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本帖最后由 antibody0109 于
14:41 编辑
各位秀友,大家在做实验时有时免不了需要制备抗体,如果你曾在或正在抗体公司呆过,或者你曾在或正在抗体公司制备抗体,不妨把你了解的国内的抗体制备公司（不要介绍目录抗体提供商）的情况在此做一简要介绍,供大家了解和参考。不要发道听途说的内容，谢谢配合。
注：拒绝广告，否则扣除秀基因和秀蛋白，严重者禁止发贴或封IP。
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珠海市英平生物科技有限公司，抗体不错，信誉好！
感谢分享，生物秀因你而精彩！
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珠海市英平生物科技有限公司，抗体不错，信誉好！
wj2331314 发表于
珠海市英平生物科技有限公司
二楼最好能介绍一下该公司的特色。
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antibody0109
首先抗体效价有保证，价格也很经济，一个抗原2000元，样品不纯可以免费给切胶免疫，我们实验室在那里做了5个抗原。
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3# antibody0109
首先抗体效价有保证，价格也很经济，一个抗原2000元，样品不纯可以免费给切胶免疫，我们实验室在那里做了5个抗原。
wj2331314 发表于
客户提供蛋白抗原，抗体保证ELISA效价，有些公司只收费1600元。
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生物秀举人
吉尔生化（上海）有限公司& && &&&
该公司的多肽合成业务国内第一，抗体制备业务由于吸引了国内几家抗体制备公司的优秀人才，技术优势不言而喻，目前在业界小有名气。
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吉尔生化（上海）有限公司& && &&&
该公司的多肽合成业务国内第一，抗体制备业务由于吸引了国内几家抗体制备公司的优秀人才，技术优势不言而喻，目前在业界小有名气。
glsbiochem 发表于
吉尔的多肽合成在国内应该位列三甲吧。
“抗体制备业务由于吸引了国内几家抗体制备公司的优秀人才，技术优势不言而喻，”但由于该公司特殊的结构使得这种技术优势打了多少折扣恐怕你自己应该是最清楚的了。
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PTG的一抗，到货速度很快，一周可以拿到。对于质量问题确认后可调换
内容不符，下次注意。
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PTG的一抗，到货速度很快，一周可以拿到。对于质量问题确认后可调换
xqdqs 发表于
此处讨论国内的抗体制备公司的情况，你介绍的是目录抗体，文不对题。
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武汉三鹰，作为国外技术资源在国内的技术伸展，不论技术还是产品和服务，都更加人性化，全蛋白分子抗原更加保证了抗体的质量
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murongxiaoxiao大叔级摄影爱好者，喜欢分享绝对零度积极有责任心，热心公益事业yiii红米达人，爱拍照的北京女孩关注今日：0 | 主题：115320
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求推荐国内外好的抗体公司
