两个PCR片段的overlap 我现在需要将片段1(1900bp)和片段2(1800bp)连接起来.片段1的上下游引物分别为1a,1b.片段2的上下游引物分别为2a,2b.1b 和2a是反向互补的,约22个碱基,现在我已分别通过1a-1b,2a-2b扩增出片段1和2（酶用的是高保真酶primerstart）,并进行了胶回收,然后通过1a(Tm值：47)和2b（Tm值：49）进行overlap PCR,退火温度是40°5个循环,45°25个循环,延长时间均为4min,结果没有出现目的片段,都做了好几次了,只有引物二聚体.有一次做出来是弥散一片,是我模板加多了?财富没有了~
dahuntun624
Overlap PCR开始几个循环模板本来就是当引物使用的,所以模板可以多加,1和2都加到100ng左右.你没有告诉我1b(2a)的Tm,Overlap的前几个循环要考虑两个模板互补的Tm.你的退火温度太低了,特异性不够强（除非你的Taq酶对退火温度有特殊要求,这个我不知道）.我的建议：前10个循环,用1a,1b,2b中最低的Tm做退火温度,适当延长退火时间.后25个循环用1a,2b中最低的Tm做退火温度,正常退火时间（和你Taq酶的要求有关）.你模板链长度不小,不要怕多加模板.
你好，非常感谢你的答案！！我查看了一下，1b和2a的Tm值均是46.65°，他们是反向互补的。你的意思是在配置PCR体系时还是要把1a和2b及酶都加进去，前10个循环用46°做退火温度，后25个循环再用47°做退火温度，退火温度均为30s，延长时间为4min?不知道这样行不行？
嗯，这个体系我觉得挺合理的，你可以试一试。
好的！！感谢！！尝试后我告诉你结果！！
还有，一般在初始阶段就可以加入引物1a，2b，这样可以可以增加片段1，2在反应体系中的数量，使1，2之间有更大机会可以互补配对，不用先跑十几个回合再加引物。我一般这么做成功率还是很高的。再有，如果PCR后目的条带产量不高，可以凝胶回收，再跑一次PCR，这样目的产物的量就肯定足够了。
你好，今天跑胶，已经看到目的条带了！！呵呵，太高兴了，但是还是有几条非特异性的扩增条带，而且我用rTaq酶可以P出来，用primerstart高保真酶就P不出来了~~只有非特异性的条带，这是为什么啊？是因为酶的效率不高吗？
高保真只是proofreading防止错配的能力提高几十倍，酶的复制效率要比普通taq差，不出东西的时候少用高保真酶。有目的条带就行了，切胶回收，以其为模板再做一次普通PCR就不会有非特异性扩增了。
另外，给你介绍一种新的taq酶，功能很强大，/nebecomm/products/productf-530.asp。就不知道现在国内有没有卖。
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楼上说得很有道理。温度很低啊。建议你先不要加引物，做10个循环（模板本身就是引物）。然后再加入引物1a和2b.还有退火温度比TM低5度，40度那步不要。可以换成49度5个循环。你好，谢谢你的答案。那我在前面10个循环加酶吗？我看到网上有说不加酶。还有就是一共只做15个循环码？加酶。只做15循环肯定不够的。那我先做10个循环，然后加入1a,2b，再扩增49°25个循环，可以吗？先...
