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高通量测序生物信息学分析(内部极品资料,初学者必看)
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高通量测序生物信息学分析(内部极品资料,初学者必看)
官方公共微信高通量测序文库的构建方法及其应用的制作方法
专利名称高通量测序文库的构建方法及其应用的制作方法
技术领域本发明涉及生物技术领域。具体地，涉及DNA甲基化检测技术，特别是涉及基因组特定区域的甲基化检测。更具体地，本发明提供了一种构建高通量测序文库的方法、一种确定样本的基因组特定区域的甲基化信息的方法、一种用于确定样本的基因组特定区域的甲基化信息的装置以及一种用于构建样本的基因组特定区域高通量测序文库的试剂盒。
背景技术DNA甲基化是研究最为深入的表观遗传学机制，DNA甲基化在维持正常细胞功能、抑制寄生DNA成分对基因组完整性的损害、染色质结构修饰、X染色体失活、基因组印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。然而，目前对基因组特定区域如启动子区域、CpG岛区域、CpG岛外区域以及印记基因区域的甲基化检测的研究，仍有待改进。
本发明旨在解决现有技术问题的至少之一。由此，为了代表性检测基因组上特定区域的甲基化信息，本发明提供了高通量测序文库的构建方法及其应用。根据本发明的一个方面，本发明提供了一种构建高通量测序文库的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤:将基因组DNA片段化，以便获得DNA片段；将所述DNA片段进行末端修复，以便获得经过末端修复的DNA片段；在所述经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A，以便获得具有粘性末端A的DNA片段；将所述具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连，以便获得连接产物；利用特异性探针对所述连接产物进行杂交捕获，以便获得目的片段；将所述目的片段进行重亚硫酸盐处理，以便将所述目的片段中非甲基化的胞嘧啶转换为尿 嘧啶，获得经过转换的目的片段；将所述经过转换的目的片段进行PCR扩增，以便获得扩增产物；以及分离纯化所述扩增产物，所述扩增产物构成所述高通量测序文库。利用根据本发明实施例的构建高通量测序文库的方法，能够有效地构建基因组DNA样品的高通量测序文库，特别是能够有效地构建基因组DNA样品的已知甲基化位点的特定区域的高通量测序文库，从而能够有效、充分地应用于高通量测序技术，通过对文库的测序，然后基于对测序结果的数据分析，能够有效地获得基因组特定区域的甲基化位点信息，实现对基因组DNA样品的基因组特定区域的甲基化检测。根据本发明的另一方面，本发明提供了一种确定样本的基因组特定区域的甲基化信息的方法。根据本发明的实施例，该方法包括下列步骤:根据前面所述构建高通量测序文库的方法，构建所述样本的基因组特定区域的高通量测序文库；对所述样本的基因组特定区域的高通量测序文库进行测序，以便得到测序结果；以及对所述测序结果进行数据分析，以便确定所述样本的基因组特定区域的甲基化信息。利用根据本发明实施例的确定样本的基因组特定区域的甲基化信息的方法，能够准确地确定样本的基因组特定区域的甲基化信息，从而实现对样本的基因组特定区域的甲基化检测。根据本发明的再一方面，本发明提供了一种用于确定样本的基因组特定区域的甲基化信息的装置。根据本发明的实施例，该装置包括:文库制备单元，所述文库制备单元用于制备样本的基因组特定区域的高通量测序文库，所述文库制备单元内设置有特异性探针；测序单元，所述测序单元与所述文库制备单元相连，并且从所述文库制备单元接收所述样本的基因组特定区域的高通量测序文库，以便用于对所述样本的基因组特定区域的高通量测序文库进行测序，获得测序结果；以及数据分析单元，所述数据分析单元与所述测序单元相连，并且从所述测序单元接收所述测序结果，以便对所述测序结果进行数据分析，确定所述样本的基因组特定区域的甲基化信息。