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阴性对照一直有扩增怎么办
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刚开始做定量PCR，用的SYBR染料法，阴性对照（只加水）总是有扩增，Ct值都在35以下。之后换实验室、换水、换枪，引物重新合成，试剂也是新开的，但是还是存在阴性扩增，电泳检测，NTC条带和目的基因的一致。现在用UDG试剂做的，问题仍然无法解决，实在想不通是什么原因？实验室有个老师半个月就把定量做完了，我这都做了2个月了。求大神赐教啊！！！
不知道邀请谁？试试他们
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是不是有污染？
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可能有扩增参与的污染，建议分开在超净台上加模板和配体系
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用UNG不会改变的.UNG/dUTP防污染是要从一开始就做的，就是开始的时候做PCR需要加dUTP,然后UNG可以切开PCR产物，如果开始的PCR产物没有dUTP,UNG也是没有效果的。如需设计引物，可以添加为青生物公众号，由专业人员提供免费荧光定量PCR引物设计服务
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我这几天也在做，问题跟你一模一样，我也还未解决，我如何有办法了再告诉你
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我们老师配引物配少了，于是留了几个DEPC水作对照，
Ct值也挺高
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cutnuts 我们老师配引物配少了，于是留了几个DEPC水作对照，
Ct值也挺高我们的是三蒸水灭菌后用的，NTC有扩增，做过引物加倍和减半，效果还是一样......
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谁听风景 我这几天也在做，问题跟你一模一样，我也还未解决，我如何有办法了再告诉你请问你的问题解决了么？我的普通PCR电泳检测，有的NTC能扩出来，有的没有。但是定量的时候还是有峰和CT值
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zxf1991 谁听风景 我这几天也在做，问题跟你一模一样，我也还未解决，我如何有办法了再告诉你请问你的问题解决了么？我的普通PCR电泳检测，有的NTC能扩出来，有的没有。但是定量的时候还是有峰和CT值还没解决呢，不过我怀疑是不是循环程序的问题，你的循环程序是正确的吗？
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谁听风景 zxf1991 谁听风景 我这几天也在做，问题跟你一模一样，我也还未解决，我如何有办法了再告诉你请问你的问题解决了么？我的普通PCR电泳检测，有的NTC能扩出来，有的没有。但是定量的时候还是有峰和CT值还没解决呢，不过我怀疑是不是循环程序的问题，你的循环程序是正确的吗？是的啊，按说明书来的，程序是没问题的。50度2分钟，95度10min，三步法：95度5s，55度15s，72度30s，40个循环。
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zxf1991 谁听风景 zxf1991 谁听风景 我这几天也在做，问题跟你一模一样，我也还未解决，我如何有办法了再告诉你请问你的问题解决了么？我的普通PCR电泳检测，有的NTC能扩出来，有的没有。但是定量的时候还是有峰和CT值还没解决呢，不过我怀疑是不是循环程序的问题，你的循环程序是正确的吗？是的啊，按说明书来的，程序是没问题的。50度2分钟，95度10min，三步法：95度5s，55度15s，72度30s，40个循环。
有的时候是引物浓度太大了，有的试剂盒要求是10umol，你可以再进行稀释试试
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我们做的阴性对照也是出来峰和ct值了，后来做各种跑胶鉴定，初步推测该是引物二聚体的原因。试试换新引物或者降低引物浓度，正在摸索中....
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气溶胶，把实验室通风，然后就好了
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以前有一篇帖子说是因为跑胶和pcr靠的比较近，然后空气中有核酸片段，你看看你们那儿是不是。还有，问别的实验室借一下新的pcr罐子，做的时候戴口罩，问别的实验室借一下水，有可能的话去他们那儿做一下看看。
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试剂有污染吧。建议pcr试剂配置不要和样本处理在同一个地方，样本处理过程中会产生气溶胶，很难根除，试剂配置最好在不同的房间，防止交叉污染。
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在超净台里面配置体系，把试剂等=，枪头等都换了再做的看看，同时看看引物特异性怎么样，要是引物二聚体太多，阴性对照也会出现Ct值等的
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PCR阴性对照假阳性问题
最近用文库做PCR时，发现阴性对照出现了假阳性结果，于是更换了所有试剂，但是假阳性结果依然存在，然后再度更换所有试剂，假阳性结果仍然存在。不知道是什么原因导致的了，希望各位高手指点。
我做的对照组是水为模板，实验组是以文库为模板。
我的PCR加样过程是在生物安全柜中完成的，所以好像不会是您说的影响
试剂我都已经换了2批了，貌似不会再是试剂问题了..