加酶。只做15循环肯定不够的。
那我先做10个循环，然后加入1a,2b，再扩增49°25个循环，可以吗？
先这样试试吧
你好，今天跑胶，已经看到目的条带了！！呵呵，太高兴了，但是还是有几条非特异性的扩增条带，而且我用rTaq酶可以P出来，用primerstart高保真酶就P不出来了~~只有非特异性的条带，这是为什么啊？是因为酶的效率不高吗？
恭喜了. 有可能对温度要求不一样。
为了除掉非特异条带，你可以跑胶后切下条带，提纯后在P一次（这次只用2头的引物）
扫描下载二维码即先用PCR分别扩增出要拼接的基因片段
时间： 16:10:18
军事医学科学院院刊2002年12月第26卷第4期BullAcadMilMedSci,Dec2002;Vol26No4&&&&&&&&257&&&&&&&&富含GCDNAPCR扩增条件的优化&&&&张部昌,赵志虎,于秀琴,刘传暄,马清钧&&&&(1.军事医学科学院生物工程研究所,北京&&&&[摘要]&&&&1,21111*&&&&&&&&.安徽大学生命科学学院,合肥&&&&&&&&230039)&&&&&&&&目的:探索富含GCDNA的PCR扩增条件,为大环内酯类化合物组合生物合成中模块和酶域的任意组合&&&&&&&&奠定基础。方法:在PCR扩增体系中,添加甲酰胺、甘油、二甲亚砜(DMSO)、Mg2+等增强剂,并选择合适的扩增体系,优化富含GCDNAPCR扩增条件。结果:甲酰胺对富含GCDNAPCR扩增没有影响,而甘油和DMSO均可提高富含GCDNAPCR产物的特异性和产率,以5%~10%DMSO效果最好。使用Roche长片段DNA扩增系统,在使用缓冲液2反应体系中添加10%DMSO和提高0.25mmolPLMg2+浓度时,可以扩增长度为5kb、GC含量为73%的DNA片段。结论:应用优化的PCR扩增条件,可以扩增长达5kb富含GC的DNA片段,可以满足大环内酯类组合生物合成模块和酶域随意组合的需求。[关键词][文章编号]组合生物合成;聚合酶链反应;增强剂;富含GCDNAQ789[文献标识码]A02)04_0257_05[中图分类号]&&&&&&&&OptimizingconditionsforPCRamplificationofDNAwithrichGC&&&&ZHANGBu_Chang&&&&1,2&&&&&&&&,ZHAOZhi_Hu,YUXiu_Qin,LIUChuan_Xuan,MAQing_Jun&&&&&&&&1&&&&&&&&1&&&&&&&&1&&&&&&&&1&&&&&&&&(1.InstituteofBiotechnology,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing.SchoolofLifeSciences,AnhuiUniversity,Hefei230039,China)[Abstract]Objective:TodeterminetheoptimizedconditionsforPCRamplificationofDNAwithrichGCinordertofreelyas-&&&&&&&&semblemodulesordomainsofpolyketidesynthase(PKS)inmacrolidecombinatorialbiosynthesis.Methods:Formamide,glycerol,DMSOandMg2+wereaddedtothePCRamplificationsystemandamplificationsystemwaschosentooptimizetheconditionsforPCRamplificationofDNAwithrichGC.Results:FormamidehadnoinfluenceonPCRamplificationofDNAwithrichGC,whilebothglycerolandDMSOpromotedoutputandspecificityofPCRproduct,with5%-10%DMSOshowingthebesteffectiveness.WhenRocheExpandLongTemplatePCRSystemwasusedand10%DMSOandextra0.25mmolPLMg2+wereaddedtobuffer2,5kbDNAwith73%GCcontentwasamplified.Conclusion:WithadditionofDMSOandextraMg2+toPCRsystem,atleast5kbDNAwithrichGCcouldbeamplified,andthatcanmeettheneedtoassembleanymodulesordomainsinmacrolidecombinatorialbiosynthesis.