利用根据本发明实施例的用于确定样本的基因组特定区域的甲基化信息的装置，能够方便准确地确定样本的基因组特定区域的甲基化信息，可以应用于多种针对基因组特定区域的甲基化的研究。根据本发明的又一方面，本发明提供了一种用于构建样本的基因组特定区域的高通量测序文库的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括:特异性探针，所述特异性探针是对已知甲基化位点特异性的。利用根据本发明实施例的用于构建样本的基因组特定区域的高通量测序文库的试剂盒，能够方便有效地构建样本的基因组特定区域的高通量测序文库。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中:
图1:显示了根据本发明一个实施例的构建高通量测序文库的方法的流程示意图；图2:显示了根据本发明一个实施例的方法确定基因组特定区域甲基化信息时，在不同覆盖深度下(覆盖深度& I及覆盖深度& 5)，每条染色质上的捕获区域占探针靶区域的百分比图。图3:显示了根据本发明一个实施例的方法确定基因组特定区域甲基化信息时，在不同覆盖深度下，各条染色质中检测到甲基化信息的启动子占该染色质的总启动子的百分比图。图4:显示了根据本发明一个实施例的方法确定基因组特定区域甲基化信息时，基因组上启动子区域、CpG岛、CpG岛外(在本文中指为CGI shore)及印记基因区域的甲基化水平分布结果。(a)显示了根据本发明一个实施例的确定的样本的基因组CpG岛、CGI shore区域的甲基化水平分布图。(b)显示了根据本发明一个实施例的确定的样本的基因组启动子区域的甲基化水平分布图。
(c)显示了样本的基因组特定区域的原始分布和根据本发明一个实施例的确定的样本的基因组特定区域的高通量测序文库的reads分布及启动子、CpG岛区域的甲基化水平分布图。图5:显示了根据本发明一个实施例的用于确定样本的基因组特定区域的甲基化信息的装置的示意图。
具体实施例方式下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。构建高通量测序文库的方法根据本发明的一个方面，本发明提供了一种构建高通量测序文库的方法。参考图1，根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤:首先，将基因组DNA片段化，以便获得DNA片段。在本发明中所使用的术语“DNA”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA。本领域的技术人员可以理解，基因组DNA的来源不受特别限制，可以从任何可能的途径获得，可以是通过市售直接获得，也可以是从其他实验室直接获取，还可以是直接从样本中提取。根据本发明的实施例，可以从样本中提取获得基因组DNA。根据本发明的一个实施例，构建高通量测序文库的方法可以进一步包括从样本中提取基因组DNA的步骤。根据本发明的一些具体示例，样本可以来源于哺乳动物、植物、和微生物的至少一种。根据本发明的一些实施例，哺乳动物可以为人和小鼠的至少一种。根据本发明的一个实施例，基因组DNA可以为人类全血基因组DNA，优选为外周血单核细胞基因组DNA。发明人发现，当采用YH cell基因组DNA构建高通量测序文库时，从样本中提取基因组DNA的操作方便易行，且获得的DNA质量好、甲基化信息完整，由其构建的样本的基因组特定区域的高通量测序文库能够方便地应用于高通量测序技术，从而基于对测序结果的数据分析就能方便有效地获得样本的基因组特定区域的甲基化信息。根据本发明的实施例，基因组DNA的量不受特别限制，根据本发明的具体示例，优选基因组DNA的量为2 μ g。发明人惊奇地发现，当基因组DNA的量为2μ g时，根据本发明实施例的构建高通量测序文库的方法构建的样本的基因组特定区域的高通量测序文库，能够非常方便地应用于高通量测序技术，如Solexa测序技术，且文库测序结果准确，可重复性好，包含的特定区域的甲基化信息准确、甲基化位点覆盖率高。其次，将DNA片段进行末端修复，以便获得经过末端修复的DNA片段。根据本发明的一个实施例，在将DNA片段进行末端修复前，可以进一步包括纯化DNA片段的步骤，由此，使得后续的末端修复易于进行。