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【求助】G418的筛选浓度
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这个帖子发布于12年零56天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我想筛选稳定转染的293T和cos7细胞株,请教各位前辈:G418的筛选浓度分别应该是多少啊?在六孔板上的接种密度是多少啊?多谢!
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每种细胞都有自己的G418敏感率。有时，即使是同一种细胞株，例如PT67，不同条件培养或不同代次来源的，也可能有不同的G418敏感率。最好先做一下预实验——G418敏感测定，测定出这两种细胞相应的筛选浓度。通常用100、200、300、400、500、800 ug/ml六种梯度，已做过十几种细胞，都没跑出这个范围。我的G418是用0.1g加7ml无血清培养液配成，浓度计为（10mg/ml)。六孔板接种密度大约每孔是：4—8*10∧4。在做稳定筛选初期，先用低浓度（则一周内能杀完细胞的最低浓度），等克隆团壮大后，再选用高浓度继续筛选。筛选稳定表达克隆的，周期很长，要获得一定量的阳性细胞，通常要用上1个半月到2个月的时间。
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每种细胞都有自己的G418敏感率。有时，即使是同一种细胞株，例如PT67，不同条件培养或不同代次来源的，也可能有不同的G418敏感率。最好先做一下预实验——G418敏感测定，测定出这两种细胞相应的筛选浓度。通常用100、200、300、400、500、800 ug/ml六种梯度，已做过十几种细胞，都没跑出这个范围。我的G418是用0.1g加7ml无血清培养液配成，浓度计为（10mg/ml)。六孔板接种密度大约每孔是：4—8*10∧4。在做稳定筛选初期，先用低浓度（则一周内能杀完细胞的最低浓度），等克隆团壮大后，再选用高浓度继续筛选。筛选稳定表达克隆的，周期很长，要获得一定量的阳性细胞，通常要用上1个半月到2个月的时间。
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我们是1mg/ml 左右用在BSR上，泡泡游说的对，不同的细胞应该是不同浓度的，要摸索。而且加了G418后，细胞不是很好养，需要下工夫，我的经验是间隔的加，
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我正在转染293细胞，做了浓度筛选曲线，选 了600ug/ml浓度做。确实象楼上讲的，细胞长得较慢，稍微消化不当贴壁就不好，比正常293细胞难养。不过，经验是摸索出来的。祝你成功!
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谢谢楼上各位的帮助！我还有两个问题;泡泡游说:G418是用0.1g加7ml无血清培养液配成，浓度计为（10mg/ml)。浓度是怎么算的啊？&在做稳定筛选初期，先用低浓度（则一周内能杀完细胞的最低浓度），等克隆团壮大后，再选用高浓度继续筛选。&应该是先用高浓度筛选，再用大约一半浓度维持吧？谢谢！
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1、G418是用0.1g加7ml无血清培养液配成，浓度计为（10mg/ml)._____我是按逆转录系统的说明书来算的，可能考虑了G418的纯度吧。2、一般的文献是介绍“应该是先用高浓度筛选，再用大约一半浓度维持”，通常我是反其道行之，认为刚开始稳定克隆的阳性细胞不多，不能耐受高浓度，为了尽量保持更多的阳性细胞不被杀灭，扩大产量，我先用低浓度（一周内能杀完细胞的最低浓度），待筛选出克隆团后，再消化传代，进一步用增强筛选浓度。这样能大大缩短筛选时间。当然，要挑单克隆细胞培养扩大，还是按照常规介绍的”先高后低“的方法。这仅是我的一家之见，还请大家拍砖。
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泡泡游 1、G418是用0.1g加7ml无血清培养液配成，浓度计为（10mg/ml)._____我是按逆转录系统的说明书来算的，可能考虑了G418的纯度吧。G418一般用的不是纯品，是有添加剂的，真正的G418有个效度。我见过的有0.716和0.722的两种。以0.716的效度计算，0.1gG418粉末中的G418有效量为0.1*0.716=71.6mg，溶解到7ml溶液中，浓度约为10mg/ml。
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多谢各位!我又学到了很多知识:-)
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我也说一下，我曾经也做过G418的筛选。文献上大多说293细胞G418筛选浓度用800ul/ml，我也试着做过，做了几个月，什么都没有。后来，做了一个梯度敏感试验，选取五天内绝大多数细胞死亡的浓度——400ul/ml的浓度。