大约半个月前我的阴性对照一直是正常的，然后不知怎么就出问题了..
没有，但是我每天都会用新手套，请问一下这样也要用乙醇擦吗？如果用乙醇擦过后会不会对PCR结果有影响？
不会有影响 这些是我们组总结出来的
发展到后来 污染太严重 我们用稀次氯酸钠擦 都不用酒精了
还有配mix的地方真的还要和加模板的地方分开
一般我是戴第二层PE手套加模板 加完以后放到机器里面 扔掉PE手套再去放抢啊以及之前的试剂之类的
深受污染痛苦的偶以及组员们总结出来的有效办法
这个一定是污染的问题了，试剂一般是没有问题的，但通常都会往这方面想，如果是试剂问题，连假阳性都不会有，所以肯定是污染问题，而且污染的问题还是比较严重的，用75%的乙醇把操作台彻底擦一遍，并用紫外灯照射1-2h，相信就没什么问题的，关键是我也有这样的经历，也是换试剂的都不管用，最后彻底大消毒了下就OK了~赶紧试试~:tiger28:
想问楼主，后来你那个假阳性问题怎么解决的？
谢谢你的回答，我们当时的确是气溶胶污染导致的！
谢谢& & 已经找到问题所在了，是气溶胶问题
请问怎样彻底大消毒？
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PCR常见问题
PCR常见问题
来源：互联网
点击次数：1371
PCR产物的电泳检测时间 一般为48 h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48 h后带型不规则甚致消失。
假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有：
①模板核酸的制备；
②引物的质量与特异性；
③酶的质量；
④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
①模板中含有杂蛋白质；
②模板中含有Taq酶抑制剂；
③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白；
④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚；
⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：
①选定一个好的引物合成单 位。
②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有 引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条 带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条 亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融 或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20 ul、30 ul、50 ul。或100 ul，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20 ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出 现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影 响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下 扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
假阳性 出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增 时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳 性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交 叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：
①操作时应小心轻柔，防止 将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或 器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。
③必要时，在加标本 前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污 染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
出现非特异性扩增带 PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：
①必要时重新设计引 物。
②减低酶量或调换另一来源的酶。
③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。
④适当提高退火温度或采用二温度点法(93 ℃变性，65 ℃左右退火与延伸)。
出现片状拖带或涂抹带 PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：
①减少酶量，或调换另一来源的酶。
②减少dNTP的浓度。
③适当降低Mg2+浓 度。
④增加模板量，减少循环次数。
克隆PCR产物的最优条件是什么？ 最佳插入片段：载体比需实验确定。1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行。应测定比值范围。连接用5 ul 2X连接液, 50 ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10 ul。室温保温1小时，或4 ℃过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4 ℃过夜。
PCR产物是否需要用凝胶纯化？ 如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。
如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？
（A）涂布未转化的感受态细胞。如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。
