潘子强,张玉山,贾冠聪,陈铭溢,陈敏婷,李琳,
电子科技大学中山学院,
利用16S rDNA克隆文库及限制性内切酶片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP）技术分析脆肉鲩鱼在冷藏条件下的特定腐败菌。分别提取新鲜鱼肉及腐败的脆肉鲩鱼肉样品中的细菌总DNA并利用通用引物27F/1492R进行PCR扩增,所得PCR产物用于构建克隆文库,阳性克隆子用RFLP进行分析。结果表明：新鲜鱼肉的克隆文库中细菌种类比较丰富,达15种类型,而腐败鱼肉的细菌种类只有7种,且有2种分型的细菌占优势,共占克隆子总数的88.4%。序第1页/共4页
安徽农业科学，Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆＡｎｈｕｉ
Ａ出．Ｓｃｉ．２０１３，４１（４）：１５１５—１５１６，１５２９责任编辑刘Ｐｌ娟责任校对卢瑶
春兰根内生解有机磷细菌的筛选
徐爱芳，武永秀，刘莹
（河北大学生命科学学院，河北省微生物多样性研究与应用实验室，河北保定０７１００２）
摘要［目的］为了获得具有解有机磷功能的春兰ｃａ生细菌。［方法］采用溶磷圈法、钼锑抗比色法对具有解有机磷能力的春兰ｃａ生细
菌进行了初筛和复筛，并通过细菌１６ＳｒＤＮＡ序列测定，对获得的功能菌株进行系统发育分析。［结果］筛选出１３株可解有机磷的春兰
根内生细菌，其中ｌＯ株属于芽孢杆菌属，此属为可解有机磷的春兰根内生细茵的优势菌属。２株属于变形茵门Ｂ变形茵纲的伯克氏茵属；１株属于拟杆菌门的Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａ，首次报道该属细菌具有解有机磷能力。筛选得到的菌株Ｎ８５、Ｎ６５具有较高的解有机磷活性。［结论］春兰根内存在解有机磷细茵。该研究结果为进一步开发和应用解磷植物促生细茵提供了菌种资源。
关键词解有机磷细菌；春兰；内生细菌；筛选中图分类号Ｓ１８２文献标识码Ａ文章编号０５１７—６６１１（２０１３）０４—０１５１５—０２
ＳｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆＯｒｇａｎｉｃＰｈｏｓｐｈａｔｅＳｏｌｕｂｉｌｌｚｉｎｇＥｎｔｏｐｈｙｔｉｃＢａｃｔｅｒｉａｏｆＣｙｍｂｉｄｉｕｍｇｏｅｒｉｎｇｉｉＲｏｏｔｓ
ＸＵＡｉ－ｆａｎｇｅｔａｌ（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭｉｃｒｏｂｉａｌＤｉｖｅｒｓｉｔｙＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＨｅｂｅｉＰｒｏｖｉｎｃｅ，ＣｏＵａｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＨｅｂｅｉＵｎｉ—ｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂａｏｄｉｎｇ，Ｈｅｂｅｉ０７１００２）
Ａｂｓｔｒａｃｔ［Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ］ＴｏｏｂｔｍｎｅｎｔｏｐｈｙｔｉｃｓｔｒａｉｎｓｏｆｏｒｇａｎｉｃｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｆｒｏｍＣｙｍｂｉｄｉｕｍｇｏｅｎｎｇｉｉｒｏｏｔｓ．［Ｍｅｔｈｏｄ］Ｅｎｔｏｐｈｙｔｉｃｓｔｒａｉｎｓｏｆｏｒｇａｎｉｃｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｏｌｕｂｉｆｉｚａｔｉｏｎｗｅｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄｆｒｏｍ５０ｅｎｔｏｐｈｙｔｉｃｓｔｒａｉｎｓｏｆＣｙｍｂｉｄｉｕｍｇｏｅｒｉｎｇｉｉｒｏｏｔｓｂｙｕｓｉｎｇｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｏｌｕｂｉｌｉｚｉｎｇｃｉｒｃｌｅａｎｄｍｏｌｙｂｄｅｎｕｍｓｔｉｂｉｕｍａｎｔｉ—ｃｏｌｏｒｍｅｔｈｏｄｓ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｏｒｇａｎｉｃｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｏｌｕｂｉｌｉｚｉｎｇｅｎｔｏｐｈｙｔｉｃｂａｃｔｅｒｉａｗａｓｓｔｕｄｉｅｄｂｙ
１６ＳｒＲＮＡｇｅｎｅ１０ｓｔｒａｉｎｓ
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．［Ｒｅｓｕｌｔｓ］１３ｏｒｇａｎｉｃｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｏｌｕｂｉｌｉｚｉｎｇｅｎｔｏｐｈｙｔｉｃｂａｃｔｅｒｉａｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔ
ｂｅｌｏｎｇｅｄｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ，ｗｈｉｃｈｗａｓｔｈｅｄｏｍｉｎａｎｔｇｅｎｕｓ．ＴｗｏｓｔｒａｉｎｓｂｅｌｏｎｇｅｄｔｏＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ．ＯｎｅｓｔｒａｉｎｗａｓａｓｓｉｇｎｅｄｔｏＣｈｉｔｉｎｏｐｈａ—
ｔｈｅｆｉｒｓｔｒｅｐｏｒｔｔｈａｔｔｈｅｓｔｒａｉｎｏｆＣｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａｓｏｌｕｂｉｌｉｚｅｄｏｒｇａｎｉｃｐｈｏｓｐｈａｔｅ．ＴｈｅｓｔｒａｉｎｓＮ８５ａｎｄＮ６５ｈａｄｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｈｉｇｈａｃｔｉｖｉ—
ｔｙｏｆｏｒｇａｎｉｃｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｏｌｕｂｉｈｚａｔｉｏｎ．［Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ］ＴｈｅｒｅｗｅｒｅｅｎｔｏｐｈｙｔｉｃｓｔｒａｉｎｓｏｆｏｒｇａｎｉｃｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｒｏｏｔｓｏｆＣｙｍｂｉｄｉｕｍｇｏｅｒｉｎｇｉｉ．Ａｎｄｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｖｉｄｅｄｍｉｃｒｏｂｉａｌｒｅｓｏｕｒｃｅｓｆｏｒａｐｐｌｙｉｎｇｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈ—ｐｒｏｍｏｔｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａｗｉｔｈｏｒｇａｎｉｃｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｏｌｕｂｉｌｉｚｉｎｇ
ｇａ，ａｎｄ
ｉｔｗａｓ
ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ．
ＫｅｙｗｏｒｄｓＯｒｇａｎｉｃｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｏｌｕｂｉｌｉｚｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａ；Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍｇｏｅｒｉｎｇｉｉ；Ｅｎｔｏｐｈｙｔｉｃｂａｃｔｅｒｉａ；Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
植物促生细菌（Ｐｌａｎｔ
ｇｒｏｗｔｈ．ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ
ｂａｃｔｅｒｉａ，ＰＧＰＢ）指生细菌。菌株活化采用Ｒ２Ａ培养基。解有机磷菌株的初筛采用卵黄筛选培养基旧Ｊ，复筛采用蒙金娜有机磷液体培养基‘９１。
１．２春兰根内生解有机磷细菌的初筛
采用溶磷圈法¨…，
一切对植物有益的细菌，主要有２种类型，一种为自由生活的根际细菌，另一种为植物内生细菌。它们可以采用不同方
式促进植物生长…，其中增加土壤中可溶性磷含量是ＰＧＰＢ促进植物产量增加的一条重要途径。全世界的土壤中磷元
素都比较缺乏，即使在肥沃的土壤中也是这样。这主要是由
对菌株的解有机磷能力进行初步测定。将５０株春兰根内生
细菌点接种于卵黄平板培养基上，２８℃培养２ｄ，观察有无溶
于土壤中游离态磷具有很高的反应性，易与土壤中的钙、铁、铝等元素形成不溶性的复合物而沉积拉。１，因此不能被植物直接利用。土壤中磷的缺乏严重影响了植物的生产力。土
壤中的磷主要以无机磷和有机磷２种形式存在。有机磷是
磷圈，并且根据溶磷圈直径（Ｄ）与菌落直径（ｄ）比值来初步确定各菌株的解有机磷能力。
春兰根内生解有机磷细菌的复筛采用钼锑抗比色
法¨“，对菌株解有机磷能力进行定量测定。将初筛得到的
可解有机磷的菌株接种到Ｒ２Ａ斜面培养基上，２８℃培养２４ｈ，挑取细菌于无菌水中，制成含菌量约１０８爪／ＩＩｌｌ菌悬液。各取１ｍｌ菌液，对应接种至蒙金娜有机磷液体培养基中，以加入１ｒｎｌ无菌水的空白培养基为对照，３次重复，２８℃，１６０
土壤全磷中的第二大组成成分。无机磷大部分为不溶性的
