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水溶性量子点荧光探针用于胃癌细胞相关抗原CA242的检测
作者：付志英
【关键词】& 量子点,胃癌细胞,抗原,光稳定性
　　摘要& 基于量子点荧光探针对胃癌细胞相关抗原CA242进行了检测。首先在水溶液中直接合成性能优良的量子点荧光纳米颗粒，并在其表面成功修饰了羊抗小鼠IgG和聚乙二醇，制得功能化的水溶性量子点荧光探针，并利用探针对胃癌细胞相关抗原CA242进行检测，进一步与传统的基于荧光染料标记的免疫荧光分析方法进行了比较。实验结果表明：该功能化的探针能够有效地识别胃癌细胞相关抗原CA242，并且在光稳定性和灵敏度方面都较传统的基于荧光染料标记的免疫荧光分析方法有明显的改善，从而为CA242的相关检测以及胃癌的诊断与愈后判断提供了新的方法。
　　关键词& 量子点，胃癌细胞，抗原，光稳定性
　　1& 引言
　　CA242是一种肿瘤相关抗原，人体正常组织中含量极低甚至没有，当发生恶性癌变时，其表达明显上调[1，2]。该抗原在胃癌细胞和胃癌患者血清中均有表达，且与淋巴结转移具有一定的相关性，可作为判断胃癌播散潜力的生物学指标[3，4]，对胃癌的诊断与治疗具有重要的指导意义。肿瘤相关抗原CA242的检测方法已有报道，如传统免疫荧光分析[5]、放射性标记[6]等。然而，在传统的免疫荧光分析技术中，有机荧光染料抗光漂白性能较差，且用于检测时灵敏度不高；放射性标记具有较高的灵敏度，但存在放射性同位素污染和防护等问题。因此，探索和发展特异性的非同位素标记方法用于CA242的相关检测，一直是科研人员十分关注的课题。量子点（quantum dots, QDs）是近年发展起来的一种新型荧光探针，与传统的有机荧光染料相比，具有极其优良的光谱性能[7,8]。其激发光谱较宽，不同的量子点可以由同一波长的光激发，而不同的有机荧光染料分子，则常常要用不同波长的光来分别激发。量子点不易漂白，发射光谱与粒径大小有关，通过调整其粒径大小，可以发出不同颜色的荧光，从而使不同生物分子的标记、区分、识别变得更加容易，在生物化学、细胞生物学、分子生物学等研究领域显示了极其广阔的应用前景[9~11]。针对CA242传统检测方法中所存在的抗光漂白性能差、放射性污染等问题，本研究基于量子点荧光探针对胃癌细胞相关抗原CA242进行了检测。首先制备出性能优异的量子点荧光纳米颗粒，并进一步在其表面修饰了羊抗小鼠IgG和聚乙二醇（PEG），其中PEG是一种生物相溶性分子，能够有效的降低颗粒的非特异性吸附现象[12]。基于该功能化的量子点荧光探针，成功地对胃癌细胞相关抗原CA242进行了检测。该方法特异性好，光稳定性强。
　　2& 实验部分
　　2.1& 仪器与试剂F2500荧光分光光度计(日本Hitachi公司)；FV500IX70激光共聚焦荧光显微镜(日本Olympus公司)；22R台式冷冻多功能离心机、DU800紫外/可见分光光度计(美国 Backman公司)；3111CO2水套培养箱(美国 Forma公司)。Cd(ClO4)2?6H2 O(99%，Acros公司)；Al2Te3(99.5%，Cerac公司）；Thioglycolic acid(TGA，98%)和聚乙二醇（PEG）均购自Sigma公司；1乙基3(3二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDAC,分析纯)和N羟基琥珀酰亚氨(NHS，分析纯)均为上海伯奥生物技术有限公司产品；葡聚糖凝胶G25中颗粒购自Pharmacia公司；小鼠抗人单克隆抗体(mouse antiCA242)和羊抗小鼠IgG为北京中杉金桥生物技术有限公司产品；FITC标记的羊抗小鼠IgG购自北京鼎国生物技术有限公司；MGC细胞(胃癌细胞)购自中南大学湘雅医学院细胞中心；其它所用试剂均为国产分析纯。
　　2.2& 实验方法
　　2.2.1& 水溶性量子点的制备[13,14]及其性能表征& 将含有以TGA为稳定剂的Cd(ClO4)2?6H2 O溶液的pH值用1mol/L的NaOH调至11.2～11.5，用高纯氮气将该溶液脱氧保护，并在适当的搅拌速度下向上述溶液中通入新鲜制备的H2Te气体(由Al2Te3与0.5 mol/L 的H2SO4 溶液反应产生)。将此反应液加热回流，于不同时间取样以获得不同发射波长的水溶性CdTe量子点。用F2500荧光分光光度计对CdTe量子点进行荧光发射光谱测定，PMT电压设置为700V，激发光波长为370 nm，激发和发射狭缝宽度均为5.0 nm。同时，采用DU800紫外/可见分光光度计测定量子点的吸收光谱。&&& 　　2.2.2& 表面功能化的量子点荧光探针用于检测CA242& (1)& 量子点的表面功能化修饰& (A)量子点的纯化：在上述制备的量子点粗品溶液中，过量的巯基乙酸以游离形式存在，对后续的表面功能化修饰会产生一定的影响。