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人外周血淋巴细胞的提取与保存
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干细胞搜网实验室人员教你如何分离外周血中的淋巴细胞，提取，培养并刺激T淋巴细胞生长，再用T淋巴细胞进行CAT质粒的转染，转染后测细胞的DNA修复能力（DRC）（HCR实验），具体的人外周血淋巴细胞的提取与保存如下
人外周血淋巴细胞的提取：
一、采集血样，室温保存。
使用一次性的抗凝的真空抽血管进行采血。一般使用EDTA或肝素抗凝均可；血量一般为2-5ml；一般地，1ml外...
干细胞搜网实验室人员教你如何分离外周血中的淋巴细胞，提取，培养并刺激T淋巴细胞生长，再用T淋巴细胞进行CAT质粒的转染，转染后测细胞的DNA修复能力（DRC）（HCR实验），具体的人外周血淋巴细胞的提取与保存如下
人外周血淋巴细胞的提取：
一、采集血样，室温保存。
使用一次性的抗凝的真空抽血管进行采血。一般使用EDTA或肝素抗凝均可；血量一般为2-5ml；一般地，1ml外周血中含有大约1-2*10^6个单个核细胞（PBMC，即淋巴细胞核单核细胞）。
（点击了解）
二、提取淋巴细胞。
在无菌的塑料离心管中加入2ml淋巴细胞分离液，在装有2ml血样的真空管中加入2mlPBS（磷酸盐缓冲液），1：1混匀。然后缓慢把混匀的血样PBS混合液加入到有淋巴细胞分离液的离心管中，注意要缓慢，使血样尽量位于提取液上层，不能太用力让血细胞扩散到下层，就没办法离心分层了。（这一步的操作应该尽量快速的完成，因为时间长了，红细胞就会在重力作用下沉降，混入到提取液中，对后面的离心造成影响）然后离心。1500rpm,15min,20摄氏度。
1、从采集血样到开始实验的时间最好不超过4小时。实验过程中一直保持室温条件，一般20摄氏度比较适中，因为细胞的最适温度是体温37摄氏度，但是温度降低又可以降低细胞的代谢，两者有些矛盾，所以取中间温度比较理想。
2、关于淋巴细胞分离液的注意事项：启封后应置4℃保存避免微生物的污染；分离液从冰箱取出后，不可立即使用，需待溶液温度升至室温时，摇匀后使用； 整个分离过程中，温度应控制在18-28℃且在无菌环境下，避免微生物的污染，否则会影响分离质量；未启封前在18-25℃避光保存，启封后置4℃保存，本品为真空包装，未启封前置于10℃ 以下易出现白色结晶，影响分离效果。（各种淋巴细胞分离液的保存温度不完全一致）
淋巴细胞分离液是一种根据细胞密度差异，借助离心产生的重力加速度，进行细胞的分离纯化的常用试剂，为带有乳光或微乳光的灭菌水溶液，主要成分是葡聚糖与泛影酸葡甲胺。适用于人淋巴细胞和大多数哺乳动物细胞的分离纯化，能除去红细胞和死细胞碎片，所获得的PBMC可进一步用于原代培养或流式细胞分析。最常用的细胞分离液有Ficoll和Percoll。
3、PBS溶液是一种平衡盐溶液，还可以用Hank&s液或生理盐水代替PBS溶液，但最常用的还是PBS溶液。
4、离心的条件有很多说法。转数范围为rpm，时间范围为10-20分钟，温度为室温20摄氏度。推荐两步离心法：首先用1500rpm/min离心20min，如果白膜层足够一步就结束，如果发觉细胞不够，说明该病人的淋巴细胞比重较低，再重新用2000rpm/min离心10min
三、离心后，分四层。
淋巴细胞位于第二层（从上到下），呈白蒙蒙的一薄层。用5ml的小注射器吸取分离液层中的淋巴细胞，这里技巧性比较强，需要多次练习才能比较熟练的把淋巴细胞吸的比较完全。把吸取的淋巴细胞溶液装入另一无菌离心管中。用小注射器前，需把针头拧紧，抽动几下，减小摩擦力。再次离心。1500r,10min，20摄氏度。
把离心后的上层液体倒掉，淋巴细胞位于离心管底的一小点白色的物质，一般会混有少量红细胞，尽量避免。加入4mlPBS缓冲液到离心管中，（并用加液枪吹打底部的白色物质，把其打散【该步也有认为不吹打的，以避免淋巴细胞粘在壁上，造成损失】）。注意换枪头。再洗涤两次，离心条件为：1500r,10min，20摄氏度。
1、有时离心后得到的淋巴细胞层很薄，淋巴细胞很少，这可能是离心转数不够，淋巴细胞还飘在分离中造成的，最好再用2000rpm，10min，20摄氏度再次离心一下。
2、吸取淋巴细胞的方法还可以用长嘴胶头滴管，不带刻度的，使用的时候在顶端套上一个橡皮吸头。这种方法比注射器使用方便，而且吸得更完全。
3、洗涤后离心的条件，离心范围为rpm，通常用1500rpm就足够了，太高了容易把细胞离死。时间为10min，温度还是室温20摄氏度。
4、离心后，看到淋巴细胞中混有少量红细胞，在这个实验中问题不大。
5、洗涤液的选择也是平衡盐溶液即可，作用主要是去除淋巴细胞中的血浆蛋白和血小板，红细胞很难去掉。一般洗涤液用4-5ml即可。
四、用Trizol reagent 裂解淋巴细胞，提取RNA。