化合物；有机磷作为重要的固定化的磷库，占土壤磷含量的２０％一８０％∽１。因此释放低溶解性的和固定化的磷是增加土壤肥力的重要途径。研究表明，土壤、植物根际及植物根内均存在着大量的解磷菌（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ—ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｉｎｇ
ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎ—
ｒ／ｍｉｎ摇床振荡培养５ｄ。有机磷培养液在１２００３ｒ／ｍｉｎ下离
心３０ｍｉｎ，吸取上清液，采用钼锑抗比色法测定含磷量。
ｉｓｍ）¨ｊ，可将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用的形
式。春兰（Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍ
ｇｏｅｒｉｎｇｉｉ
Ｒｃｌｌｂ．ｆ．）是我国兰属的代表
解有机磷春兰根内生细菌的１６Ｓ
植物。刘琳等曾报道了春兰根内存在丰富多样的可分泌
ＩＡＡ和铁载体的植物促生细菌∞。７１。笔者主要对春兰根内生的解有机磷细菌进行了筛选和初步鉴定，以期发现更多的植物促生细菌，促进它在生产中的应用。１材料与方法
增细菌１６ＳＰＣＲ扩增选用菌落ＰＣＲ法。采用细菌
ＧＴｒＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣ
通用引物２７ｆ¨２１（５’．ＡＧＡＡＧ一３’）和
１４９２ｒ¨副（５７．ＧＧＴＴＡＣＣＴｒＧＴｒＡＣＧＡＣＴＴ－３’）扩增细菌１６Ｓ
ｒＤＮＡ序列，引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。
１．１试验材料供试菌株５０株分离自温室盆栽春兰根内
作者简介徐爱芳（１９８６一），女，河北唐山人，硕士研究生，研究方向：
微生物多样性研究，Ｅ—ｍａｉｌ：ｘａｆｌ９８６１１＠１６３．ｃｏｍ。
收稿日期２０１２—１２－２０
ＰＣＲ扩增程序为：９４℃预变性４
ｍｉｎ，９４
ｏＣ变性１ｍｉｎ，５４ｏＣｍｉｎ。
ｏＣ延伸４５Ｓ，３０个循环，７２℃延伸１０
１．５解有机磷内生细菌的１６ＳｒＤＮＡ序列测定及系统发育分析ＰＣＲ扩增产物直接送交宝锐通生物技术（北京）有限责任公司测序。测序结果利用ＢＬＡＳＴ软件（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃ—
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细菌16sRDNA
用27F和1492R pcr 怎么会有两条带？
细菌16sRDNA&&用27F和1492R pcr 怎么会有两条？是引物特异性不好吗？退火温度是55度，72度延伸2min，72度10min，体系：模板1微升，引物各1微升，50微升的体系。电泳图如下：其中3/4/2/5/6/7/8 模板为基因组（试剂盒提取的），1*/3*/4*/5*/8*模板为培养8小时的菌液（即菌落PCR）。&&请各位提出宝贵意见，多谢........................
我做过很多次条带都很特异，用的20微升体系，我想看下你合成的引物序列是不是有问题？
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扫描下载送金币利用细菌与莱茵衣藻共培养提高产氢量的方法
专利名称利用细菌与莱茵衣藻共培养提高产氢量的方法
技术领域本发明涉及生物制氢技术，具体地是一种将细菌和莱茵衣藻共培养提高产氢量的方法。
背景技术能源危机与环境污染都是当今世界面临的突出问题，氢气是一种清洁、燃烧值高、利用形式多样的可再生生物能源[1]。光合生物制氢技术能直接转化太阳能为氢能，特别是微藻光合制氢的底物是水，来源丰富，培养容易，不占用可耕地，是利用太阳能生产氢气的理想模式，成为目前国际上生物制氢领域的研究热点β]。莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)因为其氢化酶活性高、培养容易、生长速度快、遗传学背景清晰和转化容易等原因被选为微藻制氢研究的模式物种M。但是，衣藻的氢化酶活性很容易受氧气的抑制而失去活性[3’4]，而氧气又是衣藻光合作用的主要产物，是导致了衣藻产氢效率低的主要原因。目前降低莱茵衣藻细胞内氧气含量的方法主要是通过去除培养基中硫元素来抑制光合系统II活性、进而降低光解水产生的氧气[5]，但是该方法同时抑制了光解水所产生的电子产量，最终仍然导致产氢效率低[3_5]。因此，要提高莱茵衣藻的产氢效率就需要既降低细胞内的氧浓度又要保障电子的供应。目前最有效的莱茵衣藻产氢技术为两步法培养技术，即第一步为在正常TAP培养基条件下培养莱茵衣藻，以获得最大生物量；然后收集莱茵衣藻在缺硫培养基中进行产氢培养，最大限度获得氢气产量。莱茵衣藻在大规模培养时很容易污染其它细菌等微生物，在实验室继代培养过程中也很容易污染一些细菌，并且有些细菌能与莱茵衣藻长期共栖，不显著影响莱茵衣藻的生长。