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PCR有时能出来带有时出不来
最近做一个PCR，很难做，要么能出来条带，很暗，要么完全看不到条带，试了各种体系，模板是上次同学P出来的，因为条带也暗，没有稀释过，反正出不来。偶尔一次用出来的条带再p，完全没有。想哭啊，现在模板都快用完了，怎么办呀。
嗯是的，而且普通PCR出不来，我用的是TD
关键是只有他的东西了为模板了，我给别人做呢，没测过浓度，也没测序过。
没测过浓度也没测序，就拿来做模板么。。。:sweat:
实在不行，就换用好的聚合酶吧。
还有一个方法，是连接到亚克隆载体上，然后转化感受态提质粒再用来做模板，不过要是你的模板不够的话就不好说了。
没有其他的模板么？只要是有表达的基因，总可以用cDNA来做模板的吧。
嗯，我之前也想过连T载体，但是有条杂带比目的条带亮，感觉行不通。这个模板好像是他们做重叠pcr得到的，所以要没有的话只能重新再来，很郁闷的说，关键这不是我的东西，这么不顺利感觉压力好大呀。
他们自己做完居然不测浓度也不测序，相当不靠谱诶。。。
要是模板量还有些的话就试试连载体吧，然后做菌液PCR找你要的条带，阳性菌落的比例估计会比较低但也不是不可行。
还有就是你用的是什么聚合酶？最好用好一些的，然后查查你的序列GC含量高不，哪怕只是有一段GC重复比较多的，都有可能会影响你的PCR。如果是因为GC含量，可以试着加GC enhancer，会有帮助的。我以前有遇到过目的基因中间有一段大量GC重复序列，很难扩增出特异性产物，扩出来也经常丢碱基。后来加了GC enhancer就解决了，你也可以试一下。
我突然想到这个模板是不是要稀释呀？因为我一直觉得模板浓度不高所以也没稀释，但是看他们之前P出的条带不是现在的模板，但是据他们说那个模板几乎看不到目的条带，而我昨天看了下现在的模板，条带虽然不亮但还是很清晰的，会不会是问题在这儿？
至于连载体我还是觉得不行，主要下面那条杂带比目的条带多，我得阳性菌落很难找到
我用的是TAq和pfu，你说的GC含量这块儿是没注意过，从来没遇到这样的问题。
总之很感谢，你分析的方法很有用啊，谢谢
哈哈，应该的嘛。我昨天也一直忘了说，就算他们没测浓度你自己还是可以拿去nanodrop上测一下的嘛。不过你说条带暗的话应该浓度不会太高，一般100-200ng就可以看到清晰的条带的，这个量用来做模版足够了。你跑胶看模版的时候也可以根据ladder的亮度稍微推测下，看你的目的条带大概有多少。
问题解决了的话也最好能说一声哦，希望你的实验顺利。
主要我感觉我们这边测浓度的不准，一下很低，一下飙到很高，只能自己大概估一下，而且，要测的话岂不是杂带的量也算上了？还是得自己估算。我觉得我的估计也就十几ng太暗了。我再看看吧，等解决了告诉你哈，有可能我得重头开始做，呵呵，也希望你一切顺利。
这个也做过，还是不行
那就是确定模板有问题
嗯，模板不好
额，这个是什么作用呢？
嗯，谢谢，不过试过了还是不行。
嗯，应该查查，谢谢
嗯，确实，含量很低
你好，我的克隆出来了，测序结果也正确的。之前做的调整都不行，后来我直接重头开始做的，自己一段一段合成的，就是最后一段有杂带，我浓缩以后直接酶切，然后切胶回收的。早知道前面就不浪费时间了，直接自己做，呵呵。不过实验中我的模板有的需要稀释才能出来，有的不用稀释，温度都没变过，最后一步合成做了梯度，然后取最好的温度P的，然后片段就按前面说的处理的。还有就是我的最后一步又重新合成了两个短的引物，这样整个片段更容易P出来，效果会好点。嗯，就这么多了，呵呵。:hand:
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求助 琼脂糖凝胶上回收PCR产物
用PCR产物回收试剂盒尝试从琼脂糖凝胶上回收PCR 产物，但每次用回收的溶液再次电泳都得不到条带，我用的是无菌水洗脱，时间为20分钟，洗脱前55度预热， 同时尝试过TE（PH约为8）仍然得不到条带。哪位高手做过类似的实验，请赐教，不胜感激！
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【求助】师兄师姐,老师们,帮帮我!!! real time pcr 得不到产物,但是regular pcr 有产物
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这个帖子发布于8年零168天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
大家好!!! 我有一个非常非常着急的困难,我的regular pcr95 5 min95 1 min62 1 min72 1 min72 10 min35 cyclesprimers:MMP-2
(sense primer 5’-3’) GCGACAAGAAGTATGGCTTC
(antisense primer 5’-3’) TGCCAAGGTCAATGTCAGGA product is 394 bpMMP-9
(sense primer 5’-3’) CGCAGACATCGTCATCCAGT
(antisense primer 5’-3’) GGATTGGCCTTGGAAGATGAproduct is 406 bp50 ul regular pcr , 因为产量低, 所以20 ul running gel, 可见明显条带但是real time pcr SYBR GREEN95 3 min95 15sec60 45 sec
45cyclesand 95 3min95 15 sec62 30 sec72 30 sec
45cycle都没有产物.请各位师兄师姐,老师们,帮帮我!!!在此不胜感激!!!