（B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。例如，将1 ug/ul质粒1:100稀释,1 ul用于100 ul感受态细胞转化。用SOC稀释到1000 ul后，用100 ul铺板。培养过夜，产生1000个菌落。转化率为： 产生菌落的总数/铺板DNA的总量。铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10 ng DNA，用SOC稀释到1000 ul后含10 ng DNA，用1/10铺板，共用1 ng DNA。转化率为：1000克隆X10（3次方） ng /铺板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ ug感受态细胞如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。
（C）如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生&20-40蓝斑（用指定步骤10（8次方）cfu/ ug感受态细胞），表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA连接酶（M1801，M1804，M1794）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。
（D）用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生&20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落，连接有问题。
对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？
（A）连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4 ℃过夜。
（B）插入片段带有污染，使3`-T缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM-T正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3`-T缺失。
（C）插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照射，时有发生。UV过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必需重新纯化。
（D）带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料（TM042）。
（E）高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞
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菌落PCR (菌液PCR)收藏
菌落 PCR 与我们通常的普通 DNA 的 PCR 的不同在于，直接以单个菌作为模板。是一种可以快速鉴定菌落是否为含目的质粒的阳性菌落。操作简单，快接，阳性率较高，在转化鉴定中较常见。 操作方法： 1，挑取单个菌落，可以用高压灭菌的牙签。现在含抗性的平板上画线，做保种用，然后置于20ultriton－x100 中搅和一下，将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号 2，将装有 20ulTritonx－100 的 EP 管 100 度煮 2 分钟 3，按照菌中预期包含的质粒加好 PCR 体系，建议做 20ul 体系，模板加煮过的菌的上清 1ul 4，上机即可。退火温度可以稍低，虽然没有什么根据可言，但是个人经验，推荐比质粒 PCR时稍低 5，电泳，看结果，阳性的菌落对应的板子可以直接挑菌小摇，保种或者送测序都可以
我的做法是： 用枪头挑选单菌落到装有 20uL 水的 pcr 管中，然后悬浮菌液。 在做 PCR 时，吸取 1uL 做摸板，但电泳检测后，选有阳性克隆相对的菌液 10uL 与试管的液体培养基中培养。这样做，
既初步检测了阳性克隆，又保存了所需要的菌落。 当然，在挑菌时也有用接种环挑的，
有用牙签挑的，
看个人的爱好了
我们都是直接拿牙签挑单菌落往 PCR 反应体系中搅拌一下，一般都能鉴定出来。想节省麻烦的话，还可以菌落鉴定同时挑单克隆，用 1.5 的 EP 管装 1mL 左右培养基，牙签挑出菌落后先在培养基上搅拌然后再放到 PCR 反应体系中。
把 PCR 体系先加好，用接种针直接往菌落上戳一下然后伸到体系里面晃晃就可以上机 P 了，我每次都是这样，可能是最方便的方法了。
取 200ul 水，牙签挑菌，煮沸 5‘，冰浴 5’，12000rpm，取上清 5ul 做模版。其他的和普通 pcr一样。
我们都是用过夜培养的菌液 0.3ul（不要超过 0.5ul）做模板，很简单的，其它都不变。先 94度 5min
裂解菌，最好 5min 后再加入 taq 酶。
是的，菌落 PCR 不难。。但是如果发现结果出现非特异带，在目的带位置有很弱的条带出现，最好再用液体培养后再做一次 PCR,我就因为这个阴性结果折腾了 1 个月。。扩培后再作菌落PCR 就得到阳性结果了。。
我是这样做的,取菌液 60ul 至 ep 管中,沸水中煮 5min,离心,取其中上清 1ul 作模板,屡试不爽
拿牙签点一下菌落然后再体系里面涮一下就可以了 如果觉得不可靠，就索性接个种，摇个小管，然后取 1ul 作模板 模板如果太多了，引物就不够用了，显然扩不出来，这种现象在质粒这种模板的 PCR 里面很多，你提出来的质粒不要忘记稀释
菌落 PCR 能够筛选阳性克隆.
象你的实验中出现的这种假阳性结果,
也不是什么太反常的事情,
细菌本身的基因组也是反应系统中的组分,
所以难免有些假阳性的结果.
建议多用几对不同的引物扩增,
以增加真阳性筛选结果.
一般会出现假阳性，可能是粘在菌落上的目的基因被污染，建议引物一个为目的基因一个为载体上的，用无菌牙签挑取菌落，在配好的 PCR 体系中赞一下，PCR 反应条件为 95 度 10 分钟 94 度 40 秒退火 55 度 40 秒 72 度 1 分钟 30 个循环
建议酶切后鉴定时同时取一个未做酶切的质粒做对照，明确是否能切断，再考虑是否能切出目的片段。 假阳性并不高，可挑菌落摇菌 12 小时以上再取菌液 pcr,初始变性温度可设为 98 度。
我们一般将接种好的菌液煮沸 15min，4000rpm 离心 5min，用上清作模板，效果很好。
非常方便的方法,我做了不知多少次,从未失手. 1.挑取菌落加入 50ul dd 水中,振摇. 2.99 度, 5'灭活菌液中的酶 3.12000rpm 离心 1'去除细胞碎片 4.取上清 pcr,50ul 体系取 10ul
我做就是将菌株挑一点点加入 PCR 体系中,涮一涮.我没有煮沸和离心.剩下的菌落放到 37 度继续让它长大一些,方便接种. 刚做的时候强烈建议大家要做阴性对照和阳性对照,因为有时候会有假阳性,即使阴性对照也会在目的位置出现条带,只是亮度弱一些而已. 我的经验是:若是真阳性,会很亮,让你不会怀疑;如果似有似无,一般都是假阳性.
