析)纯化固体物和/或抑制剂。如本文所描述的，将样品直接用类SB-18去垢剂洗涤、真空处理来去除浮力或两者兼用。处理细胞能得到有效的收集，沉淀用于所需微生物的检测。
在上面描述的第一实施方案中，将所需量的沉淀或样品在一足够大的容器中处理，容器中内盛含类SB-18去垢剂的洗液，在一定的温度下以足以分枝杆菌均一分布于整个溶液和补偿浮力的搅拌水平处理一段时间。例如，可通过涡旋振荡或一般地使盛有样品的容器保持运动来实现这种搅拌，以重新悬浮沉淀(或悬浮样本)以使去垢剂在下一步处理前有效地破坏微生物并分散为液体。稍微提高温度，例如37℃，有利于解聚而不损害随后的检测方法，且可能是防止类SB-18去垢剂沉淀必要的。微生物分散均匀后，特别是分枝杆菌分散后，可用本领域中已知的技术进行大量收集。(如离心)，检测或进行如下所述的其它测定和分析。
在第二实施方案中，样品或剩余沉淀简单地用水或其他所需介质重新悬浮，不一定需要含去垢剂的介质，并在所需压力和温度下除气一段时间以充分去除溶液中微生物特别是MAC复合有机体的自然浮力倾向。然后按如下所述，收集并检测微生物。
在以上描述的第三实施方案中，除了除气前，除气中或除气后，介质中可用任何去垢剂(尤其是近似十八烷基去垢剂，更特别的是类SB-18去垢剂)来获得分散效果以及补偿浮力外，基本上前两个实施方案结合。除气步骤可在去垢剂洗涤步骤之前，之后，或与去垢剂步骤与除气步骤同时进行。本领域的技术人员应该知道，在目前的技术状况下，同时对样品除气和洗涤具有极大的安全危险性。
第三个实施方案是实施例10的进一步描述。如实施例10所示，当真空处理和去垢剂结合使用时，可用近似十八烷基去垢剂，类SB-18为优选的，SB-18为最优。如实施例10进一步所示，在样品广泛地除气去除大部分自然浮力的条件下，可用任何去垢剂。在此方案中，样品需要或不需澄清或纯化；这些步骤在理想真空-去垢剂处理步骤之前，或在其间或之后进行。如上所述，随后可收集、检测微生物。
因此，为定量回收分枝杆菌，标准样品处理方法(如Kent，P.T.et al.，”Public Health Mycobacteriology”in A Guide for the Level IIILaboratory，U.S. Department of Health and Human Service，Centersfor Disease control(1985)pp.31-46.中描述的N-乙酰-L-半胱氨酸/NaOH(NALC)方法)被首先放弃，或按以上的描述进行修改，样本或经去污处理的样品直接(i)用类SB-18去垢剂，优选SB-18洗涤(ii)简单除气，或(iii)根据所要检测的分枝杆菌，结合去垢剂洗涤与真空进行处理。
然而，若想从包括诸如痰，脑脊液和尿等生物液体运用本发明的方法，样品可经第一步处理提供沉淀。例如可用(Kent，P.I.etal.，”Public Health Mycobacteriology”in A Guide for the level III labo-ratory，U.S.Department of Healtn and Human Service，Centers forDisease Contral(1985).pp.31-46本文一并参考)中所述任何方法首先处理，如实施例12中详细阐明的以及下面和以上所述的，其中包括N-乙酰-L-半胱氨酸/NaOH(NALC)步骤。
通过混合液体(如水或其他含所需类SB-18去垢剂的缓冲液)，于允许剧裂振荡(如涡旋振荡)的足够大的容器中进行第二次清洗，如有必要，可用本领域中已熟知的方法(如凝胶层析，离子交换层析或过滤的方法)在第二次洗涤之前、洗涤期间或洗涤之后对沉淀进一步纯化。通过此处理获得的细菌沉淀可用作检测(包括培养检测)分枝杆菌的来源。
在一个优选的实施方案中，样品用包含所需去垢剂(如实施例13和下面例证的SB-18)的溶液，于允许剧裂振荡(如涡旋振荡)的足够大的容器中直接处理，若有必要，用本领域中已知的方法(如凝胶层析，离子交换层析或过滤方法)在直接处理之前，之中或之后对样品进一步纯化。通过此最初处理获得的细菌沉淀可用作检测(包括培养检测)分枝杆菌的来源。