本发明对在实验室继代培养过程中与莱茵衣藻藻株cc849(以下简称衣藻)共栖的细菌进行了分离纯化，得到三株分离菌，命名为L2、L3和L4，经16S rRNA系统发生学分析鉴定，分别与嗜麦芽寡食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)菌株776、微杆菌 (Microbacterium paraoxydans)菌株 591 禾口假单胞菌(Pseudomonas sp.)菌株 A8 的 16S rRNA序列的相似性达到99 %，100 %和99 %。由于豆科植物根瘤中的固氮酶与莱茵衣藻氢化酶具有相似的特性，都对氧气敏感，但是固氮酶在自然环境中具有高效固氮活性，是因为根瘤中有根瘤菌的缘故。因此本发明还选取了慢生大豆根瘤菌与莱茵衣藻共培养，验证其对莱茵衣藻生长和产氢的影响。
本发明的目的在于提供一种利用细菌和莱茵衣藻共培养提高产氢量的方法，使之更适合于莱茵衣藻及其它微藻两步法产氢技术中的第二阶段增加氧气消耗和提高产氢量的方法。本发明将上述三株分离菌和一株慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)(以下简称根瘤菌)分别与纯净的莱茵衣藻藻株cc849在两步法产氢技术的第一阶段和第二阶段按一定体积比混合进行共培养，结果表明在第一阶段的营养生长时期，假单胞菌对衣藻的生长有抑制作用，其它三种细菌无显著影响。在第二阶段的产氢培养时期，上述四种细菌都能显著提高衣藻的产氢量，其最大产氢量分别是纯净莱茵衣藻cc849产氢量的4. 0 倍、2. 9倍、4. 1倍和5. 5倍。对藻菌共培养体系内氧气含量的检测表明呼吸耗氧的增加是细菌-衣藻共培养体系产氢量提高的主要原因。本发明的方法为衣藻两步法产氢技术中进一步提高产氢量提供新方法，随着生物制氢技术的发展，本发明将显现出越来越大的实用性和重要性。本发明方法的要点是本发明提供了一种在莱茵衣藻两步法制氢技术中的第二阶段，向衣藻培养体系中加入一定量的某种细菌以增加培养体系内呼吸耗氧和提高产氢量的方法及具体实施办法。本发明所使用的某种细菌是这样选取的在与莱茵衣藻藻株CC849共栖的细菌中分离并纯化出了三株细菌L2、L3和L4，经16S rRNA序列进行系统进化学分析，分别鉴定为嗜麦芽寡食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)菌株 776、微杆菌(Microbacterium paraoxydans)菌株591和假单胞菌(Pseudomonas sp.)菌株A8。它们都是能与莱茵衣藻共栖的好氧细菌。慢生大豆根瘤菌的选择是由于豆科植物根瘤中的固氮酶与莱茵衣藻氢化酶具有相似的特性，都对氧气敏感，但是固氮酶在自然环境中具有高效固氮活性，是因为根瘤中有根瘤菌的缘故。本发明在将上述四种细菌分别在两步法莱茵衣藻产氢技术中的第一阶段和第二阶段与纯净的莱茵衣藻cc849按照一定比例混合后共培养，证明了在第一阶段的营养生长时期，除了假单胞菌菌株A8抑制衣藻的生长，其它三种细菌对衣藻生物量积累没有显著影响；在第二阶段的产氢培养时期，在一定的藻菌体积比范围内，上述四种细菌均能显著促进衣藻的产氢量，尤其以根瘤菌的促进作用最大，最大可提高产氢量4. 5倍。这种结果及其用途是人们在微藻生物制氢领域一直寻求的。通过检测藻菌共培养体系的光合速率和呼吸速率，发现在衣藻培养液中弓丨入一定量的细菌显著增加了藻菌共培养体系的呼吸耗氧速率，尤其以根瘤菌的作用最为显著，是引起培养体系产氢量增加的重要原因，这种结果及其用途是人们在微藻生物制氢领域一直寻求和希望实现的。按照本发明，所用的细菌是能与莱茵衣藻共栖的好氧细菌——嗜麦芽寡食单胞菌菌株776、微杆菌菌株591和假单胞菌菌株A8以及慢生大豆根瘤菌，但不局限于这四种细菌，凡是对莱茵衣藻无毒性、并且能显著增加藻菌共培养体系呼吸耗氧作用的细菌和其它微生物都适用于本发明的方法。优选的细菌是慢生大豆根瘤菌、假单胞菌菌株A8和嗜麦芽寡食单胞菌菌株776。按照本发明，所用的莱茵衣藻为细胞壁缺欠型藻株cc849，是为了实验研究的方便，但不局限于该藻株，其它莱茵衣藻藻株和其它具有相似代谢特征的产氢微藻都适用于本发明的方法，特别是产氢量高的藻株品种更适合于本发明方法和更具有实际应用价值。在本发明中，对从莱茵衣藻cc849培养液中分离纯化出来的三株细菌进行16S rRNA序列系统发生学分析的物种分类鉴定，其中16S rDNA基因的克隆所用的通用引物为 27F(5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ‘)和 1492R(5' -GGTTACCTTGTTACGAC TT-3 ‘)，是本领域的技术人员所熟知和在生物信息数据库中能检索得到的信息。本发明的具体实例中该对引物是合成于上海生工公司。可选择的，合成于其它生物公司。在本发明中，用于16S rRNA系统发生学分析的软件——BLAST软件、ClustalX V2. 0软件和MEGA5. 05软件都是本领域技术人员所熟知和在生物信息数据库中能检索得到的信息。在本发明中，所用的进行PCR扩增的Taq酶和保存16Sr DNA基因的载体以及相关的分子生物学操作都是本领域技术人员所熟悉和公知的。在本发明的具体实例中，LA Taq 酶和PMD-19T vector购自于宝生物公司(Takara)。可选择的，购自于其它生物公司。本发明具有如下优点1、首次将能与莱茵衣藻共栖的细菌以及慢生大豆根瘤菌用于莱茵衣藻两步法产氢技术中。2、显著提高了产氢量。3、除了具有在生物能源生产方面具有重要应用意义，在(X)2减排、缓解温室效应等环境保护方面也具有重要生态意义。