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如题，需要购买一些抗体做人体外诊断试剂，求推荐好的抗体公司，谢谢。
不知道邀请谁？试试他们
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Abcam, CST, Abnova, Novus, Millipore
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dxy_c8h2620w 如题，需要购买一些抗体做人体外诊断试剂，求推荐好的抗体公司，谢谢。你需要什么抗体
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每个公司都有好抗体，也有不好的抗体，看你需要什么抗体
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asdfghj00444 你需要什么抗体我需要TSH和AMH的抗体，您有好的推荐没？
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有 可以看看
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国内的抗体现在技术也很成熟了，linc-bio在行业内也是相当不错的
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wanpidehelinc-bio好的，谢谢，我去看看有没有需要的
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关于丁香园客服热线：400-901-9800&&&&客服QQ：&&&&&&&&&&
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> 服务详情
单克隆抗体制备
单抗制备流程
为满足客户对抗目标靶标物单克隆抗体的迫切需求,博奥森单抗制备团队经过多年的系统深入研究，发现了外源细胞因子对杂交瘤形成与生长调节规律，提出了一种全新技术方案，通过探明人类干细胞因子bFGF、HFCS对目标多肽以及靶标蛋白阳性杂交瘤形成与生长调节规律，创建了杂交瘤细胞株半固体干细胞培养基-梯度筛选法（简称"两步筛选法"），突破了常规HAT、HT培养筛选法阳性率低、随机性大的局限。单克隆抗体制备服务最快可在100天内完成单抗制备过程，并且保证为客户提供2个阳性克隆以及高亲和力的抗体产品。&博奥森公司可根据客户的不同需要提供经济、快速而可靠的单克隆抗体制备的完整解决方案，本项技术服务包括：&&- Balb/c纯系小鼠免疫；&&- 脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞的融合；&&- 抗体产生细胞的ELISA筛选；&&- 抗体产生细胞的亚克隆与扩增；&&- 指定细胞克隆的体外培养或腹水瘤接种法生产单克隆抗体。
&客户可以根据需要选择相应的服务，或者一站式制备服务更加优惠,具体说明如下：
一、单抗制备服务周期、制备步骤、制备说明
服务周期（天）
每种抗原免疫5只Balb/c小鼠，抗原与弗氏完全佐剂乳化
抗原与弗氏不完全佐剂乳化
抗原与弗氏不完全佐剂乳化；免疫一周后取血+ELISA检测效价。
单独抗原直接免疫；三天后采血（血清做阳性对照），取脾。
SP2/0骨髓瘤细胞与小鼠（ELISA效价较高）的脾细胞融合
HAT选择杂交瘤细胞
ELISA效价检测筛选阳性细胞克隆
杂交瘤细胞的亚克隆
至少进行2~4次杂交瘤细胞的亚克隆，直至细胞上清的ELISA结果阳性率达到100%，将完成细胞建株
对杂交瘤细胞株所分泌的抗体进行亚类测定
冻存细胞株
每种抗原提供2株杂交瘤细胞
制备腹水并纯化
接种细胞制备腹水、Protein A/G纯化
提供2株杂交瘤细胞的5-10mg/株、Protein A/G纯化的单抗IgG；提供制备技术服务报告。