菌落 PCR ，菌液 PCR（菌液的体积不能过大，大了会影响 PCR 体系，导致扩增不出来，一般取 0.3 微升左右就行了）都可以的，一般 10 微升的 PCR 体系，跑样时用小梳孔，（凝胶使用第一次时做回收用，将溴酚兰及核酸以外的凝胶割下来，就可以再用来做鉴定胶了，一般鉴定用的旧胶用２次都是可以的，比较节省）。
理论上，基因特异性引物和载体上的通用引物都是可以的。最重要的是带 marker,先判断大小。当然最后还要提质粒酶切鉴定一下。一般 PCR 阳性的菌，正确的可能性非常大。但也不排除PCR 阳性，但酶切阴性的可能，因为如果基因是 PCR 后克隆到载体的，可能会存在碱基突变的可能。 所以需要 PCR 和酶切两种方法鉴定。但最终应以测序的结果为准。
跑得很好的电泳：200v，我的目的片断是 400 多 pb，2%普通胶，跑了大概 20 分钟左右吧
菌落 PCR 很容易出现假阳性，可能与菌落本身的含量过于复杂所导致的 1。用载体引物来作一般可以降低假阳性。 2。菌落 PCR 作出来如果都是阳性或是阴性都不对，如果出现有的有，有的没有，那么可以将其摇成菌液，作菌液 PCR，或是直接再次涂版，然后提取菌落作 PCR，如果个个都是，证明准确。 3。菌落 PCR 的假阳性很引物本身有很大的关系，所以建议鉴定做好还是酶切最为可靠，我吃过很多关于菌落 PCR 的亏，所以建议还是酶切
试一下热启动，可以消除引物二聚体。
缺牙要及时修复，揭秘种植牙如何做到几十年不掉？
请问一下有没有菌液电泳的相关资料啊？
加100ul LB（含相应抗生素如氨苄青霉素）至菌落稀释的1.5ml EP管，然后拿去培养，EP管可以固定在漂浮板或者放在EP管架上用纸包好。培养好的菌液离心倒去上清液，用残留的液体分散菌体沉淀，加入30ul的破菌电泳缓冲液（SDS 0.5%,Tris-HCl 0.04mol/L,EDTA 0.002mol/L,蔗糖 0.4mol/L，溴酚蓝 0.02％，NaOH 0.1mol/L），50-70度C水浴15min，12000r/p 离心15min，取上清液30ul电泳，染色后观察，也可以使用前先把染料加入到破菌电泳缓冲液中，比例是一般电泳1/4，如果感觉多了再减少。
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【求助】为啥连接了4次 菌落PCR结果都是这样，究竟是哪...