[Keywords]combipolDNAwithrichGCsion,SOE)[3]可以较好地解决这一问题,即先用PCR分别扩增出要拼接的基因片段,再以它们为模板用PCR扩增出整个目的基因片段。然而,合成大环内酯类抗生素的放线菌基因组DNA中GC平均含量都超过70%,而且合成大环内酯的PKS基因一般都特别大[1,4]。我们曾尝试用常规PCR条件扩增红色糖多孢菌(糖多孢红霉菌,Saccharopolysporaerythraea)部分PKS基因,但没有成功,而有关富含GCDNAPCR扩增文献较少。为此,我们探索高GC含量DNA的PCR扩增条件,为组合生物合成中模块或酶域基因任意拼接奠定基础。&&&&&&&&大环内酯类抗生素母环是一类聚酮(polyketide)化合物,其生物合成由聚酮合成酶(polyketidesynthase,PKS)复合体催化完成,PKS复合体一般由多条肽链组成,每条肽链含有一个或一个以上模块(module,M),模块又由多个结构和功能独立的酶域(domain)组成&&&&[1]&&&&&&&&。大环内酯类生物合成PKS的肽&&&&&&&&链、模块和酶域,与染色体上DNA序列是一一对应的,可以通过在体内或体外改造PKS基因而对PKS进行定向改造[2]。一是将不同PKS的肽链基因直接组合;二是模块基因组合。可以是肽链基因间组合,更多的是肽链基因内组合,后者需要选择PKS基因模块间合适的酶切位点,以保持基因阅读框架的一致。三是酶域基因组合,这一层次为肽链基因内组合,也需要选择相应基因酶域间合适的酶切位点。但在模块或酶域的基因片段之间往往没有理想的限制性酶切位点,因而难以将目的模块或酶域基因片段准确拼接。应用重叠PCR(overlapPCR)或重叠延伸剪接术(splicingbyoverlapexten-&&&&&&&&[收稿日期][作者简介]&&&&&&&&&&&&&&&&张部昌(1965-),男,安徽省蚌埠市人,博士,副教授。*通讯联系人,Tel:86_10_;Fax:86_10_&&&&&&&&&&&&2581材料和方法&&&&见表1。&&&&表1菌株和质粒菌株S.erythraeaA226E.coliDH5A质粒pUC18pGEM_TpUC_TpUC_TEpGEM_M6pUC2201本室保存Promega公司北京博大公司本研究本研究本研究中国医学科学院王以光教授惠赠本室保存本研究使用的菌株和质粒来源&&&&&&&&军事医学科学院院刊&&&&&&&&2002年12月第26卷第4期&&&&&&&&?m6引物设计,参考文献[4]序列:正向:5c_CTGAATTCATATGAAGGATGCCGACGACCCGATC_GCGATCGTC(斜体为EcoR?和Nde?位点);反向:5c_ATGAAGCTTGTCGACTCATGAGTTCCCTCCGCCC_AG(斜体为Hind?和Sal?位点)。?m6片段的扩增:A加样:混合物1:8Ll4@2.5mmolPLdNTP,2@6Ll2.5LmolPL引物,5Ll基因组DNA模板。混合物2:5Ll缓冲液1或2或3(增强剂,Mg2+溶液),0.75Ll长片段DNA聚合酶,用水补充到25Ll。B扩增条件:先将混合物1在95e变性解链5min,加入混合物2,进行循环扩增:(94e1min,65e1min,68e8min)@30;最后68e延伸7min。(3)富含GCDNAPCR扩增技术在组合生物合成中的应用:敲除M6中酮还原酶(ketoreductase)(KR6)域基因。?敲除KR6基因片段(kr6)引物设计,参考文献[4]序列:kr6上游片段(1.8kb):&&&&[5]&&&&&&&&1.1菌种和质粒&&&&&&&&1.2培养基、缓冲液和化学试剂LB培养基按Sambrook等方法按Hopwood等方法[6]。溶菌酶为Fluka公司产品,蛋白酶K为Amresco公司产品,TSB为Difco公司产品,限制性内切酶、T4DNA连接酶为Biolab公司产品,TaqDNA聚合酶为MBI公司产品,pfuDNA聚合酶为上海生工公司产品,长片段DNA聚合酶(ExpandLongTemplatePCRSystem)为Roche公司产品,dNTP、DNAMarker(DL2,000、DL1,5000和KPHind?)