有了解mcherry荧光蛋白这一荧光标记的吗

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-12-11 03:27 标签： 荧光标记
　　一提到蛋白研究，首先跳入脑海的当然是抗体。的确，很多蛋白实验都离不开抗体。然而，即使抗体公司时不时推出新产品，但许多蛋白还是没有相应的抗体，我们只能望电脑兴叹。而且，也有很多抗体无能为力的情况，比如观察蛋白在细胞内的运输。所幸，各种各样的蛋白标签让我们能够从容应对这些挑战。
蛋白标签大体可分为三大类：遗传标签、in vivo标签和in vitro标签。大家最熟悉的莫过于遗传标签，即c-Myc、FLAG等。我们将目的基因对框克隆到含有标签的载体上，以便下游通过抗体或荧光检测。同时，标签的存在也方便了蛋白纯化。
Sigma-Aldrich和安捷伦（原Stratagene）都提供带有FLAG、c-Myc或CBP（钙调蛋白结合肽段）的载体系统。此外，它们还提供编码“串联亲和标签”的载体，即利用两个肽段序列进行两步法纯化，以产生高纯蛋白。例如，Sigma-Aldrich的TAP系统将FLAG和HA（血凝素）标签与目的蛋白偶联，先通过FLAG抗体柱分离蛋白，再通过HA抗体柱纯化，可获得比一步法更纯的蛋白。这种策略常用于捕获完整的蛋白复合物和评估蛋白之间的相互作用。
荧光蛋白标签
若是与荧光蛋白融合，则能够实现目的蛋白的细胞内观察。多家公司都提供荧光蛋白标签载体，如Clontech、Life Technologies等。生物通之前也详细介绍过，请看《》。
Clontech最近还推出了一些新产品，包括光转换蛋白载体。Dendra2是来源于八放珊瑚（Dendronephthya sp）的单聚体荧光蛋白质，其荧光可由绿色转换成红色。转换之后，红色荧光增强150-300倍，而绿色荧光降低10-15倍。因此，红色-绿色荧光比值的增加产生了约400倍的对比度。它是示踪蛋白动态 (蛋白质的移位、降解等) 和实时监测选定细胞行为的理想选择。
PAmCherry则是荧光蛋白mCherry的光激活突变体，它一般不发光，而在350-400 nm光下暴露一会儿之后，会发出红色荧光。这种荧光蛋白具有较快的成熟速度和较高的对比度以及更大的量子产率，因此具有更好的应用前景。它目前已应用在超高分辨率显微镜（如PALM和STORM）中。
Timer则随着时间的推移慢慢地从绿色变成红色。只要检测红、绿光的比率（重叠时为黄色），就可以推测出这个启动子开启和关闭的时间，也就可以确定目的蛋白的表达时间和存在时间。这种荧光蛋白为实时研究启动子的调控时效提供了可能：在活细胞或者活的生物体内，你不但可以看到某个启动子什么时候、在什么位置开始启动基因的表达，还可以观察到它什么时候关闭表达。
功能控制标签
Clontech也提供一些蛋白功能控制标签，例如iDimerize和ProteoTuner标签。iDimerize标签让研究人员可利用特异配体使目的蛋白二聚化，实现蛋白之间相互作用的精确、实时控制。只需要将Dmr结构域与您的目的蛋白融合，并转染到目标细胞，表达融合蛋白。当培养基中添加了细胞通透性的二聚化因子（dimerizer）时，这种因子促使融合蛋白质亚基之间互相靠近，可以模拟在某种调控条件下，细胞内蛋白质的二聚化过程。
ProteoTuner标签则更为神奇，堪比魔术师。它让研究人员能利用小分子调控细胞内任何目的蛋白的表达水平。当12 kD的DD结构域与目的蛋白融合时，就成为蛋白酶体降解的目标，从而破坏蛋白的稳定。而一种名为Shield1的配体可保护DD融合蛋白免受降解，使融合蛋白在细胞内累积。稳定作用只需15-30分钟即可完成，让用户可监控快速诱导蛋白的影响，比传统的四环素诱导方法更快。
多功能的标签
若您还未考虑好该用什么颜色，或者希望使用一些更灵活的标签，那么也有很多产品可以选择，比如Promega的HaloTag&、Life Technologies的Lumio，以及NEB的SNAP-tag、CLIP-tag、ACP-tag和 MCP-tag等。每个系统都是独特的，但基本原理一致，将目的蛋白与另一个蛋白或肽段融合，后者可与检测或捕获试剂特异结合。这种策略让我们可标记或纯化蛋白。
Promega的HaloTag系统就是将目的蛋白与一种经过修饰的酶（HaloTag蛋白）融合，这种酶可与氯化烷烃底物共价偶联。如果底物与荧光染料结合，那么您的蛋白就成了荧光标记的蛋白。如果底物附着到固定表面，那么就是固定化的蛋白。一些HaloTag特异的表面（称为HaloLink），包括磁珠和非磁珠以及HaloLink Protein Array System，可利用这种方法捕获和展示蛋白质。
