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&服务简介&&&&
&& &双荧光素酶报告基因实验也是验证microRNA与靶基因或靶位点相互作用的常用技术。miRNAs常与靶基因的非翻译区(常为3&UTR)结合，从而抑制整个mRNA的翻译。在体外验证实验中,常将预测靶基因的3&UTR或预测靶位点构建至荧光素酶编码区的下游，从而根据发光情况判断miRNA与预测靶基因的直接作用关系。
1、灵敏度高，无内源性干扰；
2、检测范围宽，大于7个数量级；
3、检测速度快，样品无需孵育等预处理；
4、操作简便，可以在同一管内完成2个荧光素酶检测。
1、构建荧光素酶载体（或客户自备载体）；
2、细胞培养与转染；
3、荧光素酶检测；
4、数据分析。
miRNAs&的基因沉默功能检测
1、miRNA表达载体或miRNA mimics
2、预测靶基因非翻译区的载体和序列
1、构建好载体的质粒和甘油菌
2、荧光素酶检测原始数据
3、数据分析结果
实验周期及实验费用：请咨询我司全国免费热线电话400 699 1663，或者登陆我司网站了解更多详情
&&&&&& 成立于2008年，是一家为科研机构提供实验技术的专业公司，尤其擅长于蛋白质组学和分子生物学等技术。经过三年多的不断努力与开拓进取，随着公司规模不断扩大，总部已经成功入驻广州萝岗区科学城国家级科技企业孵化器。因公司品牌战略需要，公司已正式更名为。&
　　目前，已经拥有一支经验丰富、优秀刻苦的实验技术队伍。公司各类实验的技术人员均有着深厚的理论基础和丰富的实验经验。本公司秉承着严谨科学、优质高效、不断完善的服务理念，以为中心，函括各类，面向生物医药企业、大专院校、科研机构、医院和个人，为生物医药研发、生命科学和医学研究提供全方位解决方案。目前，我们已经与中科院华南植物研究所、广州肿瘤医院、中山大学、浙江大学、武汉大学、上海海洋大学、西南大学、厦门大学等全国60多家科研单位建立了广泛的项目合作。
&　 感谢多年来广大客户对辉骏生物的支持与信任，我们将一如既往地为大家提供优质、高效、精准的各类包括、等着方面实验技术服务。本着客户至上的理念，辉骏生物科技的所有员工将竭诚为您服务，按时按质地向您提供各类实验报告。&
　　愿与所有致力于生命科学以及医药卫生领域的研究伙伴竭诚合作，开发拥有自主知识产权的创新性技术和产品，开创生物医药新天地。
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中国生物器材网 电话：021-《汉恒生物 荧光素酶实验原理》
汉恒生物 荧光素酶实验原理日期：
两种常用载体类型极其应用场景pGL3-Basic---用于转录因子结合位点与启动子活性分析。把待分析启动子区段构建到F-Luciferase上游，和转录因子共转染分析F-Luciferase活性即可反应启动子的活性高低。该质粒通常需要结合持续性表达R-Luciferase的载体作为内参以校正不同样品之间转染的转染效率(参考案例一)。技术线路根据实验目的确定设计方案学术、技术团队根据顶级学术论文真实案例协助方案设计根据实验目的确定设计方案采用汉恒HB-InfusionTM无缝克隆策略，提高载体构建效率psiCHECK2---miRNA与其靶点相关分析,包括miRNA靶基因验证(参考案例二A和B)、lncRNA (参考案例三)与circRNA (参考案例四)吸附miRNA验证等。需要把miRNA潜在结合靶点克隆到R-Luciferase (hRLuc) 3’UTR区域，然后与待测miRNA共同转染细胞内测定R-Luciferase活性高低，F-Luciferase （hLuc+）作为校正内参校正不同样品之间转染的转染效率。根据实验目的确定设计方案独家定制的转染试剂和病毒转导系统确保基因转导效率根据实验目的确定设计方案顶级商品化检测试剂盒和强大高效的检测仪器根据实验目的确定设计方案详实的原始数据，细致的结果分析，清晰的实验结论经典应用案例一LncRNA转录因子结合位点与启动子活性分析论文来源: Wang, P., et al. (2014). "The STAT3-binding long noncoding RNA lnc-DC controls human dendritic cell differentiation." Science 344(6181): 310-313.本文是曹雪涛实验室在2014年发表在Science上一篇研究性论文。作者通过芯片鉴定出DC (树突状细胞)发育相关的一个lncRNA，命名为lnc-DC。同时高通量测序也发现了这条差异lncRNA的存在。进而作者通过Northern Blot验证了这条lnc-DC。由于lnc-DC极其特异和稳定地高表达在DC发育过程的某一时期，所以作者假设lnc-DC可能是和表观遗传学调控事件相关的。为了验证这一假设，作者通过染色体免疫沉淀结合测序的技术-CHIP-seq和qPCR发现lnc-DC的转录起始位点（TSS）附近富集了Pol II、H3K4me3和H3K27ac等蛋白（下图A），提示DC发育过程中表观遗传学变化与lnc-DC的转录增强事件相对应。进而作者通过序列分析发现在lnc-DC的转录起始位点附近（+44-+50）存在一个经典的PU.1结合位点。作者假设PU.1参与了lnc-DC的特异性表达。