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我使用的一起是ABI7300，本来要用的方法是相对定量法，结果当时买的时候只装了绝对定量的软件，打电话叫销售人员再让安装相对定量，但是还要购买相对定量软件而且超贵，所以就没法子安装，但是我的实验设计就是相对定量的，而且起始的量无法做到绝对定量要求的那么精确。我的问题来了。
能不能用绝对定量的软件分析相对定量的，要如何分析？有人说应该可以用绝对定量的软件分析我的那个数据，然后得出的结果再经过怎么怎么转换就行了。但是他也不知道具体怎么做，请问在座的高手能不能帮帮忙，教教我。我现在心急如焚啊，再不出数据就毕不了业了。。。。我在这谢谢各位了。
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顶上去，希望高手不吝赐教。
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我也想知道觉得定量和相对定量的差别和具体方法
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生物秀举人
相对定量和绝对定量的区别、、？？？
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绝对定量是要知道个数，比如10个。相对定量是两个数A是B的多少倍，不需要知道确切的个数。
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可以的。你把内参和目的基因都设成Unknown，然后输出数据，得到内参和目的基因的CT值。按照公式2-△△ct计算fold change就可以了。就是有点麻烦，得自己算。我也是用ABI7300绝对定量软件做的相对。
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zhubibohzau 发表于
可以的。你把内参和目的基因都设成Unknown，然后输出数据，得到内参和目的基因的CT值。按照公式2-△△ct计算 ...
在选择公式时 是否应该参考扩增效率？
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请问楼主问题解决了吗？我们的7300机子也没有相对定量模块，我也想知道用绝对定量模块做相对的一些操作上的细节，请不吝赐教
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【求助】关于SYBR相对荧光定量的一些疑问
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这个帖子发布于6年零181天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
请教大家：用相对荧光时，我采用双标准曲线法测基因表达，我内参标曲扩增效率97%，目的基因标曲扩增效率90%，这样可以直接测样品了吗？体系还需要再优化吗？R2是没问题的。
大家跑完qPCR出结果后那条阈值的线都移动吗？是不是系统定下来的，我们就参照那条就行，因为这条线直接关系到Ct值的大小，所以我问问，我平常都不敢动的。
最后就是有关融解曲线的，我知道做标曲最好是要做一下，那么做样品的时候，如果依据前面的样品结果，发现都只有一条特异峰的条件下，能不能后面的测定都不做融解曲线了？这样会比较节省时间，到时发文章的时候，会因为没有融解曲线图的数据而卡我们吗？
万分感谢！
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理论上那条线（CT）应该是梯度稀释样品来决定在哪儿，但是简单的做法是放在第一个拐点处，不是你看到的默认线。溶解曲线是不会放在论文里面的，但是，有时候机器的96孔反应条件不一样。有时候种种原因会照成某些样品孔的异常，你不做变性曲线，你根本不知道那发生了什么realtime唯一检测质量的就是溶解曲线，你还要跳过吗？这不是卡不卡的问题，是你没有正确的态度对待实验。直说，I feel you repugnant
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我每次跑都固定放在几个样品孔里的，然后先前放这些孔里的组织是没有问题的，我就想问问后面的组织还会不会有问题，不是不想测啊，我现在在跑的还都有测的，主要是我们全校就1台机器，太多人用，多这一步要多花一倍的时间，才问问，都上升到实验态度上来了。- -
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大家做相对定量都是用双标曲法还是双CT法呀？双标曲法，内标和目的基因扩增效率需要一致吗？谢谢~~
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顶起~~求助啊！！
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有没人帮忙一下，有人以前用双标准曲线法做的吗？能教我一下怎么分析数据吗？
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关于丁香园荧光定量PCR问题疑难解答（一）；Q：1.这两天我做标准曲线，线性关系还行，R平方；A：曲线不光滑有时跟染料的量相关，可以加大看看，；1.PCR反应效率差：引物，试剂PCR条件的原因；做realtime-pcr优化体系很重要，你的扩；模板提取方法需要改进；3.样品稀释不准确：；正常情况10倍比稀释时，前后是相差3.32个循环；Q：荧光定量PCR的灵敏度；A：
荧光定量PCR问题疑难解答（一）
Q：1. 这两天我做标准曲线，线性关系还行，R平方0.998。但是扩增效率只有80%，另外扩增曲线也不是太光滑。2.我用SYBR作为荧光染料，样品的荧光强度也挺低的，只有100-200左右。
A：曲线不光滑有时跟染料的量相关，可以加大看看，或者就是扩增产物太少了。
1. PCR反应效率差：引物，试剂PCR条件的原因。
做realtime-pcr优化体系很重要，你的扩增效率低。可以增加Mg离子的浓度，如果其他条件都好了，还不行，那就是引物的原因，那你就只能重新设计引物了。
2. PCR中混入影响反应的物质：
模板提取方法需要改进
3. 样品稀释不准确：
正常情况10倍比稀释时，前后是相差3.32个循环。
这很重要，做标准曲线很多不好的时候，很多都是倍比稀释的问题，
Q：荧光定量PCR的灵敏度
A：对于染料法的荧光定量来说，Ct值在13~30之间比较准确，30~33之间需要再次确认，在以上范围内的置信度比较差。
Q：标准曲线要重复两三次吗?