根据本发明的实施例，将DNA片段进行末端修复可以利用Klenow片段、T4 DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶进行，其中，所述Klenow片段具有5’ 一3’聚合酶活性和3’ — 5’聚合酶活性,但缺少5’ — 3’外切酶活性。由此,能够方便准确地对DNA片段进行末端修复。根据本发明的实施例，还可以进一步包括对经过末端修复的DNA片段进行纯化的步骤，由此能够方便地进行后续处理。接下来， 在经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A，以便获得具有粘性末端A的DNA片段。根据本发明的一个实施例，可以利用Klenow(3’ -5’ exo-)，即具有3’ 一5’外切酶活性的Klenow，在经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A。由此，能够方便准确地将碱基A添加到经过末端修复的DNA片段的3’末端。根据本发明的实施例，还可以进一步包括对具有粘性末端A的DNA片段进行纯化的步骤，由此能够方便地进行后续处理。接着，将具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连，以便获得连接产物。本发明中所使用的术语“甲基化接头”是指这样的一种接头，在其核苷酸序列中，所有C位点均被甲基化修饰。根据本发明的一个实施例，在将具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连前，可以进一步包括对常规测序所使用的接头进行甲基化的步骤。由此，能够有效避免测序接头对后续重亚硫酸盐处理等操作的干扰。本领域的技术人员可以理解，对接头进行甲基化的方法不受特别限制，可以利用本领域已知的任何方法对测序接头进行甲基化。根据本发明 的一些实施例，甲基化接头中还可以进一步包含标签，由此可以方便地同时构建多种样本的基因组特定区域的高通量测序文库，并能够有效地应用于高通量测序平台，从而在对测序结果进行数据分析后，基于标签的序列信息，就能够准确地区分多种样本的基因组特定区域的高通量测序文库的序列信息以及样本的基因组特定区域的甲基化信息，由此，能够充分地利用高通量测序平台，且能够节省时间、降低成本。根据本发明的一个实施例，将具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连是利用T4DNA连接酶进行的，由此可以方便地获得连接产物。根据本发明的实施例，还可以进一步包括对连接产物进行纯化的步骤，由此能够方便地进行后续处理。然后，利用特异性探针对所述连接产物进行杂交捕获，以便获得目的片段。根据本发明的实施例，这里的术语“特异性探针”是指探针是对已知甲基化位点特异性的。根据本发明的具体示例，特异性探针是基于采用人类基因组作为参考序列，并且采用基因组上已知具有甲基化位点的特定基因区域作为靶序列而设计的，具体地，已知具有甲基化位点的基因区域包括选自启动子区域、CpG岛区域、CpG岛外区域以及印记基因区域的至少一种，由此，利用根据本发明实施例的特异性探针进行杂交捕获，能够有效地捕获样本中与靶序列互补的序列，即样本中已知具有甲基化位点的基因区域(在本说明书中，有时也称为“基因组特定区域”)。此外，根据本发明的一个实施例，在杂交捕获前，可以进一步包括利用诸如c0t-lDNA和接头封闭序列的单链寡核苷酸对连接产物(尤其是连接产物的基因组序列中的重复区域)和连接产物上的甲基化接头进行杂交封闭的步骤。发明人惊奇地发现，当使用^t-1DNA和接头封闭序列分别对连接产物(尤其是连接产物的基因组序列中的重复区域)和连接产物上的甲基化接头进行杂交封闭后，能够显著地增强对连接产物的杂交捕获。根据本发明的实施例，Cj-1DNA的使用量不受特别限制，根据具体的示例，优选采用过量的^t-1DNA对连接产物的基因组序列中的重复区域进行杂交封闭。其中，这里所使用的术语“过量”是指qt-lDNA的量远大于待进行杂交捕获的连接产物的量，即采用qt-lDNA的量可以是待进行杂交捕获的连接产物的量的2倍以上。根据本发明的具体示例，优选，采用^t-1DNA的量为待进行杂交捕获的连接产物的量的5倍。