为了更好地与羊抗小鼠IgG和PEG进行连接, 采用凝胶过滤层析法对量子点粗品溶液进行了纯化。实验中采用葡聚糖凝胶G25中颗粒作为填料，以超纯水为洗脱液，用来去除游离的巯基乙酸。(B)表面功能化修饰：采用EDAC连接法[15]在量子点表面修饰抗体，具体实验方法如图1所示。量子点表面的羧基首先被EDAC活化，接着与NHS反应生成活泼酯；活泼酯易与含伯胺的分子反应，从而将羊抗小鼠IgG和氨基化PEG修饰到量子点表面。将纯化后的量子点溶液与EDAC和NHS混合(1∶100∶150，摩尔比)，以超纯水为反应介质，室温活化15 min 以2000 r／min离心3次，然后加入摩尔比为1∶1的羊抗小鼠IgG和氨基化PEG，在25℃摇床中反应2 h后，加入L甘氨酸继续反应30 min，最后在以5000 r／min下离心3次并溶于PBS溶液中(pH=7.4)，从而制得了表面修饰有羊抗小鼠IgG和PEG的功能化量子点荧光纳米颗粒。(2)功能化量子点荧光探针对CA242的检测& 将胃癌细胞(MGC)进行消化，分别滴加到铺有玻片的培养皿中，在恒温培养箱中培育(5%CO2，37℃)，使其贴壁生长于玻片上。当爬片密度达到50%～80%时，用PBS洗两遍，用4%的多聚甲醛固定液室温固定20 min，再用PBS洗3遍，接着加入含3%BSA的PBS溶液进行封闭，在培养箱中反应20 min后，用0.05% Tween20洗脱3次。实验组加入小鼠抗人单克隆抗体，阴性对照组加入PBS，在培养箱中孵育40 min，接着用0.05% Tween20洗涤3×5 min，之后分别加入修饰了羊抗小鼠IgG和PEG的表面功能化量子点荧光探针，于培养箱中继续孵育30 min，再用0.05% Tween20洗3×5 min，封片后在激光共聚焦荧光显微镜下观察成像(激发波长为488 nm，荧光信号的检测通道为505nm的长通滤光片)。同时，采用FITC标记的羊抗小鼠IgG对CA242进行了识别,实验方法同上。(3)& 功能化量子点荧光探针的抗光漂白性能分析& 基于该表面功能化的量子点荧光探针及FITC标记的羊抗小鼠IgG分别对MGC细胞进行识别，继而采用激光共聚焦荧光显微镜对其抗光漂白性能进行考察。实验以488 nm的激发光连续扫描12 min，每隔2 min自动进行荧光成像，采用软件Fluoview (激光共聚焦荧光显微镜配备)计算相应的荧光强度值并进行作图比较。
　　图1& 量子点的表面功能化修饰（略）
　　Fig.1& Fictionalization of quantum dots (QDs)
　　3& 结果与讨论
　　3.1& 量子点的光谱性能表征用荧光分光光度计对量子点粗品溶液进行荧光发射光谱检测，并用DU800型紫外/可见分光光度计测定其吸收光谱。图2为其中一个样品的发射和吸收光谱，从中可以看出，该颗粒吸收光谱范围比较宽，具有明显的第一吸收峰；其最大发射波长为530 nm，且峰形窄而对称，半峰宽仅为38 nm，表明该量子点具有非常优良的光谱性能,从而为进一步的功能化修饰及CA242的检测奠定了基础。　　　　图2& 量子点的荧光发射光谱(1)和吸收光谱(2)，荧光最大发射波长为530 nm (实验均选用该种量子点)
　　Fig.2& Fluorescence (1) and absorption (2) spectra of QDs. The maximum emission wavelength was 530 nm（略）
　　3.2& 功能化量子点荧光探针对胃癌细胞相关抗原CA242的检测结合传统的免疫标记技术，基于修饰有羊抗小鼠IgG和PEG的量子点荧光探针，对胃癌细胞相关抗原CA242进行了检测,检测的方法原理如图3所示。首先将胃癌细胞与小鼠抗人单克隆抗体(一抗)共培育，一抗特异性地与胃癌细胞上的抗原CA242相结合，接着洗去未结合的一抗，再与羊抗小鼠IgG和PEG功能化的量子点荧光纳米颗粒进行培育，经过洗涤后进行荧光成像检测。
　　图3& 基于表面功能化量子点荧光探针对CA242进行检测的原理图（略）
　　Fig.3& Schematic illustration of CA242 detection using functionalized QDs
　　: 小鼠抗人单克隆抗体(mouse antiCA242); ： 修饰了羊抗小鼠IgG和PEG的表面功能化量子点荧光结纳米颗粒（QDs function lized by goat antimouse IgG and PEG）。
　　基于上述实验原理，所得结果如图4所示。其中，A图为表面功能化量子点荧光探针对CA242的检测结果，B图是相对应的未加一抗的阴性对照实验。由图中可以看出，A图具有较强的荧光表达，B图几乎没有荧光，从而证明了该表面功能化量子点荧光探针能够成功的对CA242进行特异性的识别。