二、单抗服务价格表
价&格(RMB)
客户提供蛋白抗原，本公司提供单抗制备的标准服务
客户提供多肽序列，本公司提供从合成多肽、偶联和单抗制备的标准服务
客户提供表达质粒，本公司提供从表达蛋白、纯化和单抗制备的标准服务
客户提供PCR模板，本公司提供从构建表达质粒、表达蛋白、纯化和单抗制备的标准服务
客户提供基因序列，本公司提供DNA扩增、构建表达质粒、表达蛋白、纯化和单抗制备的标准服务
客户提供蛋白抗原，在提供单抗制备的标准服务基础上， 承诺筛选出夹心ELISA配对的单抗
客户提供小分子抗原（真菌毒素，农兽药残留，抗生素等），在提供单抗制备的标准服务基础上， 承诺筛选出夹心ELISA配对的单抗
客户提供杂交瘤细胞株一株，本公司提供腹水制备服务并亲和纯化抗体IgG 5-10mg 真空冷干
客户提供单抗腹水，本公司提供Protein A/G纯化服务，10-20mg真空冷干
注：1、如果客户评估上清液结果后取消项目，我们将只收取初次交付的费用15000元；&&&&2、细胞冻存后，博奥森可免费帮客户保存细胞系6个月。6个月后，客户若有继续保存细胞的需求，每个细胞株每月收费60元。
多克隆抗体制备
本公司技术人员正在分组编号、分离血清
抗体分子是生物学和医学领域用途最为广泛的蛋白分子。抗体作为疾病预防、诊断和治疗的制剂已有上百年的发展历史。 随着生命科学研究的迅猛发展，抗体工程在生物技术领域越来越占有非常重要的地位。 我公司可为您提供快速的、高质量的和经济的多克隆抗体制备服务，并将成为您在科研及生产中的得力助手。我公司免费提供抗血清亲合层析纯化服务，得到目的蛋白的抗体IgG。我公司还免费提供真空冷冻抽干服务，得到冻干粉状的抗体IgG产品，以便产品的使用及长期保存。
一、多肽合成偶联载体蛋白制备多克隆抗体
制备要求/时间/流程
制备要求客户需提供制备抗体的相关蛋白的英文名称的全称也可同时提供该蛋白的全序列或氨基酸（多肽片断）序列，供参考(不要求)
制备时间2.5-3个月左右
制备流程签订——付首付款——制备抗体——付清全款——免费将抗体寄给客户
产品产量及价格
1、20ml兔多克隆抗体血清原液（小鼠为5ml腹水）
2、经亲和层析纯化抗体IgG 10mg
3、多肽抗原3mg（用于客户自行检测抗体使用）
提供1ml经亲和层析纯化的抗体,IgG含量：500ug/ml
1：8000以上（ELISA）
1：200-500以上（免疫组化）1：500-1000（ELISA）1:200-500(WB)
提供抗体制备报告及抗体使用说明书
抗体使用说明书
植物蛋白：6400.00元（我公司提供抗原）&&&&&&&&&&3800.00元（客户提供抗原）
化合物另议
3500.00元（我公司提供抗原）
若客户提供通过基因工程表达的抗原，则要求：抗原纯度85%以上，分子量大于10KDa，抗原量12-13mg
若客户提供通过基因工程表达的抗原，则要求：抗原纯度85%以上，分子量大于10KDa，抗原量12-13mg
免费真空冷冻抽干，最终为您提供易于保存的冻干粉产品
免费真空冷冻抽干，最终为您提供易于保存的冻干粉产品
特殊抗体的制备，价格另议
特殊抗体的制备，价格另议
二、构建表达质粒、表达蛋白制备多克隆抗体
客户提供表达质粒，本公司提供从表达蛋白、纯化蛋白和制备兔多抗的标准服务
￥12000.00
客户提供PCR模板，本公司提供从构建表达质粒、表达蛋白、纯化蛋白和制备兔多抗的标准服务
￥15000.00
客户提供基因序列，本公司提供从DNA扩增、构建表达质粒、表达蛋白、纯化和制备兔多抗的标准服务
￥18000.00
委托技术服务联系电话：010-6
联系人：张老师
抗体制备完成后，为提高抗体的亲和力，减少非特异性干扰因素，对制备完成的抗体进行亲和层析纯化很有必要。利用亲和层析纯化法纯化抗体：5mg/1800.00元。选择抗原特异性纯化法：5mg/5000.00元。
.cn 北京博奥森生物技术有限公司 京ICP备号 京公网安备号