A：没有人说做定量PCR标准曲线要重复两三次，只是用来做标准曲线的梯度点最好不要少于4个，否则标准曲线准确性不高。
Q：关于荧光定量标准曲线的制作
A：一般的仪器虽然声称能进行单拷贝检测，但如果不是特别设计的体系，很难做到100拷贝以下的准确定量，一般用来做标准曲线的最小浓度为1000拷贝，再往下可靠性就降低了，这不是稀释或其他什么问题，而是本身你选作标准曲线的浓度以及定量浓度最好不要低于1000拷贝，如果再低一点，100拷贝也勉强可以接受，否则即使你做出来，认可度也不会太高。
Q：溶解曲线高矮
A：Tm值相同，而峰高低有差异是表达丰度不同，同样的扩增产物也会出现Tm值有微小差异，一般差异在1度以内都可以接受。融解曲线的纵坐标表示荧光信号对温度的一阶负导数。
Q：定量PCR没有扩增
A：把定量PCR的产物跑个电泳，看看有无产物，如果电泳有条带，说明PCR是成功的，只是荧光信号没有读取到，这时要调整染料或探针的浓度（看你是染料法还是探针法）；如果电泳没有条带，那么还要在定量PCR仪上优化实验条件。虽然你在普通PCR仪上优化过条件，但换了定量PCR仪，由于两台仪器的升降温速度及温度精密度等指标存在差异，同样的条件做不出PCR也是可能的。
由于很多因素的影响，扩增子的溶解温度会有一定变异。溶解温度会受特殊缓冲液的pH值，所用Taq聚合酶，SG和MgCl2浓度和其他因素的影响。要做溶解曲线的对比你首先要确保所用的条件相同。
Q：SG的稳定性如何？
1周到3个月，这取
A：只要不进行稀释，SG是非常稳定的。一旦稀释，可以保存
决于冻融次数，推荐配置成一定浓度的贮存液，用时现用现配稀释液。
为优化SG反应，有必要在所有的常规步骤来确定，优化扩增反应的条件（合适的MgCl2、dNTP和Taq酶浓度等）。结果应该在凝胶电泳上有唯一的条带。
SG分析的优化主要包括以下4个因素：
a) SG 浓度
b) 引物浓度
c) MgCl2浓度
d) 温度和反应次数
推荐的SG终浓度变动范围是1：0000。经常用到的浓度范围是1：1000。引物浓度的优化应该测试不同浓度的正向和反向引物。引物浓度的范围应该是50nM到300nM，然而，也有例外的情况。
Q：荧光定量污染解决办法
A：几个月前我也有跟你一样的遭遇，当时跳楼的心都有。后来美国来人给培训，按照他们的要求，污染果真就给控制了，两个月来一直还很好。以下的经验希望对你有用。
1. 配反应体系和加模板要在不同的屋子进行；
2. 配体系的屋子准备一件干净的白大衣，每次进去都要记得换白大衣，至少要把别的屋子穿的白大衣脱掉；
3. 分装好体系以后把反应板/条放在一个有盖的干净的托盘中端到加样的房间；
4. 配体系戴的手套可以带到加样的房间，反过来不可；
5. PCR完毕后，反应产物拿到别的屋子扔掉；
6. 最重要的就是不要把DNA带到配体系的屋子，以上几点也都是为了这一目的。
Q：荧光定量real-timePCR重复性问题
1ul，而是稀释10倍左右然后加10ul，这样有助于改善重
A：建议不要只加
如果你测的是拷贝数，重复性不好是很难避免的。我感觉用SYBR green作realtime的误差还是比较大的，它的优势在于灵敏度高，但如果想精确定量，还是比较困难的，只好重复很多次，或者多花钱买标记的引物，那个特异性最好。
Q：各位高手，今天第一次做完8个基因的相对荧光定量（ddct法），扩增时忘了做融解曲线了，现在是不是没法再做融解曲线了？（ABI7500）对于每个基因都作了NTC对照，结果显示NTC无扩增，这样能否说明引物设计得还可以，没有引物二聚体的产生？至于是否有非特异性产物，就必须得做融解曲线了？请帮忙指教一下啊
A：把你的定量PCR产物重新作融解曲线，只是新建立一个反应，反应条件按照融解曲线的条件设定就可以了，没必要重新作定量。Ct值25-29，融解曲线单峰；ntc无CT值，融解曲线无峰，就不用电泳了，可以肯定。模板量增加10倍，Ct值减小3.32Cycles。