为大连宝生物公司或MBI公司产品,质粒纯化试剂盒和PCR纯化试剂盒为Promega公司产品。其他试剂为分析纯。1.3实验方法1.3.1大肠杆菌的培养、感受态制备、质粒酶切、连接、转化等按Sambrook方法[5]或产品说明书进行。质粒提取、PCR产物纯化按Promega公司产品说明书进行。1.3.21.3.3红色糖多孢菌A226的培养和总DNA的提取总DNA的含量测定采用紫外分光光度法。按Hopwood等方法[6]进行。1.3.4PCR扩增一般条件(1)小片段富含GCDNAPCR扩增,选择红色糖多孢菌硫酯酶(thioesterase,TE酶)域基因片段(te,0.75kb)。?te引物设计,参考文献[4]序列:正向:5c_CTGAATTCATATGCTGCTGGCGGGGCTGTCGGACT(斜体为EcoR?和Nde?位点);反向:5c_ATGAAGCTTGTCGACTCATGAGTTCCCTCCGCCCAG(斜体为Hind?和Sal?位点)。?te片段的扩增条件:A加样:5Ll总DNA模板,5Ll4@2.5mmolPLdNTP,5Ll10@TaqDNA聚合酶缓冲液,2@10Ll2.5LmolPL引物,1LlTaqDNA聚合酶,增强剂适量,最后用水补充至50Ll。B扩增条件:95e5min,(94e1min,65e1min,72e1min)@30,72e7min。(2)大片段富含GCDNAPCR扩增,选择红色糖多孢菌模块(module,M)6基因片段(m6,5.07kb)。段。,TSB培养基、TE缓冲液&&&&&&&&正向:5c_TACGAATTCAGATCTCATGCGGCTCCTGGAGTC_CGCAGTGGACG(斜体为EcoR?和Nde?位点);反向:5c_CTCGAGGTCGCCGGTGGCCGGGCCCGCCGGCTC_CCAGCTCGACTCG(黑体为基因拼接处,后一个G由T突变而来,以便于Apa?酶切鉴定)。kr6下游片段(1.4kb):正向:5c_CGAGTCGAGCTGGGAGCCGGCGGGCCCGGCCACCGGCGACCTCGAG(黑体为基因拼接处,前一个C由A突变而来,以便于Apa?酶切鉴定);反向:5c_TTCAAGCTTCTGCAGTCATGAGTTCCCTCCGCCCAGCCAG(斜体Hind?和Sal?位点)。?敲除kr6基因片段PCR扩增条件:kr6上游和下游片段的PCR扩增:A加样:5Ll总DNA模板,5LlDMSO,5Ll4@2.5mmolPLdNTP,5Ll10@pfuDNA聚合酶缓冲液,10Ll水,2@10Ll2.5LmolPL引物,1LlpfuDNA聚合酶。B扩增条件:95e5min,(94e1min,65e1min,72e3min)@30,72e7min。重叠PCR扩增:A加样:混合物1:8Ll4@2.5mmolPLdNTP,2@6Ll2.5LmolPL引物(上游正向引物和下游反向引物),2@2.5Ll上游和下游片混合物2:5Ll缓冲液2,5LlDMSO,5Ll2.5mmolPLMg2+溶液,0.75LlDNA聚合酶,用水补充到25Ll。B扩增条件:混合物1在95e变性5min,加入混合物2进行循环扩增:(94e1min,65e1min,68e5min)@30,68e7min。&&&&&&&&2结果&&&&2.1模板DNA的制备和含量测定接种1ml红色糖多孢菌A226冻存菌丝体于50mlTSB培养基,培养48h后提取总DNA,用RNase降解其中RNA,再&&&&&&&&&&&&第4期&&&&&&&&张部昌,等1富含GCDNAPCR扩增条件的优化&&&&&&&&259&&&&&&&&用苯酚_氯仿去除蛋白质,最后溶于1mlTE缓冲液中,紫外测定DNA浓度约为105LgPml。2.2小片段富含GCDNA的PCR扩增在大环内酯组合生物合成时,酶域是具有独立结构和功能的最小单位,故在此选择常用的TE酶域DNA序列(te)作为研究对象。开始使用常规PCR条件,未观察到扩增产物。有文献报道[3],在反应体系中加入增强剂可以提高反应的特异性和产量,常用的增强剂有:甲酰胺、甘油、DMSO、PEG_6000、明胶、牛血清蛋白、TritonX_100等。明胶、血清蛋白等主要是起稳定聚合酶的作用,而甲酰胺、甘油和DMSO则主要是降低解链和链分离温度。