通过国际质量管理体系ISO GB/T认证&&&&编号：R1M/1100最牛最全面的单克隆抗体制备技术
单克隆抗体制备技术&
一、实验原理
B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种
B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的
B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。
制备单克隆抗体的方法是用缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧啶核苷酸酶的瘤细胞变异株与脾脏的
B细胞融合。采用 HAT选择性培养基（hypoxanthine-aminopterin-thymidine次黄嘌呤氨基喋呤胸腺嘧啶），在这种选择性培养基中，由于变异的瘤细胞不具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧啶核苷激酶，所以不能利用培养基中的次黄嘌呤或胸腺嘧啶核苷而合成
DNA。而只能利用谷酰胺与尿核苷酸单磷酸合成
DNA，这一途径又被氨基喋呤所阻断，所以未融合的瘤细胞不可避免也要死亡。融合的杂交瘤细胞由于脾淋巴细胞具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶，可以通过次黄嘌呤合成
DNA，克服氨基喋呤的阻断，因此杂交瘤细胞大量繁殖而被筛选出来。B淋巴细胞在一般培养基中不能长期生长，一般于二周内均死亡。
单克隆抗体与常规抗体相比有如下优点：①单一特异性，与一个抗原决定簇反应；②可重复性，能够提供完全一样的抗体制剂；③一经制出，可无限量地供应；④生产单克隆抗体，不一定需要纯的抗原；⑤能查出混合物中存在的用常规方法查不出的少量成分。
二、实验材料
1。主要仪器
CO2培养箱、台式离心机、倒置显微镜、倒置荧光显微镜、酶标仪、电热恒温水浴箱、超纯水系统、超净工作台、核酸电泳仪、SDS-PAGE电泳仪、Western Blotting转膜仪、凝胶成像系统等。
2．主要试剂
HAT培养基（购自Sigma公司）、HT培养基（购自Sigma公司）、RPMI1640培养基（购自GIBCO公司）、羊抗鼠IgG-HRP抗体（购自Sigma公司）、羊抗鼠IgG-FITC抗体（购自Sigma公司）、胎牛血清（购自GIBCO公司）、DMSO（购自Sigma公司）、50%PEG（购自Sigma公司）、DMEM培养基（购自GIBCO公司）等。
3。实验动物
6-8周龄Babl/c小鼠，SPF级，购自湖北省疾病预防和控制中心或武汉大学中南医院实验动物中心。
三、操作程序
以下为单克隆抗体制备的操作过程，值得注意的地方用小字体标出
1、动物免疫
首先，取适量抗原(约100ug)与等体积的佛氏完全佐剂乳化，免疫动物为4-6周龄的雌性BALB/c鼠。
免疫方案及程序为:背部皮下注射佛氏完全佐剂乳化的抗原100ug/只;2周后换用不完全佐剂乳化等量抗原，背部皮下注射;间隔至少1个月后，三免,200ug/只;在融合前三天通过脾内、尾静脉注射进行加强免疫，抗原量为200-300ug/只（一般为100ug，如果抗原量过大的话，小鼠可能会发生应激死亡），不加佐剂。
2、SP2/0骨髓瘤细胞的活化&&&&&&&&
骨髓瘤细胞的复苏: 从液氮罐中取出骨髓瘤细胞冻存管,放入37℃水浴锅中至完全融化;1000r/min离心3-5倒弃上清液,用营养液(RPMI-1640,小牛血清的浓度在10%-20%)将下沉的细胞吹散悬浮后加入有适量营养液的细胞培养瓶中,置5%CO2 37℃培养箱培养;次日观察骨髓瘤细胞的生长情况,如为圆形,透亮,呈轻微贴壁生长,则说明骨髓瘤细胞生长良好,如发现有些细胞发暗,漂浮于液体中,则可以换液,弃去漂浮的死亡细胞,此时存活的细胞大部分可贴壁生长并增殖.培养3-5d后进行细胞传代,扩大培养.
