利用蜈蚣草孢子进行快速组培繁殖的方法
专利名称:利用蜈蚣草孢子进行快速组培繁殖的方法技术领域本发明涉及一种植物组织培养和种质保存方法，更具体地涉及利用蜈蚣草孢子进行组织培养和种苗繁殖的方法。
背景技术在国内外，砷污染都是一个非常普遍、非常严重的环境问题。陈同斌等人发现蜈蚣草(Pteris vittata L.，凤尾蕨属)对砷毒具有极强的耐性，可以从砷污染土壤中大量富集砷，并将其积累在地上部，从而可以利用其修复和治理受砷污染的土壤(中国发明专利公开号CN1397390A，陈同斌等人，《科学通报》，2002年47卷第3期207～210页)。此外，蜈蚣草还可以作为花卉作物，用于生产鲜切花。
蜈蚣草孢子很小，对外界的抵抗力不强，因而在大田条件下用孢子育苗很难成功。如果靠其地下茎进行繁殖，不仅繁殖系数低，而且费时、费力，也同样不能满足实际需求。因此，在蜈蚣草的大规模实际中，需要解决大量种苗的问题。虽然尹怀约(《四川师范学院学报》，1991年，第12卷20-22页)报道过有关蜈蚣草的组培方法，但是我们采用其报道的方法进行过多次试验，但是始终没有成功。采用蜈蚣草地下茎虽然也可以进行组培，但是从野外将活体植物携带回来时，如果途中的时间太长则可能会导致蜈蚣草的死亡，而且携带的地下茎数量也很有限。与地下茎不同，蜈蚣草的孢子非常小，携带非常方便，而且也很容易保存，在野外取样的途中经过长时间的放置也不会死亡。因此，对于大规模实际应用而言是一种最好的组培方式。
本发明提供一种利用蜈蚣草孢子进行组织培养技术，在基本培养基中加入适宜的激素来诱导产生愈伤组织，并产生孢子体植株，然后通过孢子体植株进行组培繁殖，从而迅速得到大量组培苗。这种大规模快速繁殖种苗的方法，不仅为利用蜈蚣草修复砷污染环境和生产优质切花提供足够的苗源，而且可以保证所提供的种苗对砷的富集能力最强、生物量最大或株型最好。
本发明的目的在于针对上述问题，提供一种利用蜈蚣草孢子进行快速繁殖和种质保存的方法。本发明的方法不受自然条件、地区差异或气候的限制，繁殖系数高、速度快，有利于优良种质资源的长期保存。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案，其实现过程包括孢子的消毒、培养和外植体的采集，愈伤组织的诱导，继代培养，生根培养，温室练苗和定植。
(1)孢子的消毒、培养和外植体的采集
从蜈蚣草成熟孢子叶，孢子囊群呈棕色，自上到下取叶片顶端第4片至第30片羽叶的孢子。用70％乙醇消毒0.5～2分钟，再用0.1％HgCl2溶液消毒1～4分钟，用无菌水冲洗6遍。将孢子播种到1/2Knop(培养基传统配方，以发明人Knop名字命名，商购自北京化学试剂公司)+0.5％CaCO3+1％蔗糖培养基质上，用封口膜封好后置于温度为25℃、光照强度为1000lux的光照培养箱内培养，每天光照时间为16小时。培养40～70天后，则孢子萌发成为原叶体，在原叶体上可以形成雌雄配子体，雌雄配子融合形成合子，然后由合子长成所需的无菌孢子体植株(外植体)。
(2)愈伤组织的诱导
将孢子萌发后长成的无菌孢子体植株(外植体)转接到MS(培养基传统配方，以1962年两个发明人名字共同命名，商购自北京化学试剂公司)+KT(6-糠氨基嘌呤，商购自北京化学试剂公司)4.6-26.6μmol/L+NAA(a奈乙酸，商购自北京化学试剂公司)0.1-10μmol/L培养基上继续培养1个月，可诱导孢子体植株产生愈伤组织，并且在这些绿色球状愈伤组织的顶端可以长出孢子体叶片。
(3)孢子体植株的继代培养
将诱导出来的未长根的外植体(孢子体植株)转移到继代培养基(MS+KT 2.3-23.0μmol/L+NAA 2.7-5.4μmol/L+0.7％琼脂+3％蔗糖)上进行继代培养。每个继代周期约需25～30天。
(4)孢子体植株的生根
将诱导继代培养的孢子体植株转移到生根培养基(1/2MS+KT 0.5-2.3μmol/L+NAA 2.7-5.4μmol/L+0.7％琼脂+1％蔗糖)上进行生根培养。20～30天后，孢子体植株陆续长出根。