如果掺合适合的去垢剂，(若有必要，向培养基中加入诸如类SB-18或近似十八烷基去垢剂的合适去垢剂)，在处理过程中的适当步骤可包括本领域已知的另外的初次或二次澄清或纯化步骤。正如以上述进一步指出的，当置于去垢剂中和使用除气时，也就是说，当在除气之前，同时或随后置于本文所述的适当去垢剂中时，不必只使用类SB-18去垢剂，可以使用任何去垢剂(特别是那些本文定义和例证的近似十八烷基去垢剂)。
当然，如果样品首先用标准方法(如NALC/NaOH方法)处理(例如实施例12中所示的)，然后(i)用类SB-18去垢剂(SB-18优选)洗涤，(ii)简单除气，或(iii)结合去垢剂洗涤和真空处理以去除浮力，则剩余有机体的回收将提高，由任一标准方法处理引起的损失将可能已经使样品遭到破坏，在这一范围而言，就不必定量了。
在本文描述的任何一种结合使用中，包括本发明方法与标准NALC/NaOH方法的结合，可更有效地收集处理细胞，沉淀即可用于检测其中的目标微生物。
运用本发明可以从样品中以实际上消除因成团或浮力造成的假阴性的方式定量提取分枝杆菌，本发明的方法给出基于检测方法的可靠的结果(如核酸扩增的结果)，并以允许用培养或通过其他方法(如煮沸)的方式裂解这种分枝杆菌的方式提供分枝杆菌。
本发明的方法对任何宿主样本中分枝杆菌的检测均有用。除人外，已知道的其它易感染分枝杆菌的动物例子包括牛、猪、禽、绵羊、山羊、鹿、猴、象、马、狗、猫、貂和各种动物园和水族馆的动物。本发明的方法所用的组织样品一般从肉芽肿瘤灶取样，此病灶多结状，有一纤维囊膜包围的干酪钙化中心。若无大的病灶，优先分析淋巴结。若感染在小肠，肠道变厚部分一般用作样品。
样品可以是生物体液形式，包括例如痰、脑脊液、尿、支气管洗液、胸膜液、胃抽出物、血液、血浆、腹膜液、脓肿和渗出液或其他生物性液体，也可从公共或私人培养收集物及类似场所取得，或特别是从临床或兽医来源取得。可利用液体培养、冷冻悬浮或固体培养基上生长的菌落。一些样品可能是半固体材料和/或需要澄清，例如粪便和全血或培养血。本发明的方法对于外源样本(如鱼或爬行类的鳞)和组织样品均有用。不必从培养物抽提样品，事实上通过核酸或信号扩增对期望的微生物进行直接检测正是本发明的优点。这里要指出的是，本发明的方法处理后分枝杆菌仍可存活(如没有裂解)，因此需要时可进行培养。例如，可首先用本发明的方法处理所有的样品，以提供用于扩增技术检测微生物的最大回收效率，并尽可能在最短时间内作出有关诊断的结论。然后可将阳性样品进一步作培养处理。这一方案显著地减少了诊断时间和提供了适合于培养的存在于样本中的微生物(尤其是分枝杆菌属微生物)。MTB株系中对药物抗性增加的发生率使所有MTB阳性样品对药物敏感性的培养成为必需。因为以一种有生存力的方式有效地回收分枝杆菌是最理想的，本发明的方法有利于诊断和敏感程度的测定。
本发明的方法首次本质上消除了因微生物(如MTB复合体的分枝杆菌)成团引起的假阴性。成团实际上加剧了样品处理过程中成团微生物低效率的分层。事实上，本发明的方法有利于成团微生物均质地分布于所需溶液中，从而通过增加某给定样品的所有等份包含有机体的可能性、促进用本领域中熟知的检测技术(如培养和核酸(DNA或RNA)扩增)进行检测。
此外，本发明的方法克服了水相液体中这些有机体的自然浮力，从而使利用本领域已知的收集技术(如离心)收集这些有机体很便利。自然浮力实际上减少了通过离心有效地收集这些微生物的能力。
因为本发明的方法实质上提高了从样本中回收这些微生物的效率，所以在更先进的方法可以代替诊断的范围内，排除了对长期培养结果的需要；核酸基本扩增技术是这种先进方法的一个例子。然而，本发明的方法不裂解微生物，相反可得到有生存力的有机体，以致不妨碍作为一种检测方法的培养技术。