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cybegreen 会影响DNA分子的TM值4-8度，建议在常规PCR时也加入Cyb green 优化反应条件到看到特异条带为止，再用优化条件上real time PCR.
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丁香园准中级站友
你用的什么型号的定量PCR仪？我在罗氏上碰到过类似问题
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rotorgene6000
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请问，您是怎怎莫解决的？
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建议楼主，RG6000跑完了之后，去跑个凝胶电泳，如果有条带说明是机器程序没设好。
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没有条带, 跑过了.
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我现在也遇到了同样的事情，请问你只怎么解决的，请指点指点，谢谢！！！
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第一要确定你的染料没问题。我建议你先完全用你做普通pcr的条件做一个qpcr，看看有没有条带，如果没有，说明是染料对体系的影响，如果有条带是你qpcr仪读荧光值的问题（比如有的仪器要延伸45秒以上才读荧光值）其次我建议你换引物，qpcr推荐的产物是200bp一下，一般的产物片段太大，最后的溶解曲线也看不出来的，其实也不知道是不是真的p出来了，有时候杂带和你的目的条带的位置很近，你p的效率这么低我还真怀疑不是目的条带。MMP2和9我也p过，你换个引物试试看。
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-------------------------------------------------------------------------------- 我用的是ABI7500做的是荧光定量检测基因突变，我第一次扩增时有扩增曲线，第二次用其他样本做，做了八个标本只有一个出现了扩增曲线，其他均无扩增曲线出现，第三次我把第一次和第二次的的标本放在一起做，条件与第一次一样，可是这次也一条扩增曲线都未出现，第四次我把引物换了（我前面用的引物是从原始管仲分装的）即从原始管中重新分装了结果还是没有一条扩增曲线，标本和其他加样都与第一次相同，还是没有出现扩增曲线，后来我有把这几个标本重新做了普通PCR，跑电泳后可看到目的片段，再把扩增产物加了探针后，在定量仪中扩增，仍然，没有扩增曲线，几天我把探针和酶全部都换了新的还是没有扩增曲线，怎么回事啊，各位大侠帮帮忙，我快崩溃了！跪谢！！！！！！
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【求助】为什么RT-PCR的产物量低
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这个帖子发布于11年零157天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我的转导的细胞2X10^5提取RNA 后,为什么RT-PCR的带好弱好弱,请问是什么原因,有什么改进的方法?是不是我的模板太少?我做的35个循环,请问可不可以再取出1微升再做PCR?
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sword20000 edited on
可能存在的问题：（1）你的RNA有降解了，RT得到的产物少（2）PCR引物设计的问题，有时引物设计不合理导致拉出的产物量很底你可以分步检测问题出在哪里，一般35个循环足够了。如果不是用于要求保真度较高之类实验，你可以再次P的，不过如果引物不合理，就需要更换引物
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你的细胞浓度比较低。RT-PCR的带很弱，应该跟你的RNA量比较少有关系。我有遇到相同的情况，用以下两个方法解决的：1、一般1ml trizol 裂解后加入1ul Glycogen 混匀后，再加入氯仿200ul，继续下面的步骤；2、将35个循环加大到40个循环（但是这个用起来得注意实验所在的环境是否好，如果有少量污染，就会造成假阳性的结果。）
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你的细胞数是不是少了点啊,b-actin怎么样啊?RNA紫外定量了吗?要保证RT的RNA摸板量 啊.条带弱可以通过改变条件试试看:1.将退火温度降低一度.2.增加CDNA的量.3.增加循环次数.4.增加镁离子的浓度.5.增加反应体系的体积.另外,引物的质量很重要啊，要是在保证CDNA质量,和优化条件的情况下没有改善,很可能就是引物的问题了.你可以多定几个试试看,反正也不是很贵,相对于一个课题组来说,毛毛雨 了
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可能存在的问题：（1）你的RNA含量低或者有降解了，RT得到的产物少（2）PCR引物设计的问题，有时引物设计不合理导致拉出的产物量很底,如果引物不合理，就需要更换引物 你可以把引物跑个电泳看看,你可以分步检测问题出在哪里，一般35个循环足够了.条带弱可以通过优化条件试试看:1.将退火温度降低一度.2.增加CDNA的量.3.增加镁离子的浓度.
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RT用到35个循环够了吧？再多就不好了。
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谢谢大家,原来是做PCR的酶不好,换了个酶就好了,谢谢大家的帮助!
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请问songjane，你用的PCR酶是EX-TAQ吗？我以前也扩得好好的。可现在什么都没有了。我也怀疑过是不是酶出了问题，因为我自我觉得cDNA的质量跟以前没有很大的差别吧！
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