查看完整版本请点击这里：
大连宝生物pmd18-t& &连接30分钟 三个小时 和过夜都试过&&用公司的感受态菌斑长得很多 密密麻麻的&&，引物用M13-47，48&&目的片段大小为1800bp ,为啥连接了4次 菌落pcr结果都是这样啊查看完整版本请点击这里：
菌落检测.jpg
changlhsyo ( 20:26:04)
T-载体现在不好用，而且比较麻烦
free ( 20:26:47)
怎么感觉都是引物二聚体呢 是没连接上么 原因很多 希望你能顺利解决
INK ( 20:27:20)
QUOTE:原帖由 free 于
20:26 发表
怎么感觉都是引物二聚体呢 是没连接上么 原因很多 希望你能顺利解决 我开始也认为是引物二聚体 我同学说是我没连进去 引物皮 的是载体的两边
duoduo ( 20:27:41)
先确定你引物和pcr体系有没有问题，做一下阳性和阴性对照，另外建议换一批感受态试试
yueban-1147 ( 20:28:05)
不知道你连接时的温度是多高呢
yueban-1147 ( 20:33:03)
在室温连接效果好一些，高GC含量的也可以试试
yueban-1147 ( 20:34:14)
和我之前遇到的情况基本一样，和我的目的片段长度和载体也一样；按说明书连接和转化，我涂板用的是LB，抗生素很重要，浓度是100微克/毫升，有筛选作用，多数大肠杆菌都会被杀死。转化后摇菌一小时，看到明显浑浊后即可涂板，我是稀释5倍后用用100微升涂板，37度培养12小时左右（不要培养太长时间，会有很多卫星菌落），运气好的话会有十几个菌落，然后菌落PCR，和普通PCR一样，没有特殊之处。没有的话重新涂板，适当减少稀释倍数，加大涂板量。good luck to you!
yueban-1147 ( 20:34:51)
如果连接成功了，条带会很亮，我连的954bp,最左边一个是阳性对照，其他都是挑选的模板菌落。测序结果很好。
菌落pcr.jpg
ha111 ( 20:35:18)
我现在做的菌落PCR一次都没有成功过，只能老老实实的挑克隆，摇菌，提质粒。请问大家对菌落PCR有没有更好的建议。我是用的Takara的 PrimeSTAR(R) HS DNA Polymerase 酶做的。95℃，5min；98℃，10s；68℃，2min；72℃，10min。做的是两步法，98℃，10s；68℃，2min；做了35的循环。阳性是用质粒做的，没啥问题。阴性也没啥问题。就是菌落PCR做不出来。
wanglaoshi ( 20:35:37)
图上扩增出来的可能是空载体通用引物的片段。你这种情况多半是连接体系中载体和目的片段的比例不对造成的，二者适宜的摩尔比应该是1:3~1:10，如果目的片段小，应该尽量增大目的片段的比例。另外一定要将目的片段进行纯化。祝实验顺利！
duoduo ( 20:35:59)
可能是PCR有问题，用普通taq扩长片段效率可能比较低。建议lz挑几个菌落提质粒酶切检测一下。
要查出原因的话，可以做两个阴性对照，包括用少量未转化的感受态直接涂板（检查感受态是否有污染），以及不加目标片段的t载体连接产物转化涂板（检测t载体质量）。如果两个阴性对照都没有问题，那么你的菌落大约都是带你到目的基因的。
yonger ( 20:36:14)
应该没有连接上
avi317 ( 20:36:32)
1.连接时可以试一下少加一点pcr胶回收的产物
2.换别的pcr酶或者换T载体
wood533 ( 20:36:49)
肯定没连上&&不然PCR不可能一点产物没有&&
wood533 ( 20:37:07)
没做个蓝白斑筛选？& & 另外目的片段很长&&解链时间长一点& &但别温度太高 TAQ酶会丧失活性& && &试试这个PCR&&95°&&5分钟& & 94°&&30秒&&55度& &20秒& &72°&&3分钟& & 35个循环& &72度&&5分钟& &&&我前天刚做的和你一样的引物&&不过我只有300多个bp& &很成功。。。~
memory ( 20:37:26)
什么都不指明，Marker多大，你P出来的是什么带？然后你那个引物 是不是包括你的insert?
T载体很好做的啊~~~
viviwang1987 ( 20:37:52)
我也遇到这种情况，换了一套试剂，提高变性温度，破菌后做模板都做过，但还是没有结果，乖乖提质粒，结果都有，很痛苦啊。
chuntian1983 ( 20:38:07)
从你的电泳结果基本可以断定都是空载。你要先确定克隆进去的片段是用Taq酶扩增的，点检测没问题；连接时间30-60min，温度16度；转化后摇菌1h，涂板涂200ul，（或者摇30min，4800转离心后涂一半）；用蓝白斑筛选，挑白斑做菌落PCR。
xyw5 ( 20:38:34)
推荐一种同源重组连接的盒子，完全可以替代然和双酶切连接
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