对本发明的方法以制备检测微生物(如分枝杆菌)存在的样品的方式进行了说明。因此，最终检测的微生物将依赖于本本发明方法结合使用的检测方法。这种检测方法可被设计来检测任何目标微生物，尤其是任何目标分枝杆菌属细菌群体或复合体或分枝杆菌种，最优选的是分枝杆菌复合体，如结核分枝杆菌(MTB)复合体，鸟分枝杆菌(MAC)复合体，MAIS复合体或偶发分枝杆菌复合体，以及生长较快和生长较慢的分枝杆菌，包括特定的和非特定的光产色菌、非光产色菌、暗产色菌，尤其是非洲分枝杆菌、M.asiatieum、鸟分枝杆菌、牛分枝杆菌、牛分枝杆菌(BCG)、丁酸分枝杆菌、龟分枝杆菌、M.duvalii、淡黄分枝杆菌、偶发分枝杆菌、胃分枝杆菌、戈特氏分枝杆菌、M.haemophilum，胞内分枝杆菌、堪萨斯氏分枝杆菌、麻疯分枝杆菌、鼠麻疯分枝杆菌、M.linda，M.lufu、海分枝杆菌、M.Mal-moense、田鼠分枝杆菌、粘液分枝杆菌、无色分枝杆菌、副结核分枝杆菌、M.peregrinum、草分枝杆菌、红皮分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、M.shimoidei、猿分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、M.szulgai、土分枝杆菌、M.thermoresistable、次要分枝杆菌、结核分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、M.vaccae、蟾分枝杆菌，以及它们的血清变型。
堪萨斯氏分枝杆菌，海分枝杆菌、猿分枝杆菌和M.asiaticum为光产色菌的例子，瘰疬分枝杆菌、M.szulgai、蟾分枝杆菌、戈特氏分枝杆菌和淡黄分枝杆菌为暗产色菌的例子。鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、胃分枝杆菌、M.malmoense，土分枝杆菌和次要分枝杆菌都是非光产色菌的例子。
非洲分枝杆菌、鸟分枝杆菌、牛分枝杆菌、M.haemophilum、胞内分枝杆菌，堪萨斯氏分枝杆菌、M.malmoense、海分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、副结核分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、猿分枝杆菌、M.szulgai、结核分枝杆菌和蟾分枝杆菌都是生长较慢的分枝杆菌种的例子(需7天以上)。龟分枝杆菌、淡黄色分枝杆菌、偶发分枝杆菌、金黄色分枝杆菌、麻疯分枝杆菌、草分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、溃疡分枝杆菌是生长较快的分枝杆菌种的例子。
结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、牛分枝杆菌、牛分枝杆菌(BCG)和田鼠分枝杆菌为MTB复合体的成员，鸟分枝杆菌，胞内分枝杆菌为MAC复合体的成员；至少有3种不同的鸟分枝杆菌血清组，并至少有25个血清变型的胞内分枝杆菌。
本发明尤其适用于亲脂的，或具有似蜡荚膜的微生物，该荚膜的特征是在其外层细胞壁中具有象分枝菌酸分子的脂类(如，象棒状杆菌酸，诺卡氏分枝杆菌酸及分枝菌酸。这些都以“分枝菌酸结构”为特征，即，α-位的β-羟酸由一个中等长度的α链替代，如本领域所理解的(Goren，M.B.Bact.Rev.6)，本文一并参考)。具有棒状菌酸的有机体的一个例子是白喉棒状杆菌；其有诺卡氏菌酸的有机体的一个例子是星状诺卡氏菌，具有分枝菌酸的有机体的一个例子是结核分枝杆菌，这些类似分枝菌酸的分子本文统称为“分枝菌酸组分”如在Lederer，E.Chem.Phys.Lipids 7)，Lederer，E.Pure Appl.Chem.71)(本文在此一并参考)也可发现表列的有代表性的分枝菌酸结构(包括某些不饱和的，环丙烷的，甲氧基化的和酮酸)“分枝菌酸结构”是酸一稳定性分子。