根据本发明的一些实施例，采用^t-1DNA的量小于待进行杂交捕获的连接产物的量的5倍，则封闭杂交不彻底，重复序列的非特异性强杂交背景信号干扰强烈，严重影响核酸杂交的效率；而采用^t-1DNA的量大于待进行杂交捕获的连接产物的量的5倍，则过多的^t-1DNA会影响探针与连接产物的结合，同样会影响核酸杂交的效率。由此，采用待进行杂交捕获的连接产物的量的5倍的c0t-lDNA对连接产物的基因组区域重复序列进行杂交封闭，能够方便、有效地进行封闭，以去掉重复序列DNA，从而在后续的核酸杂交过程中，能够有效避免重复序列产生的非特异性强杂交背景信号的干扰，显著提高核酸杂交的效率，增强杂交效果。根据本发明的实施例，接头封闭序列包括选自Blockl和Block2的至少一种，由此，能够有效地对连接产物上的甲基化接头进行封闭。根据本发明的实施例，可以采用Iug的连接产物进行所述杂交捕获，由此能够提高杂交捕获的效率。根据本发明的具体示例，利用特异性探针对所述连接产物进行杂交捕获，可以进一步包括利用链霉素磁珠捕获目的片段，由此，能够高效地捕获目的片段。接下来，将目的片段进行重亚硫酸盐处理，以便将目的片段中非甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶，获得经过转换的目的片段。根据本发明的实施例，在将目的片段进行重亚硫酸盐处理之前，可以进一步包括将目的片段与片段化的λ-DNA混合。发明人发现，通过添加外源DNA ( λ -DNA)，即将目的片段与外源DNA混合，然后进行重亚硫酸盐高效共处理，对目标DNA片段能够起到保护作用，最大限度地降低重亚硫酸盐对微量DNA的破坏，可以进一步提高检测精度，使得较少量的基因组DNA，甚至纳克级，例如50-150ng基因组的甲基化检测成为现实。根据本发明的实施例，片段化的λ-DNA的添加量不受特别限制，根据具体的示例，优选片段化的λ -DNA的量为200-400ng，更优选为200ng。本领域技术人员能够理解，可以通过本领域已知的任意方法制备这些片段化的λ -DNA，例如可以随同前面的DNA片段化处理一起进行制备。此外，将目的片段进行重亚硫酸盐处理，可以通过本领域已知的任何方法进行，根据本发明的具体示例，可以采用商品化的试剂盒进行，优选地采用EZ DNAMe thy lation-Go IdK it
(ZYMO)进行。发明人惊奇地发现，米用 EZ DNA Methylation-GoldKit (ZYMO)对目的片段进行重亚硫酸盐处理时，方便快捷，且处理效果好，目的片段中非甲基化的胞嘧啶能够高效准确地转换为`尿嘧啶，并且利于后续处理。然后，将经过转换的目的片段进行PCR扩增，以便获得扩增产物。根据本发明的实施例，可以使用热启动taq DNA聚合酶对经过转换的目的片段进行PCR扩增。根据本发明的实施例，热启动taq DNA聚合酶的种类不受特别限制，根据本发明的具体示例，热启动taqDNA聚合酶可以为r_taq聚合酶，由此PCR扩增效率高、用时少。最后，分离纯化扩增产物，所得到的扩增产物构成全基因组甲基化高通量测序文库。根据本发明的实施例，分离纯化扩增产物的方法不受特别限制，根据本发明的具体示例，可以通过选自磁珠纯化、纯化柱纯化和2%的琼脂糖凝胶电泳的至少一种进行，优选通过2%的琼脂糖凝胶电泳进行。根据本发明的一些具体示例，高通量测序文库的文库片段长度为300-450bp，由此，高通量测序文库能够方便有效地应用于高通量测序平台如Solexa测序平台，且可重复性好，测序结果真实可靠，包含特异性探针所针对的基因组特定区域的甲基化信息较完整。利用根据本发明实施例的构建高通量测序文库的方法，能够有效地构建样本的基因组特定区域的高通量测序文库，从而能够有效、充分地应用于高通量测序技术，通过对高通量测序文库的测序，然后基于对测序结果的数据分析，就能够有效地获得样本的基因组特定区域的甲基化信息，实现对样本的基因组特定区域的甲基化检测。确定样本的基因组特定区域的甲基化信息的方法和装置