总结一下：在做稳定克隆筛选之前，一定要做细胞的梯度敏感实验。待挑出克隆，尽可能挑单克隆，比如用稀释法、针挑，滤纸法等方法，这样的克隆是最有质量和保障的。时间和经费不允许的情况下，也只有收克隆团了，这种情况培养，一定要记得G418的持续筛选。
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g418浓度问题
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本人也是新手，要做THP-1的G418筛选，我搜索了很多帖子，现在还有点不太明白，请高手指教。在用G418筛选转染细胞后，挑出单克隆在96孔板内培养时，还是用筛选浓度的G418的培养基培养吗？谢谢
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请教一下，悬浮细胞（Jurkat）G418初筛时，接种密度最好是多少呀？我感觉24孔板接种1000个太少了
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我用了很多年的病毒载体，各种病毒也包过非常多，欢迎大家来我的病毒包装与质粒转染精华答疑贴答疑，基本秒回复！贴子链接：
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关于丁香园关注今日：53 | 主题：505312
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【求助】G418筛选浓度的确定
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这个帖子发布于3年零100天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
各位老师，我在摸CHO的G418筛选浓度，梯度为400-1200 ug/ml想问24孔板应该先种多少CHO细胞啊？每孔加入500ulG418后，隔天就换液吗？
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50%种上2天换液吧谢谢回答，好感动。但是24孔板长满大概要20万个以上，意思是我铺的时候就铺10万吗？
会不会太多，我看有的说铺1000
有的说20000，变化好大啊。
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筛选这样的实验我不数细胞的一般这样一皿=2瓶,1瓶=2个6孔板=2个24孔板所以按1瓶细胞（corning）传4瓶的比率铺板就是1/4铺一个24板，然后你要是用6个孔 就是1/24细胞另外 质粒带荧光吗？细胞对G418很容易耐药 也就是说一半克隆都是耐药 而不是转了基因 我的质粒带红色荧光。 我先做个预实验，确定G418的筛选浓度，24孔板每孔2万个，可是筛了3天，发现细胞长满了，没怎么死，所以担心这种情况是不是因为初始细胞太多了
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shylook 筛选浓度你怎么订的？ 我用配置了400，500,600---1200ug/ml
浓度的G418，分别处理CHO，每个浓度2个复孔
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六年一世 CHO铺24孔板，1-2*10^5细胞/孔G418浓度在800-1000左右，低于800你基本不用试了
谢谢回复啦~~~
20万个每孔种下后，第二天就会长的比较满了吧，会不会影响G418的作用
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六年一世 CHO铺24孔板，1-2*10^5细胞/孔G418浓度在800-1000左右，低于800你基本不用试了感谢您的帮助，我筛出了CHO细胞的 G418浓度。现在准备转染后加药筛选稳转系。可是看资料上说要在6孔板内 转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近汇合时按1：4密度传代，继续培养，待细胞密度增至50％～70％汇合时加药筛选。想问下，为什么转染后要传代呢，且等到密度达到50-70%再加药呢十分困惑，希望得到你的帮助
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六年一世 目的基因从导入细胞到成功的表达需要一段时间，在这段时间里面细胞状态比较脆弱且没有G418抗性，因此转染后不能很快加药筛选。资料说的也是这个意思，但不是一定要传代且密度到达50%不可。我们一般是转染48h后就加药，筛选过程中根据细胞状态来换液或者传代了解了，谢啦
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关于丁香园第1页/共2页
一、 将TZM-bl细胞以1000个/孔的密度接种到96孔板中。
24 h后，弃去旧的培养基，分别用含有200 μg/mL、400 μg/mL、
800 μg/mL、16 000 μg/mL、 3200 μg/mL G418的DMEM培养细胞。 2.