　　图4& 激光共聚焦荧光显微镜下表面功能化量子点和FITC标记的羊抗小鼠IgG两种荧光探针识别胃癌细胞的荧光成像图 （略）
　　Fig.4& Confocal fluorescence images of gastric cancer cell (MGC) labeled with functionalized QDs and fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated sheep antimouse antibody, respectively
　　A. 表面功能化的量子点荧光探针对胃癌细胞的识别(MGC cells were recognized by functionalized QDs)； B. 阴性对照实验(未加一抗)(negative control, in which MGC cells were incubated with functionalized QDs in the absence of primary antibody)；C. FITC标记的羊抗小鼠IgG对胃癌细胞的识别(MGC cells were recognized by FITC conjugated sheep antimouse antibody)。
　　将本方法与传统的免疫荧光分析方法进行了比较，利用FITC标记的羊抗小鼠IgG对CA242进行了检测(图４C)。从图中可以发现，在同等实验条件下，量子点的荧光信号(图４A)明显强于FITC(图４C)，有望实现对肿瘤相关抗原CA242的高灵敏检测，从而为胃癌的早期诊断提供一种新的方法。
　　3.3& 功能化量子点荧光探针的抗光漂白性能分析传统免疫荧光分析方法一般采用荧光染料作为荧光信号发生基团，存在着抗光漂白性能差的缺陷，给样品的检测和保存造成不便；而量子点作为一种新型的荧光探针，具有非常优异的抗光漂白性能。
　　图5& 表面功能化的量子点荧光探针和FITC标记的羊抗小鼠IgG分别标记胃癌细胞后的光稳定性比较（略）
　　Fig.5& Photostability comparison between functionalized QDs and FITC conjugated sheep antimouse antibody labeled MGC cells
　　ａ和ｂ分别为表面功能化的量子点和FITC标记的羊抗小鼠IgG对胃癌细胞进行识别后，激发光连续扫描0、2、4、6、8、10和12 min所得到的荧光图像(Fig.5a is the fluorescence of quantum dots and Fig.5b is that of FITC，the images from left shown were obtained at 0, 2, 4, 6, 8, 10 and 12 min)。
　　为了进一步证明量子点荧光探针在该方面的优越性，本实验比较了表面功能化的量子点荧光探针和FITC标记的羊抗小鼠IgG对胃癌细胞识别后的光稳定性情况。&
　　图6& 两种荧光探针识别胃癌细胞后光稳定性比较
　　Fig.6& Photostability of QDs and FITC conjugated to MGC cells
　　实验采用488 nm的激发光连续照射12 min，每隔2 min自动进行荧光成像(图5)，并用激光共聚焦荧光显微镜软件计算出相应的荧光强度值，然后进行作图比较(图6)。由实验结果可知，连续照射12 min后，量子点荧光探针识别的细胞依然具有较强的荧光信号(图5ａ)，其荧光强度只下降了9.54%(图6)；而基于FITC标记的抗体进行识别时，12 min以后仅能观察到非常微弱的荧光(图5ｂ)，荧光值的下降幅度高达83.05%(图6)。研究结果表明，２种荧光探针存在着明显的光稳定性差异，功能化量子点具有较强的抗光漂白性能，有效地克服了传统有机荧光染料光稳定性差的缺陷。
　　References
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　　１２& Zheng M, Huang X Y. J. Am. Chem. Soc., :
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　　１５& Jiang Zhonghua (蒋中华), Zhang Jianhui (张建辉) . Immobilization Technoogy of biomolecules and Its Application(生物分子固定化技术及应用). Beijing(北京): Chemical Industry Press(化学工业出版社),
　　本文系国家自然科学基金重点项目（No.）、国家重点基础研究发展规划（No.）、国家科技攻关计划项目（No.）、科技部国际合作重点项目（No.）及国家自然科学基金项目（No.）资助