将细胞板中培养的SP2/0细胞，收集起来用0.5ml1640基础液悬浮.(0.5~1*106个)注射BALB/c小鼠背部皮下。待9~10d瘤子生长后，视大小选择取瘤细胞的时间。
3、细胞融合
一般在免疫小鼠加强免疫后3～5天做细胞融合结果比较好。
在融合之前应将PEG、40ml终止液（基础1640）和HAT培养基放入37℃温箱预热备用。
三种细胞的制备方法如下，结合以往做的经验，一般分离的顺序为：首先制备SP2/0瘤细胞，然后制备饲养细胞，最后制备免疫脾细胞。
3.1 SP2/0瘤细胞的制备
从小鼠背部生长的瘤子中制备的方法如下:
1．小鼠拉颈处死，75%酒精浸泡5min,超净台无菌状态取瘤；
2．先将肿瘤块剪下，放于匀浆器中，加5ml1640基础液充分研磨后，补加10ml1640液，静置2min，待较大的组织团块沉于管底后，吸取上层的细胞悬液于另一离心管备用，再补加10ml1640液，重复两次（在重悬的过程中，第一次应只吸出5ml，因为第一次匀浆器里面的细胞和大的组织块比较多，细胞下沉的速度比较）；
3．1000r/min离心10min去上清，以基础1640液重悬细胞，将细胞悬液体积控制在30ml；
4．于另一50ml离心管中加入15ml淋巴细胞分离液，将细胞悬液轻轻地加在分离液之上(比例为1:2到1:1)；
5．1200r/rnin
15min，用吸管吸取位于界面致密的白色细胞层，（吸管应该放在50ml离心管的中部去吸取，在离心管的内壁上有少许的组织和杂质，如果吸出的话，会影响瘤细胞的纯度）用1640液洗2遍，然后用10ml
1640重悬细胞，计数后备用。
3.2免疫脾细胞的制备
1．取加强免疫的BALB/c鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，在75%酒精中浸泡5-10min消毒;
2．将消毒好的老鼠固定于解剖板上，前肢固定，后肢固定，用镊子夹住下腹部皮肤，剪一小口，撕开皮露出腹膜，换一套镊子和剪刀，剪开腹膜，暴露出脾脏，再换一套器械，用镊子夹住脾脏，用剪刀去掉粘连细胞的脂肪组织，剪破脾脏外膜（可以将脾脏少许剪几下，便于脾细胞的分离），放入灭菌的匀浆器中;
3．加5ml1640基础液于匀浆器中，研磨(不要太剧烈，以免损伤脾细胞，可选用比较松的匀浆器)，挤压出脾细胞，取出匀浆棒，补加10ml1640基础液，静置2min，吸取上层细胞悬液于另一无菌的50ml离心管，再补加10ml1640液于匀浆器中，同上重复2次（在重悬的过程中，第一次应只吸出5ml，因为第一次匀浆器里面的细胞和大的组织块比较多，细胞下沉的速度比较）;
4．1000r/min离心10min去上清，细胞重悬后计数.
3.3饲养细胞的制备
1．取一只未免疫的BALB/c鼠，眼眶放血，收集血清为阴性血清。
2．四肢固定后，先撕开皮，露出腹膜，在腹膜上剪一小口(在腹部中央)，然后用吸管2～3ml（视老鼠大小而定）1640基础液注入小鼠腹腔，吸打几次，再将液体吸出放于一50ml离心管，再重复一次，此为腹腔巨噬细胞。
3．同上操作制备脾细胞悬液，并放入腹腔巨噬细胞管中。
4．1000r/min离心10min去上清，细胞用HAT培养基悬浮后，置于37℃，5�2培养箱中待用。
3.4 细胞融合
1．将1-2x107个SP2/0与108个免疫细胞(1:10-1:15)于50ml离心管中混匀，1000r/min，离心8min。
2．倒空上清(用灭菌的滤纸吸干)，轻轻敲击管底，使细胞沉淀略加松动(便于PEG充分的作用细胞)。
3．将装有细胞混合物的离心管放于37℃水浴中。然后在1min内慢慢滴入预温至37℃的50%PEG
0.8ml(sigma)，边加边轻轻用吸管尖搅拌。
4．继续搅拌30s，静置30s。