G418储液浓度为500mg/mL=500μg/μL，先用DMEM培养基将其稀释为50μg/μL的工作液。
每个剂量组做三个复孔，每孔加入100μL含有G418的DMEM培养基，每次准备的各个剂量DMEM培养基按500μL计算，一次性配制10次的培养基量，为5000μL。对照组，加入100 DMEM培养基
第1页/共2页
寻找更多 ""G418如何配制、浓度筛选
G418通过抑制转座子Tn601，Tn5 的基因,干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成，当neo基因被整合进真核细胞DNA后
,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA ,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达
,使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长
Q：G418怎么配制？
A：我觉得不能用水配，因为这样PH会变化很大，至少要用PBS。我是配在HEPES溶液中的，具体方法如下：1g包装的G418瓶子中，加入10ml
HEPES溶液，浓度为100 mg/ml完全溶解后，0.22 um过滤，－20度保存。HEPES缓冲液配方如下：90 ml
水中，0.8 g NaCl, 0.037 g KCl, 0.0135 g Na2HPO4.2H2O, 0.1 g 葡萄糖，0.5 g
HEPES,溶解，NaOH调PH至7.05,定容至100ml。
Good answer:
推荐用HEPES。特别是当细胞对G418不敏感，G418使用浓度高时，如果用水、PBS配置，会极大的改变细胞培养基的pH值，影响细胞的生长。1mol/L
HEPES的简单配置：HEPES
11.91g，溶解于40ml的ddH2O，用10mol/L的NaOH调节pH至7.5-8.0，定容至50ml，0.22um小滤器过滤。HEPES最终使用浓度15-20mM。
G418的配制： 取1g G418溶于1ml
1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，0.22um过滤消毒。4°保存能保存12个月、-20°保存时间更长。
G418筛选要做预试验确定最佳浓度，将细胞稀释至1000cell/ml，每孔100ul加入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0,,100,
200,300, 400,500, 600,700, 800,900, ng/ml等１2个级别,
培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准，一般400-８００左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。
中国仓鼠卵巢细胞700～800ug/ml
一般加入G418后细胞不会立即死亡，还会再传两代，通常第3天以后高浓度组会出现死亡。如果你的药设的浓度偏低或者你的细胞耐受G418的能力比较强，的确存在一个贴壁细胞接触抑制而死亡的问题，所以要考虑细胞种板时的数目。
我做的是悬浮细胞的G418筛选，24孔板每孔只种1000个，这样既可以保持两周不换液，且低浓度组不会长过。
贴壁细胞虽然不存在换液困难的问题，但是应该也要考虑种板数的，不然低浓度组的细胞真的可能会因为长的过满而导致死亡，这样最后就不知道细胞到底是不是因为G418而死的了。
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以上网友发言只代表其个人观点，不代表新浪网的观点或立场。细胞库/细胞培养
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确定G418最佳筛选浓度用什么细胞
确定G418最佳筛选浓度用什么细胞
来源：互联网
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tjmedwnn：确定G418最佳筛选浓度用什么细胞？大家好，我现在做实验，用G418抗性的逆转录病毒包装系统收获病毒液做稳定转染，第一步需要用PT67细胞包装收获病毒液，说明书上说质粒转入PT67细胞后要用G418做筛选，之前需要用不同浓度的G418做一个最佳筛选浓度试验。请教大家，用来做确定最佳浓度试验的PT67细胞是用未经过任何处理的PT67细胞呢还是用已经转染过的PT67细胞？？另外收获病毒液后我需要用其转染干细胞，转染后同样需要用G418筛选，问题同上，首先做确定最佳G418浓度试验，那是用未经过处理的干细胞做还是经过转染的干细胞来做浓度确定试验啊！我的师兄说是用转染过以后的PT67和干细胞来做最佳浓度确定试验，我不大理解，请大家指教啊！谢谢了。。。。丁香园网友little_snow认为：PT67转染前就要用G418筛选出临界死亡浓度，转染后用筛出的G418的死亡浓度培养，再挑出克隆，做病毒滴度丁香园网友tjmedwnn认为：那就是说两次筛选都是用没有经过任何处理的PT67和干细胞来确定最佳G418筛选浓度了，是这样吗？丁香园网友little_snow认为：应该是三次，测病毒滴度的细胞（如NIH3T3）也要确定G418的筛选浓度。每种细胞对G418的敏感性不同，不同厂家不同批次的G418对细胞的敏感性也不同。理论上讲，配一次G418，都要重新做过浓度筛选。
相关实验方法
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