总之，选择多种多样，HaloTag带来了荧光蛋白所没有的灵活性。有了荧光蛋白，您必须固定在一种颜色。而有了HaloTag，您可以在多种配基中选择，红的绿的，细胞通透的，非通透的。这是传统的荧光蛋白所不能给予的。
我们可以利用HaloTag技术成像活的或固定的哺乳动物细胞，监测 HaloTag 融合蛋白在细胞内部的迁移，观察亚细胞结构或蛋白更新周期。也能够实现从细胞到凝胶的分析，可以从活细胞、或体外转录/翻译反应中，通过固相载体获得HaloTag融合蛋白或者蛋白复合物。
如果您对上述HaloTag技术的应用感兴趣，而又不知从何入手，这里有篇文章刚好适合您：《》。
Invitrogen的Lumio技术和HaloTag有点相似，是基于FLAsH( Fluorescein Arsenical Hairpin)技术，通过在目的蛋白中融合“Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys”（4xCys + 2 除Cys外的任意氨基酸）片段，与一种联胂类荧光素衍生物耦合，使后者发荧光，从而实现蛋白的实时观测分析，并且可以通过电泳直接分析蛋白。Lumio的优势在于6个氨基酸的小Tag（大约0.5 kD）对目标蛋白影响较小；而且底物不发光，结合Tag后才发光，所以本底很低，不需要洗去未结合底物。Lumio的底物目前只有红色和绿色荧光2种，前者对细胞形态有影响，发光稳定性差，多推荐用绿色。
New England Biolabs（NEB公司）也推出了蛋白质标记SNAP-tag新技术，可将哺乳动物细胞体内蛋白质成像并且体外捕获蛋白质。为了使用方便，NEB目前提供两套系统：一套是标记物可以自我标记构建好的融合蛋白（SNAP-tag和CLIP-tag），另一套是标记物通过酶促标记蛋白（ACP-tag和MCP-tag）。
SNAP-tag和CLIP-tag技术能将目的蛋白以共价键的形式，特异地标记上任何分子。SNAP-tag来自人烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶。此酶是一种DNA修复蛋白，它的底物是一类苄基嘌呤和嘧啶的衍生物，包括苄基鸟嘌呤。标记反应时，底物的苄基部分被替换，与SNAP-tag形成共价键。操作时应包括两个步骤：亚克隆目的蛋白，使其与SNAP-tag形成融合蛋白；选择理想底物标记SNAP-tag。CLIP-tag是由SNAP-tag衍生而来，经过基因改造，使其不与苄基鸟嘌呤衍生物结合，而与苄基胞嘧啶衍生物结合。这样，与SNAP-tag联合使用时，CLIP-tag能够同时标记同一个细胞中的两个不同蛋白。
与荧光蛋白相比，SNAP-tag系统具有一些优势。首先，荧光蛋白是一直“开”的，而带标签的蛋白只有在加入荧光基团后才发光。用户只需要选择不同的配基，即可改变蛋白的颜色。此外，这一系统利用有机的荧光基团，通常比荧光蛋白更亮。对于高要求的应用，如超高分辨率显微镜和单分子成像，荧光蛋白的光物理性质就不如有机染料好。
NEB提供多种底物：一些是细胞通透性的，能特异性标记活细胞内带有SNAP-tag的融合蛋白，也能标记细胞表面或体外带有标签的融合蛋白；另一些是细胞非通透性的，通常用于标记活细胞表面融合有SNAP-tag的蛋白。除了荧光标记物，还有生物素标记物，让用户可将自己的荧光基团或捕获试剂与SNAP-tag或CLIP-tag配基偶联。
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联系信箱：您好~谢谢您的回答。请问FAM标记是什么意思？就是荧光标记的意思吗？那这个荧光有很多种类吗还是？谢谢！
fam是常用的荧光物质，用做标记物，呈蓝色。类似的还有很多种，有红色、绿色、黄色等等。
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巫小姐_3887
主要是对蛋白质和dna等遗传物质的跟踪
通俗的说就是一堆一样的小球取出几个涂上颜色然后再放回去晃一晃
你也一样可以找到那些是你之前取出的
化学发光标记和荧光标记都可以用于定性或定量的检测DNA、蛋白等分子，主要手段是通过抗体直接或者间接的标记，然后通过检测发光的能量（光强度）进行定性或定量的分析。不同的是，荧光是通过携带的荧光物质发光，而化学放光是通过化学反应导致的发光，A物质和B物质反应，生成了可以发光的C物质，去检测C物质发光的光强度。具体的发光原理你可以仔细看看向光的书，讲免疫标记技术的或者讲组织化学的书上都有。...
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