(5)组培苗的练苗和定植
将经过生根培养基培养长根后的蜈蚣草植株在移栽到大田之前需要进行练苗和苗圃育苗。育苗前要在温室中练苗约7天时间，并注意防止环境的突然改变而造成幼苗的死亡。练苗的温度25℃左右，苗床用薄膜覆盖，使空气相对湿度保持在70％以上。待幼苗长大后即可移栽到大田中。
图1是蜈蚣草孢子叶取样位置示意图及孢子照片。
具体实施方式
下面列举实施例说明本发明的可行性以及效果，但是并不局限于此。
从蜈蚣草(产地湖南郴州)成熟孢子叶，孢子囊群呈棕色，自上到下取叶片顶端第6片至第41片羽叶的孢子，孢子形成原叶体的百分比超过90％。取样位置示意图及孢子照片见图1。
将成熟孢子用70％乙醇消毒1.5分钟，再用0.1％HgCl2溶液消毒3分钟，用无菌水冲洗6遍，孢子微生物污染率低于10％。将孢子播种到1/2Knop+0.5％CaCO3+1％蔗糖培养基上，置于温度为25℃、光照强度为1000lux的光照培养箱内培养，每天光照时间为16小时，培养60天后，则孢子萌发成为原叶体并长成所需的无菌孢子体植株，原叶体产生孢子体植株的比例可达56％。其它配方培养基的孢子植株产生率均不及此配方，具体见表1。
表1不同基质配方的孢子植株产生率
将孢子萌发后长成的孢子体植株转接到MS+KT 4.6μmol/L+NAA0.1μmol/L+0.7％琼脂+3％蔗糖；MS+KT 10μmol/L+NAA 5μmol/L+0.7％琼脂+3％蔗糖；MS+KT 26.6μmol/L+NAA 10μmol/L+0.7％琼脂+3％蔗糖三个配方的培养基继续培养1个月，均可诱导产生出愈伤组织(表2)，并且在这些绿色球状愈伤组织的顶端长出孢子体叶片，第二种配方每株最多分化出26个新的孢子体植株。在MS+6-BA(6-苄氨基嘌呤，北京化学试剂公司)4.4-26.6μmol/L+NAA 0.0-2.7μmol/L+0.7％琼脂+3％蔗糖培养基上继续培养仅诱导产生绿色球状愈伤组织，但不能分化出孢子体叶片和形成植株。
表2不同基质配方的诱导效果
将诱导出来的未长根的孢子体植株转移到MS+KT 2.3μmol/L+NAA2.7μmol/L+0.7％琼脂+3％蔗糖；MS+KT 10μmol/L+NAA 4μmol/L+0.7％琼脂+3％蔗糖；MS+KT 23.0μmol/L+NAA 5.4μmol/L+0.7％琼脂+3％蔗糖三种继代培养基上进行继代培养。每个继代周期约25天。经过2次继代培养后，每个孢子体植株平均可以诱导产生约95～100个的新孢子体植株。
表3不同基质配方的继代培养
将诱导继代培养的孢子体植株转移到生根培养基，生根培养基选用1/2MS+KT 0.5μmol/L+NAA 2.7μmol/L+0.7％琼脂+1％蔗糖；1/2MS+KT 1μmol/L+NAA 4μmol/L+0.7％琼脂+1％蔗糖；1/2MS+KT 2.3μmol/L+NAA5.4μmol/L+0.7％琼脂+1％蔗糖三种，25天后，孢子体植株(n＝33)开始长根，诱导长根的百分率为76％～100％，随着KT含量的增加，长根率逐渐下降。在Knop+NAA 2.7μmol/L+0.7％琼脂；Knop+NAA 3.5μmol/L+0.7％琼脂；Knop+NAA 4.5μmol/L+0.7％琼脂或者MS微量元素+NAA2.7μmol/L+0.7％琼脂；MS微量元素+NAA 4μmol/L+0.7％琼脂；MS微量元素+NAA 5.4μmol/L+0.7％琼脂培养基诱导长根的百分率为76％～85％。
表4不同基质配方的生根率
经过生根培养基培养长根后的蜈蚣草幼苗在温室中练苗7天时间。练苗的温度25℃左右，苗床用薄膜覆盖，空气相对湿度保持在70％以上。待幼苗长大后即可移栽。
将幼苗移栽到含砷507mg/kg的土壤中，种植100天后，蜈蚣草的地上部含砷量高达3570mg/kg。这证明，经过组培后的蜈蚣草对砷仍具有很强的超富集功能。