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种确定样本的基因组特定区域的甲基化信息的方法。根据本发明的实施例，该方法包括下列步骤:根据本发明实施例的构建高通量测序文库的方法构建样本的基因组特定区域的高通量测序文库；对该样本的基因组特定区域的高通量测序文库进行测序，以便得到测序结果；以及对测序结果进行数据分析，以便确定样本的基因组特定区域的甲基化信息。根据本发明的一些实施例，测序是利用高通量测序技术进行的。本领域的技术人员可以理解，可以通过本领域已知的任何高通量测序技术进行测序，根据本发明的具体示例，优选地利用Hiseq2000测序仪进行测序。发明人发现,利用Hiseq2000测序仪对样本的基因组特定区域的高通量测序文库进行测序，能够有效地获得测序结果，且测序用时少、效率高、测序结果准确，可重复性好。利用根据本发明实施例的确定样本的基因组特定区域的甲基化信息的方法，能够有效地构建样本的基因组特定区域的高通量测序文库，并且能够通过高通量测序技术如Solexa测序技术实现对文库的准确测序，基于对测序结果的数据分析，就能够准确地确定样本的基因组特定区域的甲基化信息，从而实现对样本的基因组特定区域的甲基化检测，且特定区域的甲基化位点覆盖多，获得甲基化信息完整。根据本发明的再一方面，本发明提供了一种用于确定样本的基因组特定区域的甲基化信息的装置1000。参考图5，根据本发明的一个实施例，该装置包括:文库制备单元100、测序单元200以及数据分析单元300。根据本发明的实施例，文库制备单元100用于制备样本的基因组特定区域的高通量测序文库，其中，文库制备单元100内设置有特异性探针。根据本发明的实施例，特异性探针是对已知甲基化位点特异性的。根据本发明的具体示例，特异性探针是基于采用人类基因组作为参考序列，并且采用基因组上已知具有甲基化位点的特定基因区域作为靶序列而设计的，具体地，已知具有甲基化位点的基因区域包括选自启动子区域、CpG岛区域、CpG岛外区域以及印记基因区域的至少一种，由此，利用根据本发明实施例的特异性探针进行杂交捕获，能够有效地捕获样本中与靶序列互补的序列，即样本中已知具有甲基化位点的基因区域。由此，文库 制备单元100可以适于实施前面所述的高通量测序文库构建方法。测序单元200与文库制备单元100相连，可以从文库制备单元100接收所制备的样本的基因组特定区域的高通量测序文库，并对所接收的样本的基因组特定区域的高通量测序文库进行测序，从而可以获得测序结果。数据分析单元300与测序单元200相连，可以从测序单元200接收所获得的测序结果，并且能够进一步对测序结果进行数据分析，从而基于分析结果确定样本的基因组特定区域的甲基化信息，最终实现对样本的基因组特定区域的甲基化检测。本领域技术人员能够理解的是，可以采用本领域中已知的任何适于进行上述操作的装置作为上述各个单元的组成部件。在本文中所使用的术语“相连”应作广义理解，可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语的具体含义。利用根据本发明实施例的用于确定样本的基因组特定区域的甲基化信息的装置，能够方便准确地确定样本的基因组特定区域的甲基化信息，从而可以应用于多种针对基因组特定区域，如已知甲基化位点的基因组区域的甲基化的研究，例如可以用于对基因组特定区域的甲基化异常进行检测。试剂盒根据本发明的另一方面，本发明提供了一种用于构建样本的基因组特定区域的高通量测序文库的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括:特异性探针，该特异性探针是对已知甲基化位点特异性的。根据本发明的一些具体示例，特异性探针是基于采用人类基因组作为参考序列，并且采用基因组上已知具有甲基化位点的特定基因区域作为靶序列而设计的，具体地，已知具有甲基化位点的基因区域包括选自启动子区域、CpG岛区域、CpG岛外区域以及印记基因区域的至少一种，由此，利用根据本发明实施例的特异性探针进行杂交捕获，能够有效地捕获样本中与靶序列互补的序列，即样本中已知具有甲基化位点的基因区域。本领域的技术人员可以理解，试剂盒中还可以进一步包括构建样本的基因组特定区域的高通量测序文库所需的任何其他组分，在此不再赘述。利用根据本发明实施例的用于构建样本的基因组特定区域的高通量测序文库的试剂盒，能够方便有效地构建样本的基因组特定区域的高通量测序文库。需要说明的是，根据本发明实施例的构建样本的基因组特定区域的高通量测序文库的方法及其应用，是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化工作完成的。下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1:本实施例以2 μ g的人类外周血单核细胞基因组DNA为样本，按照下列步骤实施。