疾病和病态检测中具有突出重要性的各种分枝杆菌种类的例子尤其包括结核(结核分枝杆菌复合体)、麻疯(麻疯分枝杆菌(人的麻疯病)和鼠麻疯分枝杆菌(鼠的麻疯病))的致病因子。鸟分枝杆菌复合体为一种重要的鸟类疾病。鸟分枝杆菌也从患分枝杆菌再感染的艾滋病病人中分离出。牛分枝杆菌在兽医方面具有重要性。偶发分枝杆菌为一种从动物和人体的损伤处分离的土壤细菌。胞间分枝杆菌为“机会主义者”，尤其是在感染了艾滋病病毒的病人中可以观察到。副结核分枝杆菌在人的Crohn’s疾病(局部回肠炎)的诊断方面具有重要性，堪萨斯氏分枝杆菌为一种罕见但却具有毁灭性的因子，一般与肺病有关。海分枝杆菌侵染冷血动物和鱼类；它也从人体四肢的表面肉芽瘤上分离到。副结核分枝杆菌是牛的Johne’疾病的致病因子；它生长非常缓慢，必须培养16周才能保证它们是阴性的。溃疡分枝杆菌在人体医学上也具重要性。Wayne，L.G.et al.，Clin.Micro.Rev.51-25(1992)讨论许多上述及其他的分枝杆菌，本文一并参考。
检测步骤可利用任何已知的方法检测目标微生物，尤其是目标分枝杆菌，这些检测方法包括，但不局限于，核酸扩增，信号扩增，杂交，培养和免疫试验。在优选实施方案中，检测方法为核酸扩增和/或培养。在最优选的实施方案中，使用聚合酶链反应(PCR)扩增。事实上，类SB-18去垢剂对PCR没有抑制作用以及有机体还有生存活力和可以被培养正是本发明方法的优点。与标准技术相比，NALC/NaOH溶液对PCR具有极大的抑制作用。此外，也充分确认的是，虽然在用NALc/NaOH处理后，有机体还有生活力，但已经知道有28％-33％的分枝杆菌被杀死(Krasnow，I.et al.，Am.J.Clin.Path.66)；Kubica，G.P.W.et al.，AM.Rev.Resir.Dis.63)，相比之下，虽然类SB-18的去垢剂可能具有杀菌作用以及某种程度的制菌活性，但当本发明的方法在理想浓度下使用时，分枝杆菌可以不被裂解，且还具有生命力。
鉴定分枝杆菌存在的方法可使用标记方法，如那些常用于核酸检测和/或分枝杆菌细胞抗原的免疫检测的标记方法，包括但不局限于放射性标记(例如，32p、33p、35S，14C和3H)、荧光标记(例如，荧光素，金胺，rhodamin，得克萨斯红，等等)、化学发光标记(例如，acri-dinium酯标记的探针，LUMI-PhOS 530TM，Schaap试剂(4-甲氧基-4-3-(磷酸苯甲)-spirol-〔1，2-dioxetane-3，2′-金刚烷〕，CSPD_(U.S.5,112,960)等等)、比色检测(例如，3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)，等等)、电发光(例如三羟甲基氨基甲烷(2，2′-二吡啶)钌(II)螯合物(TBR)和蛋白质或酶标记(例如，抗体，碱性磷酸酯酶，辣根过氧化物酶，等)，它们都可以与以上任一试剂类型结合使用。
通过以试剂盒形式提供本发明的方法中使用的试剂可极为方便地使用本发明的方法。这种试剂盒优选地包含合适的缓冲液、盐、类SB-18去垢剂(或其相等物，如与除气结合使用的去垢剂)，如果需要的，还包含适当纯度的水。也可以包括至少一种鉴定试剂，该鉴定试剂的种类依赖于使用的检测试验类型(例如，是否最终使用扩增，免疫检测，等等)；和提供用于微生物检测的核酸(DNA或RNA)的阳性标准，或所需的特定的抗原(蛋白质或其它)或其他的特征物质(如供鉴定微生物脂类的一些组分，尤其是通过气-液相色谱进行鉴定)。特定的试剂盒包括特殊的分枝杆菌鉴定用品，如特殊的核酸探针，抗体或涂片或培养材料。通过检测鉴定试剂的用品可以是试剂盒特异性的，以便试剂盒提供如酶，荧光，放射性或化学发光检测，或任何本领域已熟悉的其他合适的检测方法。在这种试剂盒中，该检测用品一般与去垢剂试剂极为相近，即使分装于不同的容器或包装盒中。
如果使用核酸扩增作为检测方法，已知有许多这种类型的扩增，它们在本发明的方法中均有用。例如，核酸扩增系统的类型(包括聚合酶链反应(PCR)，连接酶链反应(LCR)，Qβ复制酶扩增，链替换扩增(SDA)和单个引物扩增(SPA))或转录基本扩增系统(XONASBA(核酸序列基本扩增)，SSSR(自我保持序列扩增)，或LAT(连接激活转录)扩增)。信号扩增系统(如分枝DNA(bDNA)信号扩增系统)也有用处。
