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果蔬维生素C含量的测定及分析
维生素C是人类营养中最重要的维生素之一，缺少它时会产生坏血病，因此又称为抗坏血酸（ascorbic acid）。它对物质代谢的调节具有重要的作用。近年来，发现它还有增强机体对肿瘤的抵抗力，并具有化学致癌物的阻断作用。维生素C主要存在于新鲜水果及蔬菜中。水果中以猕猴桃含量最多，在柠檬、桔子和橙子中含量也非常丰富；蔬菜以辣椒中的含量最丰富，在番茄、甘蓝、萝卜、青菜中含量也十分丰富，野生植物以刺梨中的含量最丰富，每100克中含2800毫克，有“维生素C王"之称。维生素C为无色晶体，味酸，溶于水及乙醇，不耐热，在碱性溶液中极不稳定，日光照射后易被氧化破坏，有微量铜、铁等重金属离子存在时更易氧化分解，干燥条件下较为稳定。故维生素C制剂应放在干燥、低温和避光处保存；在烹调蔬菜时，不宜烧煮过度并应避免接触碱和铜器。维生素C具有很强的还原性。它可分为还原性和脱氢型。还原型抗坏血酸能还原染料 2,6-二氯酚靛酚（DCPIP），本身则氧化为脱氢型。在酸性溶液中，2,6-二氯酚靛酚呈红色，还原后变为无色。因此，当用此染料滴定含有维生素C的酸性溶液时，维生素C尚未全部被氧化前，则滴下的染料立即被还原成无色。一旦溶液中的维生素C已全部被氧化时，则滴下的染料立即使溶液变成粉红色。所以，当溶液从无色变成微红色时即表示溶液中的维生素C刚刚全部被氧化，此时即为滴定终点。如无其它杂质干扰，样品提取液所还原的标准染料量与样品中所含还原型抗坏血酸量成正比。实验试剂1. 2%草酸溶液: 草酸2g溶于100mL蒸馏水中。2. 1%草酸溶液: 草酸1g溶于100mL蒸馏水中。3. 标准抗坏血酸溶液（1mg/mL）: 准确称取100mg纯抗坏血酸（应为洁白色，如变为黄色则不能用）溶于1%草酸溶液中，并稀释至100mL，贮于棕色瓶中，冷藏。最好临用前配制。4. 0.1% 2,6-二氯酚靛酚溶液: 250mg 2,6-二氯酚靛酚溶于150mL含有52mg NaHCO3的热水中，冷却后加水稀释至250mL，贮于棕色瓶中冷藏（4℃）约可保存一周。每次临用时，以标准抗坏血酸溶液标定。锚点实验设备1. 锥形瓶100mL(′2)2. 吸量管10mL(′1)3. 容量瓶100mL(′1)，250mL(′1)4. 微量滴定管5mL(′1)5. 研钵6. 漏斗7. 纱布实验材料自选材料实验步骤1. 提取水洗干净整株新鲜蔬菜或整个新鲜水果，用纱布或吸水纸吸干表面水分。然后称取 20g，加入20mL 2%草酸，用研钵研磨，四层纱布过滤，滤液备用。纱布可用少量2%草酸洗几次，合并滤液，滤液总体积定容至50mL。2. 标准液滴定准确吸取标准抗坏血酸溶液1mL置100mL锥形瓶中，加9mL 1%草酸，用微量滴定管以0.1% 2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至淡红色，并保持15s不褪色，即达终点。由所用染料的体积计算出1mL染料相当于多少毫克抗坏血酸（取10mL 1%草酸作空白对照，按以上方法滴定）。3. 样品滴定准确吸取滤液两份，每份10mL, 分别放入2个锥形瓶内，滴定方法同前。另取10mL 1%草酸作空白对照滴定。4. 计算 式中：VA为滴定样品所耗用的染料的平均毫升数；VB为滴定空白对照所耗用的染料的平均毫升数；C为样品提取液的总毫升数；D为滴定时所取的样品提取液毫升数；T为1mL染料能氧化抗坏血酸毫克数（由操作二计算出）；W为待测样品的重量（g）。注意事项1. 某些水果、蔬菜（如橘子、西红柿等）浆状物泡沫太多，可加数滴丁醇或辛醇。2. 整个操作过程要迅速，防止还原型抗坏血酸被氧化。滴定过程一般不超过2min。滴定所用的染料不应小于1mL或多于4mL，如果样品含维生素C太高或太低时，可酌情增减样液用量或改变提取液稀释度。3. 提取的浆状物如不易过滤，亦可离心，留取上清液进行滴定。
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维生素C测定
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测定就是对维生素C的测定。在测定维生素C的国标方法中，荧光法为测定食物中维生素C含量的第一标准方法，2、4－二硝基苯肼法作为第二法。
维生素C测定一荧光法
1．原理样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化成脱氢型抗坏血酸后，与邻苯二胺（OPDA）反应生成具有荧光的喹喔啉（quinoxaline）,其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测定食物中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与OPDA反应，以此排除样品中荧光杂质所产生的干扰。本方法的最小检出限为0.022g/ml。