在离心管中加入1ml Trizol试剂，可以裂解除RNA以外的其他大分子物质，细胞膜，细胞器等。这个东西有致癌、致畸性，要带口罩，小心操作。用加液枪吹打离心管底部的淋巴细胞团块，把其打散。一般至少吹打30-60次，主要目的是把其打散，让Trizol试剂充分裂解淋巴细胞。把吹打之后的液体转移到EP管中，存放在-80摄氏度冰箱中。
1、TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。
2、在TRIZOL中，RNA是隔离在RNA酶污染之外的。而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150&C的烘箱中烘烤4小时。塑料器皿可以在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。当TRIZOL用量少于2-ml时建议使用清洁的一次性的聚丙材质试管。
3、最后用于装裂解细胞的EP管要塑料器皿可以在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。
人外周血淋巴细胞的保存其实和绝大多数的原代细胞冻存一样，具体可以参考
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扫描二维码高糖状态下氧化应激增加,产生大量的氧自由基,引起细胞DNA的损伤,导致细胞损伤[凋亡和(或)死亡],与糖尿病(DM)的一些慢性并发症如冠心病的发病相关[1]。维生素E(V itE)是1种重要的抗氧化性维生素,具有诱导凋亡、抑制细胞增殖和提高免疫力等功能,在保护细胞免受氧自由基的损伤方面起着较为重要的作用[2]。我们通过检测糖尿病患者和对照组外周血淋巴细胞DNA损伤和V itE水平,探讨糖尿病患者高血糖对细胞DNA损伤的影响,以及抗氧化损伤水平(V itE水平)在糖尿病与对照组之间的差异。对象与方法1.对象:糖尿病组32例,均为我院门诊和住院的糖尿病患者,均经OGTT试验证实,符合WHO制定的糖尿病诊断标准。对照组32例,为我院体检者,无血糖升高。两组的年龄、性别构成比、胆固醇、甘油三酯、体重指数(BM I)和吸烟状态比较无差异。见表1。表1糖尿病组和对照组的一般情况比较组别例数男/女(例)年龄(岁,x-±s)BM I(kg/m2,x-±s)...
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作用生成cDNA。②根据已知目的基因的核苷酸序列，合成引物、通过PCR扩增获取目的基因，此时需要加入的反应物与生成cDNA时所加反应物不同的是
（至少写出两种）。（2）重组载体的构建：由图中可知：酶切载体和目的基因用的是
酶，经DNA连接酶处理，形成重组载体。重组载体的化学本质是
（3）将重组载体导入酵母细胞，在培养液中培养一段时间后，利用纯化的产物进行细胞培养实验，可研究人的白细胞介素对于
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白细胞介素是一类淋巴因子。研究人员将白细胞介素的基因导入到酵母细胞中，使其分泌出有活性的人白细胞介素。（1）目的基因获取和扩增：①从健康人体外周静脉血分离得到淋巴细胞，于37℃培养48h，提取细胞总RNA，经
作用生成cDNA。②根据已知目的基因的核苷酸序列，合成引物、通过PCR扩增获取目的基因，此时需要加入的反应物与生成cDNA时所加反应物不同的是
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酶，经DNA连接酶处理，形成重组载体。重组载体的化学本质是
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作用生成cDNA。②根据已知目的基因的核苷酸序列，合成引物、通过PCR扩增获取目的基因，此时需要加入的反应物与生成cDNA时所加反应物不同的是
（至少写出两种）。（2）重组载体的构建：由图中可知：酶切载体和目的基因用的是
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科目:最佳答案见解析解析
（1）以RNA为模板合成DNA需要题干逆转录（反转录）。PCR扩增获取目的基因时需要模板cDNA、热稳定DNA聚合酶、引物、原料。（2）由图示可知载体和目的基因都有限制酶EcoRⅠ与EcoR52的识别位点和切割位点，所以酶切载体和目的基因用的是两种限制酶EcoRⅠ与EcoR52，重组载体实际上是重组DNA,因而其化学本质是DNA。（3）白细胞介素可治疗癌症，因此可推知白细胞介素可抑制肿瘤细胞的增殖。
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