图1三种分离菌的16S rDNA基因的PCR产物电泳图。M 分子标记；L2 分离菌L2 ； L3 分离菌L3 ；L4 分离菌L4。图2基于16S rRNA序列的莱茵衣藻藻株cc849的共栖细菌L2、L3和L4的系统发生学分析。图3莱茵衣藻cc849与分离菌L2、L3和L4以及根瘤菌共培养的生长状况。图4分离菌和根瘤菌对莱茵衣藻cc849产氢量的影响。图5正常培养条件下莱茵衣藻cc849及其与分离菌和根瘤菌共培养的呼吸速率。图6缺硫产氢条件下莱茵衣藻cc849及其与分离菌和根瘤菌共培养的呼吸速率。图7最佳产氢条件下纯净莱茵衣藻cc849及其与分离菌和根瘤菌共培养体系上方的氧气(A)和氢气(B)含量变化。
具体实施例方式一、莱茵衣藻培养A、选取细胞壁缺欠型莱茵衣藻藻种cc849，购自美国Duke大学衣藻藻种库；B、培养莱茵衣藻藻种(a)莱茵衣藻培养条件温度25 士 1°C ；日光灯光照强度100 200微摩尔光量子 /平方米 秒；50 IOOml三羟甲基氨基甲烷-乙酸-磷酸盐(TAP)培养基液体培养，初始 PH7. 2，水平摇床转速100 130rpm，每5 6天接种继代培养m ；(b)固体平板TAP培养基琼脂粉1. 5% ；挑取平板上的莱茵衣藻单克隆通过划线方法接种在平板上保存和纯化藻种，每2至3周继代一次；C、莱茵衣藻产氢培养条件使用氯化镁、氯化铁、氯化铜和氯化锌制备缺硫TAP培养基(简称TAP-S)[5]；将生长至对数期后期的莱茵衣藻3000rpm室温离心5min，收集藻细胞并用缺硫培养基洗3次，悬浮在缺硫培养基内，分别装入培养管，培养瓶上方留IOml的空CN
间，用翻口橡皮塞密闭；黑暗条件下培养M小时；然后放在光照强度60微摩尔光量子/平方米·秒连续光照件下培养，温度25士 1°C ；每M小时进行气体成分和含量检测一次；用气相色谱仪测定氢气和氧气含量分子筛型号5X1/8，柱长2m，内径3mm，热导检测器TCD，以氩气作为载气，柱温50°C，进样温度200°C，热导检测温度300°C;测气体的组成和含量；二、细菌的分离、纯化、鉴定和培养A、衣藻共栖细菌的分离、纯化和培养取不同生长时期染菌的衣藻培养液lmL，用无菌双蒸水稀释10人10_2、10_3三个浓度梯度，依次涂布于TAP培养基、TAP+大肠杆菌培养基LB (TAP培养基[7]和LB培养基[8]按照1
1的体积比混合)和YEM培养基M的固体平板上，分别置于25°C、28-30°C和37°C 的温度下培养，待有菌落长出来后，挑取单菌落于相应的液体培养基中继代培养。B、细菌的分子鉴定(a)、细菌基因组的制备取对数生长期菌液2mL，加入无菌离心管中，12，OOOr/ min离心5min。弃上清，向装有细菌沉淀的离心管中加入300 μ L10mg/mL溶菌酶，温育2小时。然后依次加入 15 μ L 10mg/mLRNAase,30y L 20mg/mL 的蛋白酶 K，100 μ L 10%SDS，混勻，65°C保温45分钟至澄清。再加入125 μ L 5Μ NaCl和100 μ L 10% CTAB，65°C温育30分钟，充分裂解细胞和去除多糖。然后按照提取DNA常规步骤用苯酚抽提、无水乙醇沉淀DNA， 最后将DNA溶解于纯水中备用。(b)、引物设计根据文献选取细菌16S rDNA基因扩增的通用引物 27F(5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ‘)和 1492R(5' -GGTTACCTTGTTACGAC TT-3 ‘)(合成于上海生物工程公司)进行PCR扩增[14]。(c)、PCR反应体系与条件PCR采用50 μ L体系，LATaq酶(Takara)，反应条件为 94°C预变性 5min ；94°C变性 60s，55°C退火 lmin，72°C延伸 Imin 30s, 30 个循环；72°C延伸 15min。PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测和纯化。(d)、PCR产物测序和克隆纯化后的PCR产物送华大基因生物科技有限公司进行测序。同时，纯化后的PCR产物与pMD19-T Vector(Takara)连接，然后转化到大肠杆菌 DH5 α细胞保存，并提取重组质粒进行目的片段测序的验证。