2．适用范围GB12392-90本方法适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定
3．仪器3．1．实验室常用设备。3．2．荧光分光光度计或具有350nm及430nm波长的荧光计。3．3．打碎机。
4．试剂本实验用水均为蒸馏水，试剂不加说明均为分析纯试剂。（1）偏磷酸－乙酸液：称取15g偏磷酸，加入40ml冰乙酸及250ml水，搅拌，放置过夜使之逐渐溶解，加水至500ml。4℃冰箱可保存7～10天。（2）0.15mol/L硫酸：取10ml硫酸，小心加入水中，再加水稀释至1200ml。（3）偏磷酸－乙酸－硫酸液：以0.15mol/L硫酸液为稀释液，其余同4.1.配制。（4）50%乙酸钠溶液：称取500g乙酸钠（CH3COONa·3H2O），加水至1000ml。（5）硼酸-乙酸钠溶液：称取3g硼酸，溶于100ml乙酸钠溶液（4.4）中。临用前配制。（6）邻苯二胺溶液：称取20mg邻苯二胺，于临用前用水稀释至100ml。（7）0.04%百里酚蓝指示剂溶液：称取0.1g百里酚蓝，加0.02mol/L氢氧化钠溶液，在玻璃研钵中研磨至溶解，氢氧化钠的用量约为10.75ml，磨溶后用水稀释至250ml。变色范围：pH=1.2红色pH=2.8黄色pH&4.0兰色（8）活性炭的活化：加200g炭粉于1L1+9盐酸中，加热回流1~2h，过滤，用水洗至滤液中无铁离子为止，置于110~120℃烘箱中干燥，备用。（9）标准抗坏血酸标准溶液（1mg/ml）：准确称取50mg抗坏血酸，用溶液（4.1）溶于50ml容量瓶中，并稀释至刻度。抗坏血酸标准使用液（100μg/ml）:取10ml抗坏血酸标准液，用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100ml。定容前试pH值，如其pH&2.2时，则应用溶液（4.3）稀释。标准曲线的制备：取下述&标准&溶液（抗坏血酸含量10μg/ml）0.5、1.0、1.5和2.0ml标准系列，取双份分别置于10ml带盖试管中，再用水补充至2.0ml。
5.操作步骤5.1样品制备全部实验过程应避光。称取100g鲜样，加100g偏磷酸-乙酸溶液，倒入打碎机内打成匀浆，用百里酚蓝指示剂调试匀浆酸碱度。如呈红色，即可用偏磷酸-乙酸溶液稀释，若呈黄色或兰色，则用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀释，使其pH为1.2。匀浆的取量需根据样品中抗坏血酸的含量而定。当样品液含量在40~100μg/ml之间，一般取20g匀浆，用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100ml，过滤，滤液备用。5.2氧化处理：分别取样品滤液及标准使用液各100ml于带盖三角瓶中，加2g活性炭，用力振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤液，分别收集其余全部滤液，即样品氧化液和标准氧化液，待测定。5.3各取5ml标准氧化液于2个50ml容量瓶中，分别标明&标准&及&标准空白&。5.4各取5ml样品氧化液于2个50ml容量瓶中，分别标明&样品&及&样品空白&。5.5于&标准空白&及&样品空白&溶液中各加5ml硼酸-乙酸钠溶液，混合摇动15min，用水稀释至50ml，在4℃冰箱中放置2h，取出备用。5.6于&样品&及&标准&溶液中各加入5ml50%乙酸钠溶液，用水稀释至50ml，备用。5.7荧光反应取&标准空白&溶液，&样品空白&溶液及（5.6）中&样品&溶液各2ml，分别置于10ml带盖试管中。在暗室中迅速向各管中加入5ml邻苯二胺，振摇混合，在室温下反应35min，用激发光波长338nm、发射光波长420nm测定荧光强度。标准系列荧光强度分别减去标准空白荧光强度为纵坐标，对应的抗坏血酸含量为横坐标，绘制标准曲线或进行相关计算，其直线回归方程供计算时使用。
6.计算X=（c×V/m）×F×(100/1000)式中：X-----样品中抗坏血酸及脱氢抗坏血酸总含量，mg/100g；c------由标准曲线查得或由回归方程算得样品溶液浓度，μg/ml；m-----试样质量，g；F------样品溶液的稀释倍数；V------荧光反应所用试样体积，ml。例：测定每一制备溶液的荧光强度。用标准溶液每ml含2.5μg、5.0μg、7.5μg及10.0μg，各标准浓度管读数减去相应的标准空白读数的各平均值做标准曲线。由样品液读数减去样品液空白读数之值，从标准曲线上查得相应的抗坏血酸（μg/ml），按取样量及稀释率计算样品中抗坏血酸的含量。如：取制备好的辣椒样品2.138g，稀释到100ml，氧化后分别取10ml滤液稀释到50ml样品读数为23.34，样品空白读数为3.188，样品读数减去样品空白读数为20.152，查荧光标准曲线相当标准抗坏血酸的2.23μg。2.23×100×50×100------------------------=52（mg/100g）2.138×10×1000