一、基因组DNA片段化:利用C0VariS-S2打断仪，按照下表设置的参数，将样本基因组DNA进行片段化处理，以便获得DNA片段。
处理I~ 负载比(％)| 10
循环/脉冲 200^
处理2 时间(s)O
处理3 时间(s)O
处理4 时间(s)O
将获得的DNA片段进行电泳检测，要求DNA片段主带集中在150_300bp之间，无蛋白、RNA污染。利用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)或磁珠纯化，将检测合格的DNA片段纯化回溶到32 μ I的洗脱缓冲液中，备用。用同样的方法制备200_400ng的片段化的λ -DNA，其中λ -DNA为外源非甲基化的。二、末端修复:I)将上一步获得的DNA片段按照下表在1.5mL的离心管中配制末端修复反应体系:
1.一种构建高通量测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤:
将基因组DNA片段化，以便获得DNA片段；
将所述DNA片段进行末端修复，以便获得经过末端修复的DNA片段；
在所述经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A，以便获得具有粘性末端A的DNA片段；
将所述具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连，以便获得连接产物；
利用特异性探针对所述连接产物进行杂交捕获，以便获得目的片段；
将所述目的片段进行重亚硫酸盐处理，以便将所述目的片段中非甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶，获得经过转换的目的片段；
将所述经过转换的目的片段进行PCR扩增，以便获得扩增产物；以及
分离纯化所述扩增产物，所述扩增产物构成所述高通量测序文库，
任选地，进一步包括从样本中提取基因组DNA的步骤，优选所述样本来源于哺乳动物、植物、和微生物的至少一种，更优选所述哺乳动物为人和小鼠的至少一种，优选所述基因组DNA为人类全血基因组 DNA，更优选所述基因组DNA为外周血单核细胞基因组DNA ；
优选，所述基因组DNA的量为2 μ
任选地，利用covariS-S2打断仪将基因组DNA片段化；
任选地，所述DNA片段的长度为约150-300bp，优选200_300bp ；
任选地，在将所述DNA片段进行末端修复前，进一步包括纯化DNA片段的步骤；
任选地，将所述DNA片段进行末端修复是利用Klenow片段、T4DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶进行的，其中，所述Klenow片段具有5’ 一 3’聚合酶活性和3’ 一 5’聚合酶活性，但缺少5’ 一 3’外切酶活性； 任选地，将所述经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A是利用Klenow (3，-5’ exo_)进行的；
任选地，所述甲基化接头中包含标签；
任选地，将所述具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连前，进一步包括对接头进行甲基化的步骤；
任选地，将所述具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连是利用T4DNA连接酶进行的；
任选地，在获得连接产物后，进一步包括对连接产物进行纯化的步骤；
任选地，所述特异性探针是对已知甲基化位点特异性的，优选所述特异性探针是基于采用人类基因组作为参考序列，并且采用已知具有甲基化位点的基因区域作为靶序列而设计的，可选地，所述已知具有甲基化位点的基因区域包括选自启动子区域、CpG岛区域、CpG岛外区域以及印记基因区域的至少一种；
任选地，在所述杂交捕获前，进一步包括利用^t-1DNA和接头封闭序列分别对所述连接产物和所述连接产物上的甲基化接头进行杂交封闭的步骤，优选采用过量的^t-1DNA对所述连接产物进行杂交封闭，可选地，所述接头封闭序列包括选自Blockl和Block2的至少一种；