操作同实施例1，在步骤2中诱导产生愈伤组织的培养基为MS+KT 4.6μmol/L+NAA 0.1μmol/L+0.7％琼脂+3％蔗糖。在步骤4中使用的生根培养基为1/2MS+KT 0.5μmol/L+NAA 2.7μmol/L+0.7％琼脂+1％蔗糖。接种蜈蚣草孢子10个，经过1次继代培养后，获得孢子体植株79株，平均每个孢子形成7.9个孢子体植株。
取实施例1中所繁育的组培苗，经过200多天保存后这批苗仍保持旺盛的活力。通过转接、增殖等系列培植，练苗后可以顺利移栽到大田中并存活。移栽到含砷507mg/kg的土壤中栽培100天后，其地上部砷的含量可高达3800mg/kg。孢子产地蜈蚣草植株中砷含量变化范围为mg/kg。这证实，长期保存过程中蜈蚣草对砷的富集能力没有退化。这意味着在应用蜈蚣草进行修复大面积砷污染土壤时，本发明可以用于提供足够的蜈蚣草苗源。另外，本发明的方法不受自然条件、地区差异或气候的限制，繁殖系数高、速度快，可以用于长期保存蜈蚣草优良种质资源。权利要求1.一种利用蜈蚣草孢子进行组织培养和繁殖种苗的方法，包括选用通过孢子培养而成的蜈蚣草孢子体植株作为外植体，在基本培养基上直接诱导出芽，其特征是孢子经过消毒和培养形成孢子体植株后，还需进一步经过愈伤组织的诱导、继代培养、诱导生根、练苗和育苗过程，最终形成组培苗。2.根据权利要求1所述的方法，其特征是选用蜈蚣草成熟孢子叶，孢子囊群呈棕色，自上到下取叶片顶端第6片至第41片羽叶的孢子。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是选用由蜈蚣草孢子经过消毒和无菌培养所得到的孢子体植株作为外植体。4.根据权利要求1所述的方法，其特征是蜈蚣草孢子的消毒和培养过程为用70％乙醇消毒0.5～2分钟，再用0.1％HgCl2溶液消毒1～4分钟，用无菌水冲洗6遍，将孢子播种到1/2Knop+0.5％CaCO3+1％蔗糖培养基上或1/2MS+0.5％CaCO3+1％蔗糖培养基上培养。5.根据权利要求1所述的方法，其特征是诱导培养基选用MS+KT(6-糠氨基嘌呤)4.6-26.6μmol/L+NAA(a奈乙酸)0.1-10μmol/L；继代培养基选用MS+KT 2.3-23.0μmol/L+NAA 2.7-5.4μmol/L+0.7％琼脂+3％蔗糖；生根培养基选用1/2 MS+KT 0.5-2.3μmol/L+NAA 2.7-5.4μmol/L+0.7％琼脂+1％蔗糖，或者Knop+NAA 2.7-4.5μmol/L+0.7％琼脂，或者MS微量元素+NAA 2.7-5.4μmol/L+0.7％琼脂。6.根据权利要求1所述的方法，其特征是蜈蚣草组培苗在移栽前要在温室中练苗7天时间，练苗的温度25℃左右，苗床用薄膜覆盖，使空气相对湿度保持在70％以上。专利摘要本发明涉及一种植物组织培养的方法，更具体地涉及利用蜈蚣草(Pteris vittata L.)孢子进行组织培养和种苗繁殖的方法。该方法是利用蜈蚣草成熟孢子在MS+KT(6－糠氨基嘌呤)4.6－26.6μmol/L+NAA(a奈乙酸)0.1－10μmol/L培养基上诱导出芽，继代培养基采用MS+KT 2.3－23.0μmol/L+NAA 2.7－5.4μmol/L+0.7％琼脂+3％蔗糖培养基，选用1/2MS+KT 0.5－2.3μmol/L+NAA 2.7－5.4μmol/L+0.7％琼脂+1％蔗糖，或者Knop+NAA2.7－4.5μmol/L+0.7诱导生根，再进行练苗和育苗过程，最终形成组培苗。经过组培后的蜈蚣草对砷的富集能力没有退化，因此，在应用蜈蚣草修复大面积砷污染土壤时，本发明可以用于提供足够的种苗。文档编号A01H4/00GKCN公开日日 申请日期日发明者陈同斌, 莫良玉, 廖晓勇, 雷梅, 黄泽春 申请人:中国科学院地理科学与资源研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan蕨类植物生活史中A.配子体寄生在孢子体上B.孢子体发达且占优势C.配子体不能独立生活D.孢子体寄生在配子体上——精英家教网——
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