显然,解决高GC含量模板PCR扩增与解链温度有关,因此探讨了不同浓度甲酰胺、甘油和DMSO对富含GCDNAPCR的影响,结果5%或10%甲酰胺不能改善富含GCDNA的PCR扩增,以其作增强剂没有相应的PCR产物;在PCR体系中添加5%和10%的甘油都可以扩增出富含GCDNA产物,10%甘油较5%甘油对PCR扩增效果为好,如图1。&&&&&&&&模块基因(m6)作为PCR扩增研究对象。&&&&&&&&图2&&&&&&&&DMSO对PCR产物的影响&&&&&&&&1.DNA标记物;2.加5%DMSO;3.加10%DMSO&&&&&&&&在国内能够提供的商品酶中,用于长片段的DNA合成酶有Roche公司的ExpandLongTemplatePCRSystem、大连宝生物公司(TaKaRa)的TaKaRaLATaqwithGCBuffer等。按产品说明书,若以KDNA作模板,它们都可以扩增35~40kbDNA片段,但若以高GC含量的DNA作模板,在给出的例证中,仅能扩增不到3kb的DNA片段。在此,我们选择Roche公司的ExpandLongTemplatePCRSystem来研究长片段富含GCDNA的扩增条件。先按照产品说明书,未加增强剂和Mg2+,仅改变扩增系统中的缓冲液,结果使用PCR试剂盒中的三种缓冲液均没有检测到PCR产物,说明仅仅使用试剂盒中的缓冲液,不能扩增长片段富含GCDNA片段。分别在三种缓冲液中加5%或10%的甲酰胺、甘油或&&&&图1甘油对PCR产物的影响&&&&&&&&DMSO,同样没有PCR产物。说明只添加增强剂对于提高小片段富含GC模板PCR扩增有效,而对于长片段高GC含量模板,仅仅添加增强剂还不够。在Roche产品说明书中述及,若没有PCR产物可尝试提高Mg2+浓度。由于试剂盒中缓冲液2和3的Mg2+浓度相同,故仅使用了缓冲液2。在PCR反应体系中加10%DMSO的同时,使Mg2+浓度增加0.25mmolPL,结果出现相应的PCR产物,如图3。因在PCR扩增时退火温度已接近延伸温度,若消除非特异性条带需重新设计引物,但一般情况下在目的条带达到一定产率时,已可满足克隆需要。2.4长片段富含GCDNAPCR产物的克隆和鉴定按照文献[4]序列,m6的DNA序列长度约为5.07kb,但图3中PCR产物目的片段略小于文献值。为了找出其中的原因,随将PCR产物用0.8%琼脂糖分离回收,与pGEM_T载体相连,转化大肠杆菌DH5A菌株,构建了pGEM_M6质粒。提取pGEM_M6质粒,用EcoR?和Hind?酶切鉴定,结果酶切片段与理论值接近(图4),说明PCR产物电泳图中目的条&&&&&&&&1.DNA标记物;2.加5%甘油;3.加10%甘油&&&&&&&&在PCR体系中添加5%和10%DMSO都可以提高PCR产物产量和特异性,且两种浓度对产物产量和特异性没有差异,如图2。因甘油黏度大,取样困难,还受浓度影响,故以5%~10%DMSO作为增强剂时PCR扩增小片段富含GCDNA较为理想。为了检验在此条件下PCR产物的保真度,用EcoR?和Hind?双酶切添加10%DMSO作增强剂的PCR产物,并克隆于pUC18相应酶切位点,构建了pUC_TE质粒。经DNA序列分析,所扩增的TE基因片段序列与文献[4]报道完全吻合,表明以DMSO作增强剂时PCR扩增的产物具有很高的保真度。2.3大片段富含GCDNA的PCR扩增在大环内酯的生物合成过程中,完成一轮碳链延伸最小的酶单位为模块,故在组合生物合成中,模块去除或替换是最常见的组合方式之一。为此我们选择了红色糖多孢菌M6&&&&&&&&&&&&260&&&&带略小,可能是由于在PCR产物中小分子杂带较多,使目的条带前移的结果。表明使用Roche公司的ExpandLongTemplatePCRSystem至少可以扩增5kb高GC含量的DNA片段。&&&&&&&&军事医学科学院院刊&&&&&&&&2002年12月第26卷第4期&&&&&&&&设计扩增kr6上游和下游DNA片段引物,其中上游片段的反向引物和下游片段的正向引物完全互补,重叠片段间已完全去除kr6片段。先按上述小片段DNA扩增条件,用pfuDNA聚合酶分别扩增出kr6上下游片段,结果如图5和图6,表明在上述条件下,用pfuDNA聚合酶也可以扩增出长达1.8kb的高GC含量DNA片段。用凝胶纯化目的PCR产物,适当浓缩后作重叠PCR扩增模板,再按材料和方法中的条件用重叠PCR扩增出去除kr6的DNA片段,分离纯化PCR产物后克隆于pUC_T载体,构建了pUC2201质粒。用EcoR?和Hind?双酶切pUC2201结果与预期的相一致,如图7。