Q：荧光阈值高，怎么改进？
A：阈值取决于基线，基线是3~13cycles左右的荧光信号值标准偏差10倍，可能是背景高，把模板纯化一下看看。要调整一下你的基线的起止循环数。一般开始的循环为2或3，中止循环为一次试验最早起峰的Ct-3，即如果一条曲线在第13个循环就已经起峰了，那么基线的中止循环可以设置为13-3=10。如果你的体系不存在问题，就可能是你的那次试验模板浓度较高，起峰早，导致的阈值线过高。
Q：荧光定量PCR检测灵敏度和线性范围的关系
A：一般大家认为的检测灵敏度即检测下限，可以理解为能检测到和准确定量的最低浓度(拷贝数)，而线性范围为能够检测的区间，即可以检测及分辨的最低浓度到最高浓度的数量级。但两者都与荧光定量PCR仪器及试剂体系相关。
Q：real time PCR CT值一般在多少后认为模板没扩增？
A：当进入对数期的循环数大于35个时，RealTime RT-PCR检测无效，基因没有表达；当进入对数的循环数在32-35个循环时，需要有至少3个重复才能判断是否能检测到基因的表达。
Q：正常情况NTC是不应该出现CT值的吗？
A：如果是探针法，应该没有Ct值，所谓的没有，也是针对不同算法而言的。NTC一般没有明显的指数扩增，所以一般软件不计算Ct。
如果是染料法，可能在30个循环后有微弱起峰，并且软件计算出Ct值，这时还要观察溶解曲线，看扩增产物是否是引物二聚体。大多情况是二聚体，这时也可以优化条件，比如提高退火温度等。
如果是探针法，阴性对照起峰肯定是污染，如果是染料法，还要看溶解曲线：如果溶解曲线的Tm值在80度以下，那么很可能是引物二聚体；如果溶解曲线是双峰或更多峰，其中有与加模板后的扩增产物的Tm值相同的峰，那么就意味着存在污染。
Q：无结果，而用产物跑电泳条带很清楚，什么问题？
A：我也出现过此情况，后来发现是因为加样的时间太长了，荧光染料暴露时间太长了，荧光基团淬灭了，出现上述问题还有一种情况，那就是荧光PCR仪的荧光采取信号值太低，有时也不稳定。 如果你使用探针法，有荧光信号而没有求出Ct值，那么可能你的探针浓度有问题，可能太高或者太低了，可能改变探针浓度看看。
Q：最佳荧光采集温度
A：采集荧光的时机不是决定于温度，而是决定于采用的方法。
如果采用染料法，一般要在延伸阶段的末点进行检测，而72度延伸的效率最高，所以采用染料法时大多在72度检测。如果扩增产物中存在引物二聚体，也有采用更高的读板温度，比如76度、80度等，这时的读板温度与引物二聚体的Tm值相关。
如果采用TaqMan探针法，由于TaqMan探针是累积荧光，理论上说在任何步骤检测都可以，但目前TaqMan大多采用两步法，所以在退火的末点进行检测即可。
如果采用分子信标的方法，就要在退火的末点进行检测。
FRET探针法，要在退火时进行荧光检测。
Q：标准曲线的讨论
A：有一点可以告诉你：样品浓度太高，beta-actin都是很高的，要漂亮就稀释1000倍后再做。浓度高，很容易导致污染。而且第一二个梯度没有分开啊。标准曲线的落点局限在15个循环以前，那样你得到的反应有效线性范围太窄，就是说要很高浓度的样品才适用你这标准曲线。
Q：定量PCR中，质粒作为标准分子为何要线性化
A：因为你要检测的目的基因如果不出意外的话，应该是线性的吧，而你用来定标准曲线的目的基因确是连接在环状的质粒上的。我想单从变性和复性的难易上就会有很大的区别，当然会对引物的结合等各方面造成影响，何况环状的空间构象和线性的空间构象上的差异了。
做标准曲线时的基本原则之一就是要尽量的模仿需要定量的基因所在的自然条件，所以说，如果做标准曲线时你可以有条件做到用和你要检测的基因一样的标准品做标准曲线的话，就不要选择把一段基因克隆到质粒上。但是一般情况下是很难做到的。楼上说的没有酶切效果