(e)、16S rRNA系统发生学分析上述测序得到的16S rDNA基因序列提交 GenBanK,用 BLAST 软件(http//www. ncbi. nlm. nih. gov)与已知序列进行对比，用 ClustalX V2. 0软件进行排列，利用MEGA5. 05软件采用Maximum-Likehood方法绘制系统进化树并确定它们的系统发生学地位。三、慢生大豆根瘤菌的培养慢生大豆根瘤菌(B. japonicum)购于中国农业科学院，正常培养条件是^°C，黑暗培养，水平摇床转速200r/min，培养基是YEM(pH 7. 2)[15]，固体培养基含2%琼脂，每3周继代一次保种。四、细菌和莱茵衣藻cc849共培养方法A、正常条件下的共培养方法纯净的莱茵衣藻cc849在正常TAP培养基中培养至对数期中后期，将藻细胞密度调整为lX107cells/mL。每一种细菌培养至对数后期，分别4000g离心5分钟，用TAP培养
6基洗三遍去除YEM培养基，然后重悬于TAP培养基中。分别将每种细菌的浓度调整至0D_ 为1. 0。然后将30mL藻液与2mL细菌分别在IOOmL的三角瓶中混合，培养条件为温度25°C， 光照强度60 μ πιοΙπΓ、-1。以纯净的莱茵衣藻cc849作为对照，培每天取ImL藻液，显微镜下观察衣藻7天内的生长情况。B、产氢条件下的共培养方法取对数生长中后期的衣藻培养液，5000r/min离心5min，收集细胞。收集后的藻细胞用全缺硫的培养基(TAP-幻洗三次，然后悬浮在TAP-S中，测定其叶绿素浓度，按照每管 0. 5mg叶绿素的量分装在50mL的培养瓶内，同时将每种细菌的浓度调整为0D_为1，分别按照藻液菌液(体积比)为8
1的比例加入每管藻液中，最后用TAP-S补充至40mL，密封，黑暗M小时呼吸耗氧以诱导氢酶的表达。然后放在连续光照(eOymol.n^.s—1)的条件下培养，每隔M小时用微量进样器抽取瓶中气体，用高压气相色谱仪(GC)测定氢气和氧气的含量。从而得出最佳产氢量的菌液和藻液的体积比例。五、衣藻的生长情况以及光合和呼吸速率检测A、生长情况检测每天取ImL藻液，用血细胞计数板在显微镜下数藻细胞数。B、光合和呼吸速率的检测在衣藻培养过程中，每天取样上下充分混勻后取2ml的藻液加入Hanstech Dff/1 型氧电极仪的反应杯中，暗适应5分钟，记录反应杯中溶解氧下降的速率，即为呼吸耗氧速率；然后在不同光照条件下，记录反应杯中溶解氧上升的速率，即为光合放氧速率。数据分析后按照下列公式计算，即为呼吸速率V = S · K · 60 · 1000/P其中v为吸氧活性，单位是ymolA -mg^Chl化―1，S为曲线的斜率，单位是mirT1， K为常数，表示25°C下水中的溶氧量，单位是ymol02/ml，P为样品的叶绿素浓度，单位是 mgChl/ml,60表示60min，1000表示记录纸的满量程为1000。实施例1莱茵衣藻培养莱茵衣藻生长速度快、培养成本低、氢化酶活性高，是微藻光合制氢的代表物种。 为了使实验因容易操作，本发明优选细胞壁缺欠型的莱茵衣藻藻种cc849。①莱茵衣藻正常培养条件按照Harris主编的《The Chlamydomonas Sourcebook :a comprehensive guide to biology and laboratory use. New York
Academic Press. 1989》，优选条件 25 士 1 °C，日光灯光照强度(100
200ymol photons HT2S4)；液体培养是在 50
lOOmlTris-Acetate-Phosphate (TAP)培养基，初始 pH7. 2，水平摇床转速100 130rpm，每5 6天接种继代培养；固体TAP平板培养基含1. 5%的琼脂粉，藻种的保存和纯化是挑取平板上的莱茵衣藻单克隆通过划线方法接种在平板上，每3 周继代一次。②莱茵衣藻产氢培养条件按照Melis等(Plant Physiology. 7-136)的方法，莱茵衣藻的产氢培养是在缺硫培养基(TAP-S)中进行。缺硫培养基 (TAP-S)是把正常的TAP培养基的硫酸镁、硫酸铁、硫酸铜和硫酸锌分别换为等摩尔浓度的氯化镁、氯化铁、氯化铜和氯化锌。本发明为了将来在工业化生产中应用，有目的的简化了其产氢培养的操作步骤即将生长至对数期后期的莱茵衣藻3000rpm室温离心5min，收集藻细胞并用TAP-S培养基洗3次，然后悬浮在TAP-S或者含有不同浓度硫酸盐的TAP-S 培养基内，分别装在50ml的培养瓶内，培养瓶上方留IOml的空间，用翻口橡皮塞塞紧培养瓶密闭培养。放在黑暗条件下培养M小时，然后放在连续光照件下培养，光照强度50