&&&&&&&&图3&&&&&&&&m6PCR产物&&&&&&&&图5&&&&&&&&kr6上游片段PCR扩增&&&&&&&&图4&&&&&&&&pGEM_M6双酶切鉴定&&&&&&&&2.5高GC含量PCR扩增技术在组合生物合成中的应用在红霉素生物合成过程中,M6中的KR6负责将大环内酯环C_3位酮基还原成羟基,若KR6基因(kr6)敲除则在红霉素合成过程中大环C_3位保留酮基形式,成为酮内酯类化合物,酮内酯类化合物是第三代红霉素的母核结构[7]。我们&&&&图6kr6下游片段PCR扩增&&&&&&&&&&&&第4期&&&&&&&&张部昌,等1富含GCDNAPCR扩增条件的优化&&&&&&&&261&&&&&&&&在以上条件下,我们尝试扩增约10kb的红色糖多孢菌PKS基因,没有获得成功,但用PCR方法扩增5kbDNA足以满足组合生物合成中模块或酶域的拼接,因为在5kb长DNA片段中有足够多的酶切位点供选择用于拼接。我们使用上面构建的kr6去除突变基因成功地敲除了红色糖多孢菌染色体上的kr6基因片段,合成了新的酮内酯类化合物3_脱氧_3_羰基_红霉内酯B[8]。&&&&&&&&[参考文献]&&&&[1][2][3]KhoslaC.Harnessingthebiosyntheticpotentialofmodularpolyketidesynthases[J].ChemRev,):2577-binatorialapproachestopolyketidebiosynthesis[J].CurrOpinChemBiol,):162-168.DieffenbachCW,DvekslerGS.黄培堂,俞炜源,陈添弥,等译.PCR技术实验指南[M].北京:科学出版社,,.图7pUC2201双酶切鉴定[4]CortesJ,HaydockSF,RobertsGA,etal.Anunusuallylargemultifunctionalpolypeptideintheerythromycin_producingpolyketidesynthaseofSaccharopolysporaerythraea[J].Nature,7):176-178.[5][6]SambrookJ,FrischEF,ManiatisT.金冬雁,黎孟枫,等译.分子克隆实验指南[M].第2版.北京:科学出版社,,908.HopwoodDA,BibbMJ,ChaterKF,etal.Geneticmanipulationofstretomyces:alaboratorymanual[M].London:TheJohnInnesFoundation,,405-422.[7]AgouridasC,DenisA,AugerJM,etal.Synthesisandantibacterialactivityofketolides(6_O_methyl_3_oxoerythromycinderivatives):anewclassofantibacterialhighlypotentagainstmacrolide_resistantand_susceptiblerespiratorypathogens[J].JMedChem,):.[8]张部昌,赵志虎,王以光,等.合成酮内酯类3_脱氧_3_羰基_红霉内酯B糖多孢红霉菌M的构建[J].生物工程学报,):198-203.&&&&&&&&为了检验长片段高GCDNAPCR产物的保真度,对pUC2201质粒克隆片段一端测了500个碱基序列,结果表明所检测的500个碱基与文献完全一致,表明用本文条件进行长片段高GC含量PCR扩增是可行的。&&&&&&&&3&&&&&&&&讨论&&&&有资料[3]显示,目前可以用PCR方法扩增出长达50kb&&&&&&&&的DNA片段,但报道的资料都不是高GC含量的DNA模板,用PCR方法扩增5kb高GC含量(超过70%)的DNA片段尚未见报道。在PCR扩增过程中,我们注意到退火温度对PCR结果影响很大,低于60e的退火温度几乎没有PCR产物,可能是由于高GC含量的模板和引物在温度较低时非特异性结合较多,以及形成复杂的二级结构的缘故。作为模板的总DNA浓度对PCR结果影响也很大,总DNA浓度太小则没有PCR产物,浓度太大则出现弥散带状产物。&&&&&&&&(本文编辑&&&&&&&&杨兆弘)&&&&&&&&(上接第256页)&&&&[10]BreierG.Endothelialreceptortyrosinekinasesinvolvedinbloodvesseldevelopmentandtumorangiogenesis[J].AdvExpMedBiol,-66.