还行，那只是还行。荧光定量本来就是很容易受到很多因素影响的实验，当然是要求严点好了，当然如果你检测的基因本身就是环状的，那当然不用线性化了，那样反而不好了！
线性化比较麻烦：首先要酶切，保证完全酶切，才能全部线性化。然后要回收，质粒酶切后再回收容易被破坏，而且回收率也不是很高。第三，线性化的质粒不容易保存，相对于环状质粒来说。所以，如果有实验证据证明不线性化的质粒可以用，那就可以省去很多事情了。
Fig. 6 also shows the efficiency of the PCR reaction is not altered by using circular
plasmid DNA in place of linearised plasmid DNA.线形化与环状质粒比较文章
评论：这篇文章用这个质粒对线性化和非线性化做了比较，从实验结果看线性化并没有对标准曲线产生任何改变。但是这篇文章只是摆出了试验结果，并没有从原理上分析这个实验结果的原因，因此线性化对于标准曲线的作用并不能以这篇文章的结果来外推。就是说可能需要更多的实验结果，或者从原理上分析了这篇文章的结果，才能得出结论来说明，线性化确实对于所有,或大部分的质粒标准分子是不必要的。
荧光定量PCR问题疑难解答（二）
Q：realtime pcr不同基因之间的阈值(threshold)是不是要一样啊?
A：如果做标准曲线或者相对定量，建议阈值还是一样比较好。而且阈值一般要放置于扩增曲线的指数段，即荧光数据对数坐标轴下的线性段。如果扩增曲线的效率接近，阈值线的位置对于定量结果的影响是微乎其微的。
Q：扩增曲线本底不断升高是什么原因?
A：我近期也遇到过这种现象，现在基本解决了，原因可能如下：
1、试剂质量差是主要原因，我用ABI的SYBR试剂做了一年从来没有遇到过类似问题，而近期换成东洋纺的试剂就出现了这个问题，所以最好不要贪便宜用小鬼子的试剂！
2、模板不纯是一个重要原因，我用东洋纺的试剂出现问题后，用ddH2O稀释10倍以上（一定不要用TE稀释，要不然可能会更差），问题基本解决；
3、如果模板稀释后基线还有一定的上升，结果分析时可以将基线从6以上设，避开初始的几个上升厉害的循环；
建议：要根本解决此问题请用质量可靠的试剂，便宜没好货！
Q：分子信标做的阴性对照，曲线为一条斜线，什么原因？
包含各类专业文献、幼儿教育、小学教育、各类资格考试、高等教育、中学教育、荧光定量PCR问题疑难解答21等内容。　
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标题: 荧光定量PCR加样量问题
摘要: [荧光定量PCR加样量问题] 急求各位高手哥哥姐姐帮忙啊我的cdna样品浓度都是用900ng 的RNA反转录做成的20ul的溶液，那么请问我在加入cdna样品时应该加入多少体积的量？我看到SYBR Premix ex taq(perfecct real time)编号drr041a的试剂盒里面说20ul的荧光定量体系cdna模 关键词:[浓度 稀释 反转录 荧光定量 体系 引物 体积]……
急求各位高手哥哥姐姐帮忙啊
我的cdna样品浓度都是用900ng 的RNA反转录做成的20ul的溶液，那么请问我在加入cdna样品时应该加入多少体积的量？我看到SYBR Premix ex taq(perfecct real time)编号drr041a的试剂盒里面说20ul的荧光定量体系cdna模板加入2ul，但是没有注明浓度是多少，只是说dna模板添加量在100ng以下，而且说反转录反应液作为dna模板时添加量不要超过pcr反应总体积的10%，我用的荧光定量pcr反应总体积是20ul，那么cdna的体积应该不大于2ul了，但是浓度应该多少为好呢？
还有引物浓度我该用多少为好呢，试剂盒上20ul的荧光定量体系是10uM的加入0.4ul。
我的实际浓度和体积可能跟试剂盒上的不一样，但是我该怎么按照自己的900ng 的RNA反转录做成的20ul的溶液来改动试剂盒上的数据呢？
