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【求助】ABI7500相对定量可以做标准曲线吗
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这个帖子发布于6年零161天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
请教下各位做荧光定量的前辈们~刚开始接触，对各位前辈来说可能问题很幼稚，请见谅，希望前辈们能不吝赐教，实在是觉得一头雾水啊~~先谢谢大家了
我现在要用SYBR GREEN I 做某基因A表达量的相对变化（用特定条件处理使该基因表达量增多or减少）的实验，以前师兄们用的是icycler的荧光PCR仪做出来的是标准曲线和溶解曲线，现在我用的是ABI7500，刚开始接触从园内看了很多这方面的资料了，现在对一些概念还是有些模糊，请大家看看我的理解对不对哈~~~ (1)荧光定量分相对定量和绝对定量，对于绝对定量在ABI上选择AQ是可以直接做标准曲线的，而相对定量，我看到软件SDS2.0包括中文说明书上有两种assay即ddct plate和ddct study，我想问如果我需要做标准曲线，选择这两种assay或者说ddct plate可以直接得到标准曲线吗？我隐约从一些资料上觉得是不是相对定量有两种方法
标准曲线法和ddct计算法？我被整晕了 ，请明白的人指点一下呀~~（2）如果是用ddct
plate ，为什么我设置后在instrument 内 add dissociation
一直显示灰色呢，我看有帖说是要先在assay内新建一个dissociation，我建了以后，还是灰色的，可是再选择AQ里却是可以添加的，这个到底是怎么回事呢？要做相对定量怎么添加 dissociation 呢？ 真的好困惑呀
看到好多贴有问的了，就是没看到该怎么办，请会的前辈们指点下呀~（3）我是用染料SYBR Green I 做的，需要加内参GAPDH，标准品是按比例稀释的，那内参呢？也是当做一个样品按比例稀释，三孔重复那样的吗？我看到园内下的7500中文说明书上只是设了三个孔的内参，这个浓度是怎么确定的呢？说明书上介绍的还要有阳性对照，请问阳性对照是什么呢？浓度时怎么确定的呢？ 想的脑袋大了~~ 恳请大家帮忙啊，没有人指点，说简单也简单说复杂也复杂的实验，到我这里真的很很很复杂了呀~~怎么办怎么办 时刻在线等待~~最近被这些问题整的心里特别着急
我这快崩盘了
再次恳请明白ABI7500 SYBR GREEN I 相对定量实验的前辈们赐教啊~~
不知道邀请谁？试试他们
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再加两问哈~~ （4） 考虑到绝对定量可以加上dissociation，我想我是不是可以选用绝对定量做呢，是不是可以通过导出Ct值，自己结合标准品的稀释倍数做标准曲线呢？这和相对定量是不是一样的呢？这样是不是就不用同时加内参了呢？或者像icycler一样，把内参作为一个标准品，倍比稀释得到一个标准曲线，在和其他标准品归一处理数值得到其他标准品的标准曲线，这样可不可以呢？（5）有没有前辈留意过用ABI7500 SYBR GREEN I 做相对定量发中外文文章的时候，都需要什么result呢？标准曲线？溶解曲线？其他？
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还是 没有前辈指点下吗？
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我已经明白了 O(∩_∩)O~
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关于丁香园肠道病毒EV71核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)
来源:北京索奥生物医药科技有限公司
浏览人数: 5304
【名 称】&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
中文名：肠道病毒71型(EV71)核酸扩增检测试剂盒
英文名：human enterovirus type 71 (EV71) Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction (PCR) Diagnostic Kit
汉语拼音: chang dao bing du 71 xing &he suan kuo zeng jian ce shi ji he
本试剂盒适用于检测疑似患者粪便、咽拭子标本、疱疹液或脑脊液等标本中肠道病毒71型(EV71)mRNA，适用于肠道病毒71型感染引起的手足口病的辅助诊断。其检测结果仅供参考。
本试剂盒用Trizol提取肠道病毒71型(EV71)mRNA，经过逆转录作用生成cDNA，用一对肠道病毒71型(EV71)特异性引物结合一条特异性荧光探针，配以FQ-Buffer(内含Mg2+、Tris-HCl等)、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，通过一步PCR-荧光探针体外扩增法对肠道病毒71型(EV71) RNA进行扩增，从而达到快速实时定量检测之目的。
名&&&&& 称
数&&&&& 量
规&&&&& 格
EV71 PCR MIX
EV71阳性质控品
100μl/管(1×107Copies/ml)
阴性质控品
2000μl/管
备注：Trizol等另行配备
【标本采集】