　　(湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实验室，湖南大学化学化工学院，湖南大学生物医学工程中心，湖南大学生命科学与技术研究院，湖南省生物纳米工程技术研究中心，长沙& 410082)
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由于没研究过这透镜不知道3456哪2根是进线 哪2根是出线
所以不知道了
引用 嘉兴红娜185
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这种瑞纳装不上，大灯内空间不够
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可以装上的！有瑞纳装上了，只是帖子不详细
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19:34:42 发表于 7楼 的内容：
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由于没研究过这透镜不知道3456哪2根是进线 哪2根是出线
所以不知道了看不懂，能存能详细一点
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19:36:45 发表于 8楼 的内容：
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21:25:59 发表在 这种瑞纳装不上，大灯内空间不够空间够，有成功的
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19:38:08 发表于 9楼 的内容：
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大神指点，上车成功，再感谢
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本楼已被管理员删除
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06:13:52 发表于 13楼 的内容：
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14:43:02 发表于 14楼 的内容：
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怎么解决的
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20:25:40 发表于 15楼 的内容：
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给个发吧，我有一套法雷奥安定和疝气灯就是不会接线
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20:27:53 发表于 16楼 的内容：
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你最后一张图。都说了 接法。
引用 我爱西西-27 21:57:39 发表于 17楼 的内容：
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这种瑞纳装不上，大灯内空间不够
空间可以，足够了
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11:39:43 发表于 18楼 的内容：
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20:27:53 发表在
给个发吧，我有一套法雷奥安定和疝气灯就是不会接线
其实不要考虑这个问题，那个变光板就有这个功能，把正负电流进行变换其次，哪怕接错了也没有关系的，不会烧东西
引用 辣年秋天
11:41:38 发表于 19楼 的内容：
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完成汽车之家·知道升级任务，解答问答，并被提问者采纳为满意回答，可得解答达人一级勋章
11:41:38 发表在
其实不要考虑这个问题，那个变光板就有这个功能，把正负电流进行变换其次，哪怕接错了也没有关系的，不会烧东西受教
引用 飞歌社员
21:10:46 发表于 20楼 的内容：
禁止发布色情、反动及广告内容！
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