PCR技术的几点思考
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DNA解旋酶能降低DNA双链解成单链的活化能，在解旋酶的催化作用下，由ATP提供能量,在生物体内的温和条件下就能使DNA的双链解成单链。在没有酶的催化作用下，就必须由外界提供更多的能量才能使DNA分子活化，当在体外加热到90℃—95
℃，DNA分子就由常态转化为活跃状态，双链则解成单链。所以PCR技术不需要解旋酶。
二、PCR技术加入的原料是dNTP（脱氧核苷酸三磷酸）,为什么不是四种脱氧核苷酸？
在细胞内，DNA的复制需要四种脱氧核糖核苷酸作为原料，而PCR技术扩增目的基因需要的原料却是dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）（脱氧核苷酸三磷酸）。实际上，在PCR技术中，DNA复制时直接参与合成DNA的是四种脱氧核苷酸三磷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP），在
DNA聚合酶催化作用下，引物或者已合成的DNA链的3’—羟基对进入的脱氧核苷酸三磷酸α—磷原子发生亲核攻击，从而形成3’，5’—磷酸二酯键并脱下焦磷酸（PPi），形成磷酸二酯键所需要的能量来自α—与β—磷酸基之间高能磷酸键的裂解。而在生物体内脱氧核苷酸在磷酸激酶的催化下接受
ATP提供的磷酸基，逐步转化为脱氧核苷酸二磷酸、脱氧核苷酸三磷酸后再参与DNA的合成。所以二者并不矛盾，用dNTP作原料在体外利用PCR技术扩增目基因简化了操作过程。
三、引物用DNA片段还是RNA片段？
在细胞内，DNA复制时的引物是DNA转录形成的RNA片段。而在PCR技术中，可以使用人工合成的单链DNA片段作为引物比较方便。
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利用PCR技术(获取并)扩增目的基因
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浅谈PCR技术在微生物检测中的应用前景
2013年第4期目录
&&&&&&本期共收录文章20篇
　　摘要： 中国论文网 /8/view-4070429.htm　　PCR技术是一种体外扩增特定DNA序列的方法。该技术以其高特异性和灵敏度等优点已广泛用于各领域。本文主要对PCR技术的原理及其在一次性使用卫生用品微生物检测的应用前景等方面进行综述。 　　关键词：PCR技术；卫生用品；微生物；检测 　　Abstract：PCR technique is a method of amplification of specific DNA sequence in vitro. This technology has been widely used in various fields for its high specificity and sensitivity. The principle of PCR technology and the prospects of application of PCR technique in microbial detection were reviewed in this paper. 　　Keywords：PCR Technique；Sanitary Products；Microbe；Detection 　　随着科学研究的进步，各种新技术不断形成且广泛应用于各个领域。人们对一些生物指标的检测手段也进入到了一个新阶段，分析研究对象更多的是选择了DNA、蛋白质等物质。PCR（Polymerase Chain Reaction）技术以其高特异性和灵敏度等优点，已广泛用于医学检验、水产养殖、环境监测及其他与DNA鉴定相关的领域。本文主要对PCR技术的原理及其在一次性使用卫生用品微生物检测的应用前景等方面进行综述。 　　1 PCR技术原理 　　PCR即聚合酶链式反应，是一种体外扩增DNA序列的技术。现代PCR概念最早是由美国科学家Kary Mullis于20世纪80年代早期发明的，他也因此荣获了1993年的诺贝尔化学奖。如今该技术已成为生物前沿技术之一。 　　PCR技术的基本原理类似于细胞内DNA的复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。简单来说PCR包括变性—退火—延伸三个基本反应阶段。