如果做浓度梯度来确定cdna浓度和引物浓度，该怎么浓度梯度为好呢？
谢谢各位高手，小弟不胜感激！回复还真绕啊，可惜我不是高手。惭愧回复
还真绕啊，可惜我不是高手。惭愧 不好意思，可能是我表述不清楚，请问你也做荧光定量吗回复
不好意思，可能是我表述不清楚，请问你也做荧光定量吗 我没做过，也很想知道回复看的云里雾里的，我们做RTPCR时都是将CDNA稀释10倍后，每孔加5ul，引物也是稀释稀释10倍。上下游一块加5ul，MIX10ul回复
看的云里雾里的，我们做RTPCR时都是将CDNA稀释10倍后，每孔加5ul，引物也是稀释稀释10倍。上下游一块加5ul，MIX10ul 那请问你的CDNA浓度是多少，引物浓度时多少，谢谢。我是用900ng的RNA来反转录做成20ul体系，然后不稀释直接取2ul来荧光定量PCR（20ul体系），即我用于荧光定量PCR的cdna模板含量是90ng。
我还需要将cdna模板稀释10倍再用于荧光定量PCR吗，那样的话我的cdna模板含量就是9ng了
请高手指点 谢谢回复去测一下CDNA浓度，或者不测，直接对一个浓度梯度的RT-PCR，控制内参和目的基因的CT值大概在18到30之间就好啦回复
去测一下CDNA浓度，或者不测，直接对一个浓度梯度的RT-PCR，控制内参和目的基因的CT值大概在18到30之间就好啦 我是不测CDNA浓度的，都是测RNA浓度，然后都用900ngRNA来进行反转录（20ul体系）从而使所有的cdna浓度都尽量一样。
您说的直接对一个浓度梯度的RT-PCR，这个浓度梯度是多少呢，是我这里的900ngRNA来进行反转录（20ul体系）吗，如果不是又怎样做呢，谢谢回复
那请问你的CDNA浓度是多少，引物浓度时多少，谢谢。我是用900ng的RNA来反转录做成20ul体系，然后不稀释直接取2ul来荧光定量PCR（20ul体系），即我用于荧光定量PCR的cdna模板含量是90ng。
我还需要将cdna模板稀 ... CDNA我从来不测，RT所需CDNA量极少，你只需保证各组内参起峰在15循环就好。引物的浓度我忘了，嘿嘿，不好意思回复我用的是5ug的RNA转录的CDNA，然后再把CDNA稀释成6.25ug的量，PCR反应用的14ul体系，7ul的sybr，3ul的引物（3pmol (F+R)）,4ul 的cdna。
做这个实验，你也可以直接将转录的CDNA统一稀释100倍或者几十倍的那种。加cdna的量最好至少在3ul以上，这样减少加样误差的。回复
CDNA我从来不测，RT所需CDNA量极少，你只需保证各组内参起峰在15循环就好。引物的浓度我忘了，嘿嘿，不好意思 我的引物浓度10uM,我是用900ng的rna来制成20ul反转录体系，然后取2ulcdna原液来荧光定量PCR,即我的荧光定量pcr里用的rna是90ng，这样的量足够吧，cdna原液不用再稀释5倍，10倍或100倍然后取其稀释液2ul来荧光定量pcr吧，不知稀释好还是不稀释好，谢谢，请回复回复
我用的是5ug的RNA转录的CDNA，然后再把CDNA稀释成6.25ug的量
PCR反应用的14ul体系，7ul的sybr，3ul的引物（3pmol (F+R)）,4ul 的cdna。
做这个实验，你也可以直接将转录的CDNA统一稀释100倍或者几十倍的那种。加 ... 首先，我的cdna反转录试剂盒上说用于反转录的rna最大不得超过1ug，所以我用了900ngrna来进行反转录得到20ul体系，其次您把CDNA稀释成6.25ug的量
那您是测过cdna的浓度了是吧，那么稀释成6.25ug的量换算一下里面含有的rna是多少啊。第三，我的荧光定量pcr体系是20ul，试剂盒上说sybr 10ul，引物（10uM）各0.4ul，cdna2ul，rox 0.4ul，水 6.8ul。但是它没说cdna的量，只是说不超过100ng，而且反转录反应液的加入量不能超过real time pcr反应体积（20ul）的十分之一即2ul，这样可怎么办，麻烦您回答下，谢谢回复