IOOymol photons IrT2iT1,温度25 士 1°C。每M小时用微量气密进样器抽取瓶中气体，进行气体成分和含量检测。③按照冉春秋等(高等学校化学学报，-66.)的方法用GC测定氢气和氧气含量。气相色谱仪为Agilent Technologies GC 7890A，USA，分子筛5 X 1/8 (OD)，柱长2m，内径3mm，热导检测器TCD，以氩气作为载气。进样体积0. 5ml，柱温50°C，进样温度 200°C，热导检测温度300°C。用本领域技术人员公知的外标法计算氢气和氧气体积。实施例2衣藻共栖细菌的分离和鉴定①衣藻共栖细菌的分离、纯化和培养取不同生长时期染菌的衣藻培养液lmL，用无菌双蒸水稀释10人10_2、10_3三个浓度梯度，依次涂布于TAP培养基、TAP+大肠杆菌培养基LB (TAP培养基[7]和大肠杆菌LB培养基M按照1
1的体积比混合)和YEM培养基M的固体平板上，分别置于25°C、28-30°C 和37°C的温度下培养，待有菌落长出来后，挑取单菌落于相应的液体培养基中继代培养。利用TAP+LB、YEM和TAP三种培养基平板，初步对与莱茵衣藻cc849共栖的细菌进行分离，结果在TAP+LB混合培养基上分离得到两种不同特征的单菌落，分别命名为L2和 L3 ；在YEM培养基上分离得到一种单菌落，命名为L4。②细菌的分子鉴定分别提取三种细菌基因组DNA作为底物，分别用通用引物27F和1492R进行PCR 扩增，所得PCR产物分别为单一条带(如图1所示)，经电泳、回收纯化后测序，分别对每株细菌的16S rDNA基因的PCR产物测序，发现L2、L3和L4的16S rRNA基因序列在GeneBank 中分别与嗜麦芽寡食单胞菌菌株776、微杆菌菌株591和假单胞菌菌株A8的16S rRNA基因序列具有较高的相似性，相似度分别达99%、100%和99% (如图2所示)。实施例3细菌与莱茵衣藻cc849共培养的生长情况莱茵衣藻两步法产氢的第一阶段是衣藻在正常TAP培养基中的营养生长阶段，以获得最大生物量的积累。在此阶段，分别将上述分离得到的细菌L2、L3、L4和根瘤菌按照 2ml
30ml的菌藻体积比与纯净的莱茵衣藻cc849混合培养，以纯净莱茵衣藻cc849为对照，每天检测培养液的藻细胞数(如图3所示)，结果显示莱茵衣藻cc849与上述细菌分别共培养时，其生长的时间动态趋势与纯净莱茵衣藻cc849的相似，细胞数都在培养的第四天达到最大，分别约为 3. 67X IO7 个 /mL、3. 48X IO7 个 /mL、2. 90X IO7 个 /mL 和 3. 50X IO7 个/mL，纯净的莱茵衣藻cc849约为3. 56 X IO7个/mL。此结果表明L4菌明显抑制莱茵衣藻的生长，使细胞数降低了约18. 5%，是在莱茵衣藻培养中应该尽量避免污染的细菌。根瘤菌和其它两种细菌对莱茵衣藻的生物量积累无显著影响。实施例4分离菌和根瘤菌对莱茵衣藻cc849产氢的影响莱茵衣藻两步法产氢技术的第二阶段是在缺硫培养基中的光合产氢培养阶段，分别上述三株分离菌L2、L3、L4和根瘤菌按照不同的体积比与莱茵衣藻cc849混合，在产氢条件下共培养并连续检测产氢量的差别(如图4所示)。结果表明这些细菌对衣藻产氢量的影响与藻菌的体积比有关。当细菌的浓度为0D_ = 1、莱茵衣藻cc849的细胞浓度为12. 5mg叶绿素/L时，在适当的藻液菌液(体积比)组合下都使衣藻的产量显著增加，尤其是衣藻与根瘤菌按照100
1的体积比共培养条件下，产氢量是纯净莱茵衣藻cc849单独培养产氢量的5. 5倍，约为82. 95 μ mol ；其次是分离菌L2和L4在藻液菌液(体积比) 为80
1时，氢气积累量达到约60. 16 μ mol和62. 66 μ mol，是纯净莱茵衣藻cc849产氢量的4. 0和4. 1倍；分离菌L3对衣藻产氢的促进作用较小，它在藻液菌液(体积比)为 200
1时，氢气累积量最大，约为43. 83 μ mol，为纯净莱茵衣藻cc849产氢量的2. 9倍。结果表明，在产氢培养条件下，上述分离菌和根瘤菌、尤其是根瘤菌在适当的比例下能显著提高衣藻的产氢积累量，可以在两步法衣藻产氢技术的第二阶段引入衣藻培养体系以促进莱茵衣藻产氢量的提高。实施例5藻菌共培养体系的光合放氧和呼吸耗氧在正常TAP培养基和光照条件下，纯净莱茵衣藻cc849分别与分离菌L2、L3、L4 和根瘤菌按照anl
30ml的菌藻体积比混合共培养，但是用氧电极法检测不到光合放氧现象，只能检测到呼吸耗氧速率。如图5所示，在7天连续培养中的前3天，纯净莱茵衣藻 cc849的呼吸速率呈现逐渐下降趋势，在第三天达到最低，约为4. 22 μ mol O2. mg^chl. h"1, 之后又略有回升，但基本稳定在4. 46 4. 49 μ mol O2. mg—chl. h—1之间。当衣藻cc849分别与上述细菌共培养后，培养体系的呼吸耗氧速率均明显地呈现一直升高的趋势，尤其是与根瘤菌共培养体系的呼吸速率最高，最高达到5. 940 μ mol O2. mg—chl. h—1，提高了 32%， 与L2、L3和L4共培养体系的最高呼吸速率分别为5. 514 μ mol O2. mg^chl. 310 μ mol O2. mg^chl. IT1 和 5. 609 μ moIO2. mg^chl. tT1，分别提高了 23%、18%禾口 25%和。