其基本过程为：①检测样品经预处理后获得DNA模板；②DNA模板的变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离后成为单链，以便它与引物结合，为其后阶段反应做准备；③模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，这时人工合成的引物与模板DNA单链经互补序列配对结合；④引物的延伸：DNA模板—引物结合物在耐热DNA聚合酶的催化作用下，以4种三磷酸脱氧核苷酸为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原则，合成一条新的与模板DNA 结构组成相同的新链。重复循环变性—退火—延伸三过程，就可获得更多的新链，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，一般单一拷贝的基因循环25～30次DNA便可扩增l00万～200万倍。PCR反应产物再通过凝胶电脉和基因测序等DNA分析技术确定扩增DNA序列的具体信息[1-4]。 　　2 PCR技术在微生物检测的应用前景 　　依据一次性使用卫生用品卫生标准（标准号：GB 1）中的微生物指标规定，在一次性使用卫生用品中是不能有大肠杆菌以及3种致病性化脓菌（绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌）的检出。该要求是对4种菌的定性检测，标准中用到的检测方法是传统的微生物鉴定法，先通过增菌或分离培养，然后进一步根据各菌群特征做一些鉴定试验，最后综合各项结果判断。通常这种传统的检测方法时间较长，而且在菌量少的情况下易出现假阴性的结果。而在环境监测、食品检测等领域中已经应用的PCR技术则可缩短检测所消耗的时间，且敏感性更高。 　　2.1 大肠杆菌的检测 　　相关研究显示，通过大肠杆菌特异性引物（上游引物：5’-tgt tca gtg gca aga gtt-3’ ，下游引物：5’-taa tcg ata tac ccg ctc-3’）进行PCR扩增可以检出饮用水中的大肠杆菌，即使在菌量极低的情况下也可以检出[5]。但该研究还发现对于不能够破坏微生物DNA的消毒方法会造成PCR检测的假阳性，而GB 1中对一次性使用卫生用品所使用到的消毒方法通常为环氧乙烷消毒、电离辐射消毒和压力蒸汽消毒。而这几种灭菌方法都会直接破坏微生物的核酸，因此PCR技术用于检测一次性使用卫生用品中致病菌有可行性。 　　2.2 绿脓杆菌的检测 　　相关研究表明使用绿脓杆菌外毒素A（ETA）基因作为模板来快速检测绿脓杆菌。ETA基因仅在绿脓杆菌基因组中存在，且Gray[6]等人已经从一个过量表达ETA的绿脓杆菌菌株中克隆和测定了ETA的结构基因。因此ETA基因可以作为检出绿脓杆菌的靶基因。根据ETA基因序列设计特异性引物，通过PCR反应扩增目的基因序列，如果能够扩增出目的条带，那就能据此来确定绿脓杆菌的存在[7]。 　　2.3 金黄色葡萄杆菌和溶血性链球菌的检测 　　PCR技术用于检测金黄色葡萄球菌的研究多数是关于食品卫生。张亚兰[8]的研究将PCR的反应做了优化，消除了一些会影响PCR反应的抑制因素，从而提高检测方法的灵敏度。同时应用PCR技术检测链球菌的研究数据显示这种方法具有可行性[9-10]。 　　3 PCR技术在应用过程中可能存在的问题 　　PCR技术具有较强的灵敏度、准确度和特异性。此外，与传统的微生物检测法相比PCR技术能缩短检测时间，但同时将该技术引进到卫生用品的检测也存在一些问题。首先，由于检测样品是卫生用品，在样品的预处理、样品DNA的提取等具体的操作过程中可能会遇到不同的问题；其次，尽管PCR反应的步骤很简单，但是具体的操作是复杂的，如退火温度的确定、延伸时间的长短以及循环数等。因此不同的反应体系应该确定适当的反应条件以避免假阴性或假阳性等情况的产生。所以要引入PCR技术来检测卫生用品中的微生物，需要进行预试验，完善检测方法。 　　参考文献： 　　[1] 梁长余.简介PCR技术[J].生物学教学，2002， 37（4）： 66-68. 　　[2] 李惠民.PCR技术在环境检测中的应用[J]. 商洛师范专科学校学报，）： 37-39. 　　[3] 金宇良.PCR技术的研究进展[J].现代农业科技，2012，（10）：47-48. 　　[4] 柳洪芳，宋慧.PCR及其改进技术在食品微生物检测中的应用[J].现代化农业，2012， （1）： 34-36. 　　[5] 马颖，龙腾锐，方振东.PCR技术监测饮用水中大肠杆菌[J].中国给水排水，）： 93-95. 　　