分枝杆菌属一特异性和序列特异性探针的发展也已被描述(Fries，J.W.U.et al.，Molec.Cell Probes 487-105(1990).在不止一种分枝杆菌种内出现某些遗传序列，它们可有利地用来检测任何一个家族的分枝杆菌种的存在。例如，Crawford et al.，U.S.5,183,733描述了结核分枝杆菌(MTB)复合体成员特有的一段重复DNA序列。通过直接杂交分析(如，Southern分析)或在一个扩增试验中使用一段保守序列为引物进行检测。在这里描述的一个新型扩增试验中，使用根据Rogall，T.et al.，Int，J.Sys.Bacteriol.90)发表的16SrRNA基团序列，用本文描述的一套探针也可以对下列分枝杆菌进行扩增MTB复合体，鸟分枝杆菌复合体，胞内分枝杆菌，副结核分枝杆菌，堪萨斯氏分枝杆菌，海分枝杆菌，M.szul-gai和胃分枝杆菌。引物是以它们能对下列分枝杆菌组/种提供最佳扩增的方式设计的结核分枝杆菌(TB复合体〔MTB〕)，鸟分枝杆菌-胞内分枝杆菌和副结核分枝杆菌(MAC复合体)，堪萨斯氏分枝杆菌和海分枝杆菌。正向引物是根据核苷酸119-114设计的(根据Rogall，T.et al.，Int.J.Sys.Bacteriol.90)对这些分枝杆菌的16SrRNA基因序列的第二个可变区(V2)的命名)。正向引物序列(TBv2-119)为5′-AAA CTG GGT CTA ATA CCGGAT AGG A-3′〔SEQ ID No.1〕。反向引物是针对第三个可变区(V3)的核苷酸431-453设计的。反向引物序列(TBv3-453)为5′-CCA CCT ACC GTC AAT CCG AGA-3′〔SEQ ID No.2〕。扩增产物为大约335个碱基对(依扩增的种类)。属特异性探针是针对扩增产物的中间部分设计的，并且对所有的分枝杆菌都是相同的。其序列为5′-GCG GGC iCA TCC CAC ACC GC-3′〔SEQ ID No.3〕，MTB种特异性探针是根据扩增产物的一个不同部分设计的，对TB复合体的有机体是特定的，其序列为5′-GAC CAC GGGATG CAT GTC TTG TG-3′〔SEQ ID No.4〕。
另一方面，种特异性探针为已知。例如Mc Fadden et al.，US 5,225,324描述了一个家族的DNA插入序列，该序列可用作鉴定分枝杆菌和区分密切相关的种的探针。US 5,216,143描述了戈特氏分枝杆菌的特异性探针。已经知道副结核分枝杆菌的探针IS 900插入因子对该种是特定的(Mc Fadden et al.，Mol.Microbiol.7)。类SB-18活性在大多数优选的实施方案中，培养基中特别是第二洗涤步骤中优选的去垢剂是类SB-18去垢剂，该去垢剂能够破坏菌索形成，并且最特别的是SB-18(CAS_No.)以足够的量破坏菌索形成，甚至使分支杆菌分散。SB-18优选是由于其纯化形式经济可得。C18-羧丙基甜菜碱(CAS_No.)是非常优选的，这是因为在用于本发明的方法中时它能给出可溶性、链长和桥结构的理想的组合。
SB-18(CAS_No.)的化学组成为C23H49NO3S，其化学分子式为CH3(CH2)17N(CH3)2(CH2)3SO3。SB-18的化学名称包括氢氧化二甲基十八烷基(3-磺丙基)铵内盐(Aldrich No.36712-5)、N-十八烷基-N，N-二甲基-3-ammonio-1-丙烷磺酸盐(Sigma No.08004)、3-(N，N-二甲基-硬脂酸基ammonio)丙烷磺酸盐和3-(硬脂酸基-二甲基ammonio)丙烷磺酸盐(FlukaNo.41570)。本发明的方法中最优选的是使用来源于Sigma的SB-18。
在SB系列中仅有一种其它去垢剂在破坏菌索形成上有用SB-16(CAS_No.；N-十六烷基-N，N-二甲基-3-ammonio-1-丙烷磺酸盐；十六烷基磺基甜菜碱；Sigma H6883)。然而，在相同的浓度下它不如SB-18有效。本文给出的数据表明，大多数十八烷基甜菜碱(如以下限定的其中R1的碳原子数大子16)具有破坏结核分支杆菌成团的能力。