5．然后慢慢加入37℃预温的1640基础液10ml。具体方法为:第一分钟逐滴滴入1ml。第二分钟加lml，（前两毫升一定要在一分钟内缓慢的加入，并且要不断的搅动，切忌加入速度过快）第3~4分钟加3ml，第5分钟加其余的5ml，每次加时需缓慢加入，并不断轻轻地搅拌。最后加入30ml1640液，也需慢慢加入。
6．1000r/min离心5min，去上清于37℃放置5-8min。
7．用悬浮饲养脾细胞的HAT培养基与融合后的细胞混合（在用含有饲养细胞的HAT培养基重悬融合离心以后的细胞时，可以多吹吸几次，但是力度一定要小，因为刚刚融合到一起的细胞如果力度过大的话有可能会把它再次吹散），根据需要补加适量的HAT培养基，分种于96孔培养板中，约250ul/孔。一次融合可接种4-8块96孔板。(根据需要也可少种，一般按SP2/0的细胞数计算，每孔接种量约含104左右个SP2/0细胞)
8．于37℃，5%CO2培养箱中培养。
9．融合后第二天开始观察，有无污染，第4天吸去100ul培养基换HT培养基100ul（或者吸去80ul培养基补加一滴。另外，不论是用移液器还是用吸管在补加HT培养基时，力度一定要小，一定要防止将细胞集落打散，打散的话，集落就很容易死亡）。待融合细胞集落长至培养孔1/4，培养基略变黄时，进行抗体检测（另外，在抗体检测之前这几天的观察过程中，如果发现集落的生长状态不好的话，一定要及时采取不久措施）。
4、间接ELISA方法检测杂交瘤细胞上清
用间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞，其步骤如下(整个过程中应该注意的是：每一次加样，不论是细胞上清、二抗以及洗涤液最好是悬空加，避免交叉污染)：
1．包被已知抗原:用包被缓冲液将纯化的包被用抗原稀释至1-10ug/ml（一般为1～5ug，具体的蛋白包被量应该按照方针滴定的结果来确定）;向微孔中每孔加100ul,轻轻摇匀,4℃冰箱过夜或37℃ 1h;甩掉孔内液体（尽量拍干空里面的液体），洗涤3次。每次2～3分钟。
2．封闭酶标孔中没被抗原包被的位置:向微孔中每孔加200ul封闭液（5%的脱脂奶粉或者0.1%的BSA）,轻轻摇匀,
37℃ 1h;甩掉孔内液体;逐孔加满洗涤缓冲液（200ul,视现实情况而定。实验室现有黄色枪头只能吸这么多，再多的话会将洗涤液吸到移液器里，污染移液器）,静置2～3min,甩掉孔内液体,拍干,用此法先用洗涤缓冲液洗3次。
3．加样:将待测的杂交瘤每孔取50ul上清液按顺序加入酶标孔中,轻轻摇匀.37℃1h,洗涤,拍干。
4．加酶标抗抗体:先用稀释液将酶标第二抗体按说明稀释到适当的工作浓度,每孔加入100ul,轻轻摇匀,置37℃1h;然后洗涤,拍干。
5．加显色液:每孔加新鲜配置的显色液100ul,轻轻摇匀,37℃, 10min.
6．终止反应:每孔加终止液50ul.
7．判定结果:可于白色背景上,直接用肉眼观察结果,根据颜色深浅,判定.也可在酶标仪上测定OD630nm值.
5、杂交瘤细胞的克隆化(有限稀释法)
1．克隆前制备小鼠饲养细胞层（根据经验，克隆的时候可以先制备好饲养细胞，值得注意的是制备好以后不要立即就将饲养细胞分装到96孔板里，如果先将饲养细胞铺到板子里的话，再加稀释好的杂交瘤细胞时，就将饲养细胞吹到了细胞板孔的周围，而中间的饲养细胞就很少，但是有时候杂交瘤细胞就是在细胞板孔的中间，这样的话，就不利于杂交瘤细胞的生长，因为，可以先制备好饲养细胞，放在一边，等克隆全部完成以后再将饲养细胞分铺到细胞板孔里，这样的效果会好很多）。
2．将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹下，用血细胞计数板计数活细胞数。
3．将细胞用完全培养基稀释到5、10、50个细胞/毫升。
4．将上述三个浓度的细胞悬液分别加入已制备好的饲养细胞的%孔培养板，100ul/孔，使相应的每孔分别含0.5、1和5个细胞。
5．培养到第4天补液一滴，第5-6天仔细观察各孔内细胞的生长情况，并记录。