[11]NewbyAC.Molecularandcellbiologyofnativecoronaryandvein_graftatherosclerosis:regulationofplaquestabilityandvessel_wallremodellingbygrowthfactorsandcell_extracellularmatrixinteractions[J].CoronArteryDis,-4):213-224.[12]FolkmanJ,SzaboS,StovroffM,etal.Duodenalulcer:discoveryofanewmechanismanddevelopmentofangiogenictherapythataccelerateshealing[J].AnnSurg,):414-425.[13]KlagsbrunM,FolkmanJ.HandbookofexperimentalpharmacologyVol95[M].Berlin:Springer_Verlag,.[14]MetcalfeJ,BissonnetteJM,BowlesRE,etal.Hencseggswithretartedgasexchange.I.Chorioallantoiccapillarygrowth[J].RespirPhysiol,):97-101.[15]SchlatterP,KonigMF,KarlssonLM,etal.Quantitativestudyofintussusceptivecapillarygrowthinthechorioallantoicmembrane(CAM)[20][19][18][17][16]&&&&&&&&ofthechickenembryo[J].MicrovascRes,):65-73.ColemanJR,TerepkaAR.Electronprobeanalysisofthecalciumdistributionincellsoftheembryonicchickchorioallantoicmembrane.II.Demonstrationofintracellularlocationduringactivetranscellulartransport[J].JHistochemCytochem,):414-424.StanAC,CasaresS,RaduD,etal.Doxorubicin_inducedcelldeathinhighlyinvasivehumangliomas[J].AnticancerRes,A):941-950.AnnasA,BrunstromB,BritteboEB.CYP1A_dependentactivationofxenobioticsinendothelialliningsofthechorioallantoicmembrane(CAM)inbirds[J].ArchToxicol,):335-342.AuerbachR,KubalL,KnightonD,etal.Asimpleprocedureforthelong_termcultivationofchickenembryos[J].DevBiol,):391-394.WiltingJ,ChristB,WeichHA.Theeffectsofgrowthfactorsontheday13chorioallantoicmembrane(CAM):astudyofVEGF165andPDGF_BB[J].AnatEmbryol(Berl),):251-257.&&&&&&&&(本文编辑&&&&&&&&姜晓舜)&&&&&&&&&&&&第三人称单数:
overlap是什么意思，词典释义与在线翻译：
复合，重叠，交搭
覆盖物，涂盖层
【植】盖覆
【摄】重榫摄影
【数】交叠，相交
【军】航空照片的重叠部分
【地】超复，累叠地层
交接时期，重叠时间
【计】 重叠
交搭；部分重叠；重合，重叠
部分同时发生
部分相同，部分一致
叠盖，盖过
与...重叠，与…交搭，与…部分重叠，使部分重叠
与…部分同时发生
与…部分相同，与…部分一致，
与…部分巧合
vt. & vi. 交搭,叠盖 cover (sth) partly and go beyond it
提示：各行业词典APP中含有本词条的独家正版内容，在手机上可看到更多释义内容。
overlap&:&重叠 ...