1. 适用标本类型：疑似病人粪便、咽拭子标本、疱疹液、脑脊液或病毒分离培养物标本等
2. 标本采集：&&
咽拭子标本：采集病人发病3日内的咽拭子标本，用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3~5ml保存液（维持液或生理盐水）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密闭送检。
疱疹液：用75%的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3~5ml保存液（维持液或生理盐水）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。
脑脊液标本：出现神经系统症状后3天内，采集量为1.0~2.0ml。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中。密闭送检测。
粪便：用灭菌捻拭子拭取粪便或腹泻物置入无菌玻璃管（含0.4ml 灭菌生理盐水），用无菌棉球将试管塞紧后，密闭送检。
【保存和运输】上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过6个月，标本运送应采用0℃冰壶，采集标本应立即（12h内）送达实验室。
【适用仪器】主要包括ABI GeneAmp PCR System7700、ABI GeneAmp PCR System7500, ABI PRISM 7300, LightCycler等，LightCycler等毛细管的仪器，MJ Opticon系列或取得资格认证的定量PCR仪。
【使用方法】
1．RNA提取
1.1样品处理
取50ul样品(或阴性质控品)加入150 ul Trizol reagents（RNA提取液）充分震荡，室温放置10min。
1.2.加入100ul氯仿，用力震荡15s，室温静置5min， 4℃ 12,000rpm离心10min。
1.3.小心将上层水相转移到干净离心管中，加等体积异丙醇，充分混匀，12,000rpm离心10min。
1.4.弃上清，加入500 ul 75%的DEPC乙醇，充分混匀，12,000rpm离心10min，小心吸去大部分乙醇。
1.5.将提取管敞口在室温空气中干燥5min待乙醇挥发干净，用20&l DEPC H2O溶解沉淀。
EV71阳性质控品：直接取3μl进行PCR扩增。
2．PCR扩增
从试剂盒中取出EV71 -PCR MIX、酶反应系，室温融化并振荡混匀后，10,000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N（N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照），每个测试反应体系配制如下表：
EV71 -PCR MIX
计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净0.2ml离心管中，充分混匀，10,000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入22μl，向每管中加入处理后样品(提取RNA)或EV71 -阳性质控品和阴性质控品3μl，10,000rpm瞬时离心10秒。将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，按对应顺序设置阴性质控品，阳性质控品以及未知标本，并设置样品名称、标记荧光基团种类(报告基团FAM、猝灭基团TAMRA)和循环条件:
ABI PRISM 7700，ABI PRISM5700,ABI GeneAmp 7000 (需要剪掉反应盖)，ABI PRISM(使用8联管)，MJ Opticon(使用8联管)等使用薄壁管的仪器:循环条件: 30℃→5min，42℃→45分钟，后93℃→2分钟，后93℃ 30秒→55℃ 45秒， 40个循环。
LightCycler等使用毛细管的仪器: 循环条件: 30℃→5min，42℃→45分钟，93℃→2分钟，后93℃ 5秒→58℃ 45秒，共40个循环。
3. 结果分析判定
Ct 值小于37个循环的为阳性；Ct 值在37-40个循环之间，为灰区，需要进行重复试验。重复试验之后，如果Ct 值仍然在37-40个循环之间，判断为阳性，没有荧光值增长为阴性(&5×102Copies)。
【质控标准】
阴性质控品：全部阴性
EV71 -阳性标准品：阳性对照的 Ct 值均应小于 30.0，且呈标准S型扩增曲线。
以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效，全部试验应重新进行。
【注意事项】
初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书操作进行。
所有使用的离心管应高压灭菌(推荐使用，而且必须不含RNA酶。
PCR操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR扩增区等)，防止实验室污染。
试剂盒里不同组分不能混用。每盒试剂请于3 次内使用完毕。
所有试剂及待检标本应看作是传染物质。
【规格】40份/盒。
【贮藏及有效期】试剂盒应-20℃闭光保存，避免反复冻融。有效期10个月。
【生产企业】&&&&& 公司名称：北京索奥生物技术有限公司
免费客户服务电话: 800-706-0910电子邮箱：
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