于是作者设计了如下实验进行了进一步的验证（下图B）。作者把lnc-DC的启动子区段（-）及其不同的突变体版本分别克隆到F-Luciferase表达框上游，然后和转录因子PU.1表达质粒或者空载体（Vector）共同转染到模式细胞系HEK-293T，通过测量荧光强度的变化间接反应转录活性的高低。最终证明转录因子PU.1通过经典结合位点（+44-+50）介导了lnc-DC在DC发育过程中的特异表达。经典应用案例二LncRNA通过吸附miRNA调控靶基因mRNA的表达 (ceRNA)论文来源: Cesana, M., et al. (2011). "A long noncoding RNA controls muscle differentiation by functioning as a competing endogenous RNA." Cell 147(2): 358-369.作者通过表达分析发现了一条肌肉发育相关的lncRNA---lnc-MD1.前期功能研究发现lnc-MD1可以调控肌肉分化的时间。信息学分析发现这条肌肉特异的lncRNA上包含36个miRNA的结合位点。如果只考虑肌肉发育相关的miRNA和基因，36个候选miRNA里面只剩下miR-133和miR-135。作者通过荧光素酶实验进行了验证。首先作者把野生型及其缺失miR-133和miR-135结合位点的Lnc-DC1克隆到进R-Luc的3’UTR，然后分别与表达miR-133和miR-135前体的质粒共同转染到细胞进行荧光素酶活性检测（下图A和B）。证明lnc-MD1缺失存在miR-133和miR-135的结合位点。进一步的信息学预测，miR-133和miR-135分别靶向两个基因- MAML1 和 MEF2C。同样，作者还是通过荧光素酶实验进行验证。研究者把MAML1 和 MEF2C的3’UTR （WT）和miRNA结合位点缺失突变体（-mut）分别克隆在RLuc表达框的下游，然后和miRNA过表达载体共转染细胞进行酶活测定。结果显示miR-133和miR-135确实分别靶向了MAML1 和 MEF2C两个基因（下图C）。最后的模型是lnc-MD1通过ceRNA机制吸附miR-133和135，正向调控了MAML1 和 MEF2C的表达，参与调控肌肉发育。经典应用案例三LncRNA通过吸附miRNA调控其生理功能 (ceRNA)论文来源: Kallen, A. N., et al. (2013). "The imprinted H19 lncRNA antagonizes let-7 microRNAs." Molecular Cell 52(1): 101-112.H19属于非常保守的印记基因家族，在胚胎发育和生长方面发挥极其重要的功能。为了进一步研究 lncRNA H19的功能，作者通过信息学分析发现H19包含let-7的4个结合位点。于是作者推测H19可能会影响let-7发挥作用。为了验证这一预测，研究者把4个let-7潜在结合位点串联起来克隆到RLuc的3’UTR区。然后先后跟let-7的抑制型载体（下图A和B）和过表达载体（下图C）分别共转染到细胞系检测荧光素酶的活性，证明Let-7的结合位点确实存在且发挥功能。进一步证明H19通过RNA sponge的机制影响let-7家族靶基因的表达参与肌肉发育调控过程。经典应用案例四circRNA通过吸附miRNA调控其靶基因mRNA的表达 (ceRNA)论文来源: Zheng, Q., et al. (2016). "Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs." Nat Commun 7: 11215.环状RNA (circRNA)是非编码RNA领域一类新的明星分子，研究者对其功能还知之甚少。本文中，作者鉴定出一个表达量较高的环状RNA分子-circHIPK3. circHIPK3来源于基因HIPK3第二个外显子。RNAi干扰circHIPK3可以影响细胞的生长。为了进一步研究其机制，作者通过序列分析发现circHIPK3含有一些列miRNA结合位点。为了从中筛选出真正的miRNA，作者构建了基于荧光素酶的筛选系统---把circHIPK3构建到Luciferase的3’UTR区域，然后分别与424个miRNA mimics共转染到模式细胞系HEK-293T内进行筛选验证，最终作者筛选出9个候选的miRNA。通过功能试验和共表达分析进一步验证得到mir-124是阳性候选miRNA。最终作者证明circHIPK3通过吸附miR-124正向调控了其靶基因IL6R 和 DLX2的表达，影响了细胞的生长。ABC1.61.2OD4500.80.40.0Fold changeFold change-19iR-3iR-3iR-5iR-6iR-iR-iR-iR-mDmmmmiRmmmmmFold changeEcircHIPK3 level (copies)mmBraLuHeSatomlCo5iR2-193amiR-2m9aiR-29bmiR-338miR-3m79iR-584miR-654miR-124 level (log)CN-1iR24NC423aab3879841215292954iR-1Liv本文由()首发，转载请保留网址和出处！
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