在&&中查看更多...
overlap&:&叠置；重叠 ...
在&&中查看更多...
overlap&:&超覆 ...
在&&中查看更多...
overlap&:&重叠 ...
在&&中查看更多...
overlap&:&重叠 ...
在&&中查看更多...
overlap&:&（与...） ...
在&&中查看更多...
overlap&:&叠芯 ...
在&&中查看更多...
a representation of common ground between t
"there was no overlap between their proposals"
the property of partial coincidence in time
a flap that li
"the lap of the shingles should be at least ten inches"
"Our vacations overlap"
extend over
"The roofs of the houses overlap in this crowded city"
overlap的用法和样例：
用作及物动词 (vt.)
A fish's scales overlap each other.
鱼鳞是一片片上下交叠起来的。
You need to overlap the pieces of wood slightly.
你需要把这些木片搭叠起来。
These two papers overlap in content.
这两篇论文有交叉的内容。
The programme has been so organized that none of the talks overlap.
日程做了精心安排，以使每一讲都没有重复内容。
用作不及物动词 (vi.)
Channel ranges must not overlap.
频道范围不能重叠。
The roofs of the houses overlap in the crowded city.
房子的屋顶重叠在这个拥挤的城市的上空。
用作名词 (n.)
There is a small overlap between the two circles.
在这两个圆周有一小部分重叠。
There is a considerable overlap between the two subjects.
这两门科目之间有相当多的共通之处。
His duties and mine have an overlap.
他的职责和我的有部分交叉。
用作动词 (v.)
用作不及物动词
His duties and mine overlap.
他的任务和我的任务有重叠。
The treatment in these two books largely overlaps.
这两本书的内容有很多重复。
History and politics overlap and should be studied together.
历史与政治有相同之处,应该一起来研究。
Economics and politics are best studied together as the two subjects overlap.
经济学和政治学有部分内容交叉,所以这两门课程最好一起研究。
His visit and mine overlapped.
他的访问期和我的访问期有几天重叠。
用作及物动词
S+～+ n./pron.
One feather overlaps another on a bird's wing.
鸟翅膀上的羽毛一片压着一片。
用作动词 (v.)
羽毛一片压着一片
屋瓦一片压着一片
宽敞地叠盖
融洽地叠盖
大大地交搭
反复地交搭
丰富地叠盖
不可避免地交搭
The Dans produced five children, whose upbringing overlapped World War II.
出自：Nature
overlap的详细讲解：
overlap指两个或两个以上的物或事物重叠在一起或同时发生,或指将一个物体叠放在另一物体之上,使之成为叠盖状态,即“交搭,叠盖”。
overlap可用作及物动词,也可用作不及物动词。用作及物动词时后接名词或代词作宾语。
overlap的过去式、过去分词均为overlapped。
overlap的海词问答与网友补充：
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【近义词】
躺在……上
相互重叠的
overlap:overlap v. (与...)交迭 英英解释:名词overlap:1. a representation of common ground between theories or phenomen…
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