7.注意事项
7.1大多数植物组织内含有一种能破坏抗坏血酸的氧化酶，因此，抗坏血酸的测定应采用新鲜样品并尽快用偏磷酸-醋酸提取液将样品制成匀浆以保存维生素C。
7.2某些果胶含量高的样品不易过滤，可采用抽滤的方法，也可先离心，再取上清液过滤。
7.3活性炭可将抗坏血酸氧化为脱氢抗坏血酸，但它也有吸附抗坏血酸的作用，故活性炭用量应适当与准确，所以，应用天平称量。我们的实验结果证明，用2g活性炭能使测定样品中还原型抗坏血酸完全氧化为脱氢型，其吸附影响不明显。
维生素C测定二2，4-二硝基苯肼法
1．原理总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸。样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，再与2，4-二硝基苯肼作用生成红色脎，脎的含量与总抗坏血酸含量成正比，进行比色测定。
2．适用范围GB12392-90本方法适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定。
3.仪器3.1恒温箱：37±0.5℃3.2可见-紫外分光光度计3.3打碎机
4．试剂本实验用水均为蒸馏水，试剂纯度均为分析纯。4.14.5mol/L硫酸：谨慎地加250ml硫酸（比重1.84）于700ml水中，冷却后用水稀释至1000ml。4.285%硫酸：谨慎地加900ml硫酸（比重1.84）于100ml水中。4.32%2，4-二硝基苯肼溶液：溶解2g2，4-二硝基苯肼于100ml4.5mol/L硫酸内，过滤。不用时存于冰箱内，每次用前必须过滤。4.42%草酸溶液：溶解20g草酸于700ml水中，稀释至1000ml。4.51%草酸溶液：稀释500ml2%草酸溶液到1000ml。4.61%硫脲溶液：溶解5g硫脲于500ml1%草酸溶液中。4.72%硫脲溶液：溶解10g硫脲于500ml1%草酸溶液中。4.81mol/L盐酸：取100ml盐酸，加入水中，并稀释至1200ml。4.9活性炭：将100g活性炭加到750ml1mol/L盐酸中，回流1~2h，过滤，用水洗数次，至滤液中无铁离子（Fe3+）为止，然后置于110℃烘箱中烘干。4.10标准（1）抗坏血酸标准溶液（1mg/ml）：溶解100mg纯抗坏血酸于100ml1%草酸溶液中。（2）标准曲线绘制加1g活性炭于50ml标准溶液中，摇动1min，过滤。取10ml滤液放入500ml容量瓶中，加5.0g硫脲，用1%草酸溶液稀释至刻度。抗坏血酸浓度为20μg/ml。取5，10，20，25，40，50，60ml稀释液，分别放入7个100ml容量瓶中，用1%硫脲溶液稀释至刻度，使最后稀释液中抗坏血酸的浓度分别为1，2，4，5，8，10及12μg/ml。按样品测定步骤形成脎并比色。以吸光值为纵坐标，以抗坏血酸浓度（μg/ml）为横坐标绘制标准曲线。
5.操作步骤5.1样品制备全部实验过程应避光。5.1.1鲜样制备：称100g鲜样和100g2%草酸溶液，倒入打碎机中打成匀浆，取10-40g匀浆（含1-2mg抗坏血酸）倒入100ml容量瓶中，用1%草酸溶液稀释至刻度，混匀。5.1.2干样制备：称1-4g干样（含1-2mg抗坏血酸）放入乳钵内，加入1%草酸溶液磨成匀浆，倒入100ml容量瓶中，用1%草酸溶液稀释至刻度，混匀。5.1.3将上述两液过滤，滤液备用。不易过滤的样品可用离心机沉淀后，倾出上清液，过滤，备用。5.2氧化处理：取25ml上述滤液，加入0.5g活性炭，振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤液。取10ml此氧化提取液，加入10ml2%硫脲溶液，混匀。5.3呈色反应5.3.1于三个试管中各加入4ml稀释液。一个试管作为空白，在其余试管中加入1.0ml2%2，4-二硝基苯肼溶液，将所有试管放入37±0.5℃恒温箱或水浴中，保温3h。5.3.23h后取出，除空白管外，将所有试管放入冰水中。空白管取出后使其冷到室温，然后加入1.0ml2%2，4-二硝基苯肼溶液，在室温中放置10~15min后放入冰水内。其余步骤同样品。5.3.385%硫酸处理：当试管放入冰水后，向每一试管中加入5ml85%硫酸，滴加时间至少需要1min，需边加边摇动试管。将试管自冰水中取出，在室温放置30min后比色。5.3.4比色：用1cm比色杯，以空白液调零点，于500nm波长测吸光值。
6.计算同荧光法。
7.注意事项
7.1大多数植物组织内含有一种能破坏抗坏血酸的氧化酶，因此，抗坏血酸的测定应采用新鲜样品并尽快用2%草酸溶液制成匀浆以保存维生素C。
7.2若溶液中含有糖，硫酸加得太快，溶解热会使溶液变黑。
7.3试管自冰水中取出后，颜色会继续变深，所以，加入硫酸后30分钟应准时比色。小木虫 --- 600万学术达人喜爱的学术科研平台
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