我的引物浓度10uM,我是用900ng的rna来制成20ul反转录体系，然后取2ulcdna原液来荧光定量PCR,即我的荧光定量pcr里用的rna是90ng，这样的量足够吧，cdna原液不用再稀释5倍，10倍或100倍然后取其稀释液2ul来荧光定 ... CDNA量足够了，确切说是太多了，RT时所需CDNA量极少，不需要那么多。再者，不稀释时加的体积太小，误差大，组内差异大，所以建议你还是稀释。至于引物，你的浓度也是太大，我们用时都是在上面标注加的体积上扩大十倍，作为贮备液，RT时再稀释10倍，至于是多少浓度，你自己算算吧，嘿嘿回复
我是不测CDNA浓度的，都是测RNA浓度，然后都用900ngRNA来进行反转录（20ul体系）从而使所有的cdna浓度都尽量一样。
您说的直接对一个浓度梯度的RT-PCR，这个浓度梯度是多少呢，是我这里的900ngRNA来进行反转录 ... 用900ngRNA来进行反转录（20ul体系）从而使所有的cdna浓度都尽量一样，理论上是这样讲，实际操作有点小问题，你能保证里面所有的mRNA 都反转录成cDNA吗？有些试剂盒的反转录效率比较低，哪一家我就不说啦，我建议20ul体系用500ngRNA就完全可以达到你900ngRNA反转录得到的cDNA的量啦，不信你试试，所以这一步你就有问题啦，而且浓度梯度是多少要做实验摸出来的，不好说，我建议是反转录的cDNA取分别300、500、700ng，作为模板，来做一个预实验看看，然后再做调整。回复
CDNA量足够了，确切说是太多了，RT时所需CDNA量极少，不需要那么多。再者，不稀释时加的体积太小，误差大，组内差异大，所以建议你还是稀释。至于引物，你的浓度也是太大，我们用时都是在上面标注加的体积上扩 ... 恩 谢谢你的指点，我再预实验摸索一下吧回复
用900ngRNA来进行反转录（20ul体系）从而使所有的cdna浓度都尽量一样，理论上是这样讲，实际操作有点小问题，你能保证里面所有的mRNA 都反转录成cDNA吗？有些试剂盒的反转录效率比较低，哪一家我就不说啦 ... 对于cdna浓度不可能完全一样的问题，我们在荧光定量时用内参基因来校正啊。
我觉得自己应该将cdna原液分别5倍梯度稀释，然后看看哪个浓度效果最好，再选择这个最佳浓度
谢谢你的指点，我再摸索下最优反应条件回复
对于cdna浓度不可能完全一样的问题，我们在荧光定量时用内参基因来校正啊。
我觉得自己应该将cdna原液分别5倍梯度稀释，然后看看哪个浓度效果最好，再选择这个最佳浓度
谢谢你的指点，我再摸索下最优反应条件 对，就是应该这么做，荧光定量有很多要注意的地方，要慢慢来。回复我们实验室一般是用500-1000ngRNA做RT，然后得到20&lcDNA，加入85&l H2O，等于总体积是105&l, 每次做qPCR的时候总体积是25&l: 12.5&l SYBR Green Taq 2x +6.5&l H2O + 0.5&l primer1 10&M +0.5&l primer2 10&M + 5&l cDNA
反正这个条件下我们的qPCR都能做出来，你可以做个参考回复
对，就是应该这么做，荧光定量有很多要注意的地方，要慢慢来。 谢谢你的肯定，我会尝试下，以后有问题再向你请教啊回复
我们实验室一般是用500-1000ngRNA做RT，然后得到20&lcDNA，加入85&l H2O，等于总体积是105&l, 每次做qPCR的时候总体积是25&l: 12.5&l SYBR Green Taq 2x +6.5 ... 谢谢你给的参考，我会尝试下的，有机会再交流啊
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