6．特异性抗体的检测:在克隆后第7~9天，细胞克隆长满1/3-1/2个视野时，即可检测。（如检出细胞生长孔有特异性抗体，可选择抗体效价高，呈单个克隆生长，形态良好的细胞孔，继续同法再克隆或扩大培养，直到该杂交瘤细胞株很纯后就可扩大培养）。
7．阳性孔的细胞可移至24孔培养板，待24孔板中的细胞生长良好时，可腹腔接种小鼠采制腹水，并冻存4支以上的细胞。
6、单克隆抗体的生产和效价测定
建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液，用间接ELISA测定效价。也可在小鼠体内诱生小鼠腹水生产单克隆抗体，取8-10周龄的小鼠，腹腔注射灭菌的液体石蜡（或者弗氏不完全佐剂）0.5ml/只，7-10天后腹腔注射杂交瘤细胞5x105-106/只（一个24孔细胞板的细胞长满后，收集细胞注射即可），7-10天后抽取小鼠腹水，离心取上清，测定效价，并冻存细胞。
7、间接ELISA法检测腹水中抗体滴度
&具体实验步骤参照第四步，只是在加样时，也就是在加腹水时，要做倍比稀释，一般从1：100开始，做16个稀释度即可（建议在一块ELISA板子上做完这16个稀释度），并以SP2/0腹水作为对照来进行结果判定。
8、间接免疫荧光法检测单克隆抗体
1。将MARC-145细胞培养于24孔培养板，待细胞长成单层后，接种PRRSV，同时设不接毒的正常细胞对照，待细胞出现轻微病变后用80%丙酮（-20℃预冷30min）固定10min，然后用PBS洗涤三次，每次5min；
2。加入待检的单抗样品(杂交瘤培养上清用原液，腹水1:100稀释)，同时做阳性(纯化PRRSV高免小鼠血清1:50稀释)和阴性(未免疫空白小鼠血清1:50稀释、SP2/0细胞培养上清原液、SP2/O细胞制备的腹水1:100稀释)对照。37℃温育30min，PBS洗三次；
3。加入异硫氰酸荧光素(Fluorescein
isocyanate,FITC)标记的羊抗鼠IgG(sigma 1:100)，37℃温育30min，PBS洗三次，在荧光显微镜下观察。如空白和已知的阴、阳性对照孔的结果均成立时，记录各个单抗的检测结果。
另外还可以做真核验证：
1。将Hela细胞培养于24孔培养板带细胞长到60%～80%时，转染构建的真核表达质粒（例如：PCAGGS-HA-Nsp7）,同时转染空载体（PCAGGS-HA）作为对照，48H后，用80%丙酮（-20℃预冷30min）固定10min，然后用PBS洗涤三次，每次5min；
第2、3步同上。
四、注意事项
4.1 免疫动物的选择
用于免疫、制备饲养细胞、制备腹水和制备骨髓瘤细胞的小鼠必须是雌性的BALB/c小鼠，必须购买于正规的具有实验动物生产资格证的机构，比如：湖北省疾病预防控制中心和武汉大学中南医院实验动物中心。
4.2 细胞融合的关键
1。技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。
2。融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。
4.3 杂交瘤细胞的克隆化（有限稀释法）的关键
1。杂交瘤细胞计数必须有一定的准确度，这样，才能保证在做有限稀释的时候，最后分铺的细胞个数是预想的数量。
2。克隆后的观察应当准确区别出每个细胞板孔里具体有几个杂交瘤细胞集落，这样有利于挑选单克隆，产生高纯度的杂交瘤细胞株。必须要通过多次的克隆，以获得纯的细胞株。
4.4 对所使用试剂和器材的要求
1。整个单克隆抗体的制备过程中所需试剂必须提前配置好，杜绝现配现用，以避免污染。
2。所需器材（青霉素萍、枪头、EP管等）必须是经过高压灭菌的。
整个操作过程要严格坚持无菌操作，避免一切有污染可能的操作，以避免污
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