此结果表明这些细菌与莱茵衣藻共培养时，均显著加速了培养体系内的呼吸耗氧速率。在缺硫培养基中，即两步法产氢技术的第二阶段，上述细菌分别与莱茵衣藻cc849 共培养的体系中仍然检测不到光合放氧现象，但呼吸速率均非常显著地升高。如图6所示， 在产氢培养的第一天，藻菌共培养体系的呼吸速率均呈现最高值，与根瘤菌共培养体系的呼吸速率最高，约为34. 80 μ mol O2. mg^chl. h—1，提高了约5. 0倍之多，与L2、L3和L4共培养体系的呼吸速率分别约为 30. 80 μ mol 02.mg_1chl.r\26. 80 μ mol O2. mg-1chl. IT1 禾口 32. 27 μ mol O2. mg^chl. h—1，分别提高了 6. 6倍、5. 7倍和6. 9倍。在产氢培养的第二天，藻菌共培养液的呼吸速率开始迅速下降，下降了约39% 43%，到第三天时候降到零。在这一过程中，纯净的莱茵衣藻cc849的呼吸速率维持在5. 89 μ mol O2. mg^chl. IT1 6. 58 μ mol
Hig-1Chl. h—1。此结果表明呼吸耗氧速率的显著增加是藻菌共培养体系产氢量提高的重要原因。实施例6最佳产氢条件下藻菌混合培养体系中的氢气和氧气含量在两步法产氢技术的第二阶段，将莱茵衣藻cc849分别与上述各细菌按照产氢量最大的体积比混合，进行产氢培养。各体系中培养管上方的氧气含量和氢气含量的时间动态变化如图7所示。图7A显示所有藻菌共培养体系中的氧气含量都明显快速降低，基本都在培养的第三天就降到了最低值，约为5. 7% 6. 4%，并保持在这一水平。与根瘤菌共培养体系的氧气含量更是在共培养后的第一天就降到约6. 2 %，后期一直保持在4% 5%。 而纯净莱茵衣藻cc849在这一培养过程中的氧气含量下降缓慢，直到培养的第六天才逐渐降到最低，约为7.6%，并保持在这一较高的水平。相对应的，与根瘤菌共培养体系的氢气积累量最高(如图7B所示)，达到约83 μ mol,比纯净莱茵衣藻cc849体系的高约4. 5倍，与L2和L4共培养体系的最高氢气积累量达到约60. 1 61. 5 μ mol,比纯净衣藻体系的高约4倍；与L3共培养体系的最大氢气积累量略低，约为44. Oumol,比纯净衣藻体系的高约 3倍。此结果表明，根瘤菌与莱茵衣藻共培养最利于产氢作用，本发明分离纯化得到的嗜麦芽寡食单胞菌菌株776、假单胞菌菌株A8和微杆菌菌株591对促进衣藻产氢代谢的作用则依次次之。参考文献[1]Hemschemeier A, Melis A, Thomas Happe. Analytical approaches to photobiological hydrogen production in unicellular green algae. Photosynthesis Research.
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1.一种在莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)两步法产氢技术中提高产氢量的方法，其特征在于将好氧细菌与莱茵衣藻共培养。
2.根据权利要求1的方法，其中所述莱茵衣藻为莱茵衣藻藻株cc849。
3.根据权利要求1的方法，其中所述好氧细菌选自嗜麦芽寡食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)菌株 776、 微杆菌(Microbacterium paraoxydans)菌株591、假单胞菌(Pseudomonas sp.)菌株A8和慢生大豆根瘤菌 (Bradyrhizobiumjaponicum)。
4.根据权利要求1-3任一项的方法，其中在两步法产氢技术的第二阶段中将好氧细菌与莱茵衣藻共培养。
5.根据权利要求4的方法，其中所述好氧细菌为慢生大豆根瘤菌，在共培养体系中慢生大豆根瘤菌的浓度为OD6tltl = 1、莱茵衣藻的细胞浓度为12. 5mg叶绿素/L，藻液与菌液的体积比为100
6.根据权利要求4的方法，其中所述好氧细菌为嗜麦芽寡食单胞菌菌株776或假单胞菌菌株A8，在共培养体系中好氧细菌的浓度为0D_ = 1、莱茵衣藻的细胞浓度为12. 5mg叶绿素/L，藻液与菌液的体积比为80
7.根据权利要求4的方法，其中所述好氧细菌为微杆菌菌株591，在共培养体系中慢生大豆根瘤菌的浓度为OD6tltl = 1、莱茵衣藻的细胞浓度为12. 5mg叶绿素/L，藻液与菌液的体积比为200
本发明涉及生物制氢技术，具体涉及一种利用细菌与莱茵衣藻共培养提高产氢量的方法。将以慢生大豆根瘤菌为代表的一些好氧细菌按一定比例与莱茵衣藻混合培养，能显著提高产氢量。本发明为莱茵衣藻两步法产氢技术中进一步提高产氢量提供了一种新方法。
文档编号C12R1/01GKSQ
公开日日 申请日期日 优先权日日
发明者吴双秀 申请人:中国科学院北京基因组研究所