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V617F、exon12及MPL突变的研究--《湖南师范大学》2013年硕士论文
骨髓增殖性肿瘤JAK2 V617F、exon12及MPL突变的研究
【摘要】：白2005年JAK2基因14外显子上编码第617位氨基酸缬氨酸的点突变被发现,即为BCR/ABL融合基因阴性的MPN分子诊断提供了有力的依据。但单一的JAK2V617F突变似乎并不足以解释PV、ET、PMF的疾病发生及病程发展和转化的机制。在随后的分子遗传学研究中,陆续发现在一些BCR/ABL阴性MPN患者遗传信息中存在着其它位点的基因突变,如JAK2基因第12号外显子(exon12)、MPL基因第10号外显子(exon10)、TET2基因等。近年来国际上相关研究显示MPN的病程发展及转化很可能不仅仅受JAK2V617F单一突变的影响。然而其它类型基因突变对该病种产生影响的机制却尚未明确。对此,我们分两个部份对JAK2V617F、JAK2exon12及MPL的突变情况进行了初步的探讨和研究。
第一部份：JAK2V617F突变与MPN患者的临床关系
检测JAK2V617F突变在MPN患者中的发生率并分析其与PV、ET及PMF患者年龄、外周血象的关系；从基因组DNA与RNA/cDNA水平检测MPN患者的JAK2V617F突变。
收集110例BCR/ABL阴性MPN患者骨髓样本及临床资料,另采集2例健康人骨髓样本设为健康对照组。将各例骨髓样本分为两等份,分别提取基因组DNA及总RNA,并将总RNA反转录为cDNA。
使用基因组DNA JAK2V617F野生型引物对110例患者样本进行PCR扩增后回收电泳凝胶并送基因测序,对测序结果与患者临床资料进行统计学分析。
对cDNA进行AS-PCR扩增,经琼脂糖凝胶电泳后随机挑选阳性样本进行测序验证。比较并分析在基因组DNA及RNA/cDNA水平对JAK2V617F突变检测结果的差异。
在110例MPN患者检测样本中,基因组DNA JAK2V617F共检测出突变74例。而JAK2V617F突变发生率在PV、ET、PMF患者中分别为70.45%(31/44例),70.9%(39/55例)和36.4%(4/11例),而在MPN患者总样本数中的发生率为67.3%(74/110例)。健康对照组样本骨髓细胞基因组DNA中未发现此阳性突变。经统计学分析,JAK2V617F突变阳性PV患者的年龄为61.8±12.4岁,外周血WBC为17.9±12.0(×109/L),PLT为466.7±322.8(×109/L),分别高于野生型患者的54.8±14.8岁,8.2±3.0(×109/L)和215.9±101.5(×109/L);JAK2V617F突变阳性ET患者的年龄为61.2±12.5岁,WBC为15.2±5.8(×109/L),Hb为125.8±35.2(g/L),分别高于野生型患者的49.0±16.3岁,8.4±3.4(×109/L)和98.3±31.5(g/L)； JAK2V617F突变阳性PMF患者的Hb为99.3±22.5(g/L),高于野生型患者的64.7±14.5(g/L)(以上各P0.05)。
110例MPN患者骨髓细胞在cDNA水平JAK2V617F突变阳性检出27例,2例健康对照骨髓细胞样本中均未检测出JAK2V617F突变。
JAK2V617F突变阳性的BCR/ABL阴性MPN患者与JAK2V617F突变阴性患者在发病年龄、外周血细胞计数上存在差异。
cDNA检出JAK2V617F突变阳性率低于基因组DNA JAK2V617F检出率。
第二部份：JAK2V617F、JAK2exon12及MPL在MPN的突变情况。
使用BCR/ABL阴性MPN患者的骨髓细胞,从基因组DNA水平联合检测JAK2V617F、JAK2exon12(K539L、N542-E543del、F537-K539delinsL、H538QK539L)及MPL (W515L、W515K、W515R、W515A、 S505N)共10个位点的突变情况。
重新收集100例BCR/ABL阴性MPN患者的骨髓细胞,使用之前2例健康人骨髓细胞作为对照组,提取各样本基因组DNA并针对JAK2V617F、JAK2exon12(K539L、N542-E543del、F537-K539delinsL、 H538QK539L)、MPL(W515L、W515K、W515R、W515A、S505N)共10个突变位点设计基因组DNA野生及突变型引物,采用等位基因特异性PCR法进行扩增后经琼脂糖凝胶电泳分析。挑选出突变阳性样本再次用野生型引物PCR扩增后,用柱式胶回收试剂盒进行胶回收,回收产物直接送公司测序后验证并分析JAK2V617F、JAK2exon12及MPL突变情况。
在100例MPN患者中存在基因突变的患者共81例,其中JAK2V617F突变检测出有78例,JAK2exon12突变14例,MPL突变9例。在以上检测出突变的患者中,同时有JAK2V617F与AK2exon12两种突变的患者10例；同时有JAK2V617F与MPL两种突变的患者6例；而JAK2V617F、JAK2exonl2与MPL三者同时存在突变的患者为2例。2例健康对照组骨髓细胞样本未检测出上述突变。
JAK2exon12及MPL突变在JAK2V617F突变阴性的BCR/ABL阴性MPN患者中少见,而在JAK2V617F突变阳性的患者中发生率相对较高。甚至发现有JAK2V617F、JAK2exon12及MPL三者同时存在突变的患者。
【学位授予单位】：湖南师范大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2013【分类号】：R733.3
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