任选地，采用I μ g的连接产物进行所述杂交捕获；任选地，利用特异性探针对所述连接产物进行杂交捕获进一步包括利用链霉素磁珠捕获所述目的片段；
任选地，在将所述目的片段进行重亚硫酸盐处理之前，进一步包括将所述目的片段与片段化的λ -DNA混合，优选所述片段化的λ -DNA的量为200-400ng，更优选200ng ；
任选地，将所述目的片段进行重亚硫酸盐处理是采用EZ DNA Methylation-GoldKit (ZYMO)进行的；
任选地，使用热启动taq DNA聚合酶进行所述PCR扩增；
任选地，分离纯化所述扩增产物是通过选自磁珠纯化、纯化柱纯化和2%的琼脂糖凝胶电泳的至少一种进行的，优选通过2%的琼脂糖凝胶电泳进行；
任选地，所述高通量测序文库的文库片段长度为300-450bp。
2.一种确定样本的基因组特定区域的甲基化信息的方法，其特征在于，包括下列步骤:
根据权利要求1所述的方法构建所述样本的基因组特定区域的高通量测序文库；
对所述样本的基因组特定区域的高通量测序文库进行测序，以便得到测序结果；以及
对所述测序结果进行数据分析，以便确定所述样本的基因组特定区域的甲基化信息。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述测序是利用高通量测序技术进行的。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述测序是利用Hiseq2000测序仪进行的。
5.一种用于确定样本的基因组特定区域的甲基化信息的装置，其特征在于，包括:
文库制备单元，所述文库制备单元用于制备样本的基因组特定区域的高通量测序文库，所述文库制备单元内设置有特异性探针；
测序单元，所述测序单元与所述文库制备单元相连，并且从所述文库制备单元接收所述样本的基因组特定区域的高通量测序文库，以便用于对所述样本的基因组特定区域的高通量测序文库进行测序，获得测序结果；以及
数据分析单元，所述数据分析单元与所述测序单元相连，并且从所述测序单元接收所述测序结果，以便对所述测序结果进行数据分析，确定所述样本的基因组特定区域的甲基化信息。
6.根据权利要求5所述的装置，其特征在于，所述特异性探针是对已知甲基化位点特异性的。
7.根据权利要求6所述的装置，其特征在于，所述特异性探针是基于采用人类基因组作为参考序列，并且采用已知具有甲基化位点的基因区域作为靶序列而设计的。
8.根据权利要求7所述的装置，其特征在于，所述已知具有甲基化位点的基因区域包括选自启动子区域、CpG岛区域、CpG岛外区域以及印记基因区域的至少一种。
9.一种用于构建样本的基因组特定区域的高通量测序文库的试剂盒，其特征在于，包括:
特异性探针，所述特异性探针是对已知甲基化位点特异性的。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性探针是基于采用人类基因组作为参考序列，并且采用已知具有甲基化位点的基因区域作为靶序列而设计的，可选地，所述已知具有甲基化位点的基因区域包括选自启动子区域、CpG岛区域、CpG岛外区域以及印记基因区域的至少一种 。
提供了高通量测序文库的构建方法及其应用。构建高通量测序文库的方法包括将基因组DNA片段化；将DNA片段进行末端修复；在经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A；将具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连；利用特异性探针对所述连接产物进行杂交捕获，以便获得目的片段；将所述目的片段进行重亚硫酸盐处理，以便将所述目的片段中非甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶；将经过转换的目的片段进行PCR扩增；分离纯化扩增产物，该扩增产物构成高通量测序文库。采用本发明的构建高通量测序文库的方法及其应用，能够方便有效地构建样本的基因组特定区域的高通量测序文库。
文档编号C40B40/06GKSQ
公开日日 申请日期日 优先权日日
发明者王君文, 高飞, 蒋慧, 武靖华, 吴红龙 申请人:深圳华大基因科技有限公司, 深圳华大基因研究院