某些去垢剂不具有使破坏菌索形成和分散MTB复合有机体达到满意程度的能力。试验并发现不具有解散MTB复合物能力的去垢剂的其它化合物包括SB-10(CAS_No.)、SB-12(CAS_No.)、SB-14(CAS_No.)、癸酸(CAS_No.334-48-5)、十二烷酸(CAS_No.143-07-7)、十二烷基硫酸钠(SDS CAS_No.151-21-2)、亚苄基konium氯化物(Be-bzAlkCAS_No.)、混合的烷基三甲基溴化物(mT-MA)、十二烷基三甲基溴化物(TMA-12CAS_No.)、十四烷基三甲基溴化物(TMA-14CAS_No.)、十八烷基三甲基铵溴化物(TMA-18CAS_No.)、脱氧胆酸(CAS_No.302-95-4)、苄基二甲基十二烷基铵溴化物(BenDMA-12CAS_No.)、苄基二甲基十四烷基铵溴化物(BenD-MA-14CAS_No.139-08-2)、苄基二甲基十八烷基铵溴化物(BenzDMA-18)、吐温20(CAS_No.)、吐温60(CAS_No.)、吐温80(CAS_No.)、TritonX-100(CAS_No.)、NP-40(CAS_No.-0)、Brij35(CAS_No.)、Brij99(CAS_No.)、Span20(CAS_No.)、Span60(CAS_No.)、Span80(CAS_No.)、Synperonic F/68，聚乙二醇1450(CAS_No.)、Ficoll 400,000(CAS_No.)、聚乙烯吡咯烷酮360000(CAS_No.)、甲酰胺(CAS_No.75-12-7)和二甲基甲酰胺(CAS_No.68-12-2)。
某些去垢剂虽然不能破坏菌索形成，但显得有利于收集。例如，所有SB-系列去垢剂(特别是SB-12、SB-14、SB-16和SB-18，并且尤其是SB-18)表现出可等效地用于不成团的有机体(如鸟分支杆菌)。因此除了SB-18(CAS_No.)外，SB系列中抵销浮力由此经重力方法促进收集的其它去垢剂包括SB-16(CAS_No.；N-十六烷基-N，N-二甲基-3-ammo-nio-1-丙烷磺酸盐；十六烷基磺基甜菜碱；Sigma H 6883)；SB-14(CAS_No.；N-十四烷基-N，N-二甲基-3-am-monio-1-丙烷磺酸盐；十四烷基磺基甜菜碱；Sigma T 7763)；SB-12(CAS_No.；N-十二烷基-N，N-二甲基-3-ammonio-1-丙烷磺酸盐；十二烷基磺基甜菜碱；Sigma D 4516)。
两性离子SB-系列去垢剂具有被丙基基团分开的季氮和磺酸盐基团，各自具有长链烷基部分SB-12、SB-14、SB-16和SB-18各自具有结合到季氮上的十二烷基、十四烷基、十六烷基和十八烷基。尽管SB-18去垢剂在破坏菌索形成上最有效，但是全部SB-系列的去垢剂表现出在经离心促进结核分支杆菌的收集上有某种程度的效果。此外，SB-系列去垢剂在促进不产生菌索的那些微生物(如鸟分支杆菌)的收集上表现出相等的效力。如以下的描述，勿须这种解释的支持，相信这些两性离子去垢剂具有促进去垢剂向细菌细胞运动的特征。这一积累的净效果补偿有机体的天然浮力达到足以使其能经离心分离的程度。
按照本发明，在使用去垢剂的那些实施方案中，不论是使用有利于菌索分散的类SB-18去垢剂，还是使用有利于离心收集细菌的类SB-18去垢剂，最终的结果是相同的。按照本发明，将分支杆菌置入有利于其后续检测的环境中(均匀分布在整个样品中或有利于收集和浓缩)。
这一功能二元性本文称为“SB-18活性”。因此，这里使用的SB-18活性指类SB-18去垢剂在处理成团生长的生物体时促进菌索分裂(并由此使微生物在溶液中均匀分散)的能力，或类SB-18去垢剂或近似十八烷基去垢剂因补偿浮力有利于经离心基本上定量收集所述微生物的能力，或者类SB-18去垢剂的这两种能力。
类-甜菜碱去垢剂本发明的研究表明，具有下列性质的类似SB-18的化合物在无除气步骤时改善回收上都是有潜能的(1)仅季胺(十八烷基，