[6] Gray GL ， Smith DH， Baldridge JS， et al. Cloning nucleotide sequence， and expression in Escherichia coli of the exotoxin A structural gene of Pseudomonas aeruginosa[J]. Proc Nat l Acad Sci USA， 1984， 81（9）： . 　　[7] 张伟，李闻， 张伟尉，等. 基于PCR技术的绿脓杆菌快速检测方法研究[J]. 中国卫生检验杂志， 2005， 15（9）： . 　　[8] 张亚兰.肉制品中金黄色葡萄球菌的PCR技术检测方法研究[J].分析与检测， 2008， （5）： 108-110. 　　[9] 朱水荣， 王志刚， 杨婷婷，等. Taqman-MGB双重探针PCR技术检测89K毒力岛猪链球菌2型[J]. 中国人兽共患病学报，2009， 25（5）： 434-438. 　　[10] 贺生中， 杜改梅， 张志成，等. 应用PCR技术检测患乳房炎奶牛生乳中的无乳链球菌[J]. 金陵科技学院学报，）： 92-94. 　　（作者单位：广州市纤维产品检测院）
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xzbu发布此信息目的在于传播更多信息，与本网站立场无关。xzbu不保证该信息（包括但不限于文字、数据及图表）准确性、真实性、完整性等。　　报道：最近，加州大学伯克利分校的生物工程学家，开发出一种新技术，通过用一种光开关，加速遗传学样本的加热和冷却，有望使PCR这种实验室主力工具更便宜、更方便，并将其速度提高很多倍。
研究人员在七月三十一日的Nature子刊《Light: Science & Application》描述了这种涡轮增压热循环，其显著扩大了聚合酶链反应（PCR）试验的临床和研究应用，可在几分钟而不是一个小时或更多的时间内得出结果。相关研究结果：。
PCR检测――扩增一段DNA序列的单拷贝以产生数千到数百万个拷贝，在基因组学应用中已经变得很重要，从克隆研究到法医分析到亲子鉴定。PCR技术被用于遗传性和传染性疾病的早期诊断，并用于木乃伊和猛犸象古DNA样本的分析。
1993年，Kary Mullis和Michael Smith因为发明了PCR试验，获得了当年的诺贝尔化学奖，自那以后，PCR对现代科学的巨大冲击已经是公认的。
使用发光二极管（LEDs），加州大学伯克利分校的研究人员能够加热金薄膜和DNA溶液界面处的电子。他们能够以每秒55度的速度加热反应溶液。冷却速度同样令人印象深刻，每秒钟大约43.9度。
本研究资深作者、生物工程教授Luke Lee说：“PCR技术是强大的，它已被广泛应用于许多领域，但是，现有的PCR系统是比较慢的。通常是在实验室完成的，因为用于这一实验的常规加热器，需要大功率，并且是昂贵的。研究人员往往需要一个小时或更长的时间来完成每一次测试，因此将其用于点护理诊断是不实用的。我们的系统可以在几分钟内产生结果。”
传统PCR试验的速度较慢，是因为它需要时间来加热和冷却DNA溶液。PCR检测需要重复的温度变化――在三个不同温度平均进行30次热循环，才能扩增出基因序列，这个过程涉及打断双链DNA，并将匹配引物与单链结合。随着每个冷热周期，DNA样品的量加倍。
为了加快这种热循环的步伐，Lee和他的研究团队利用等离子体，或光和自由电子在一块金属表面的相互作用。当暴露在光线下的时候，自由电子会很兴奋并开始振荡，从而产生热量。一旦光被关闭，振荡和加热就会停止。
事实证明，金因其离子体光热加热，是一种受欢迎的金属，由于它能如此有效地吸收光。它还有利于生物系统的惰性，因此，可以用于生物医学应用。
在他们的实验中，研究人员使用了120纳米厚的金薄膜，或者大约一种狂犬病病毒的宽度。将金沉积在一个具有微流体井的塑料芯片上，将包含有DNA样本的PCR混合液保持在微流体井中。
光源是一组现成的LED，定位于PCR井的下方。蓝色LED的峰值波长为450纳米，被调整到获得最有效的光热转换。
研究人员能够在不到五分钟的时间里，从131度到203度（华氏）进行30个循环。
他们测试了光子PCR体系对样品进行扩增的能力，发现其结果与传统的PCR试验结果吻合的较好。
Lee说：“这个光子PCR系统快速、敏感，且低成本。它可以被整合到一种超快的基因组诊断芯片中，我们正在进行研发。因为这项技术可产生点的测试结果，所以我们可以将其用于许多各种各样的设置，从非洲农村到医院急诊室。”
（：王英）
注：《Light: Science & Applications》是由长春光机所主办、与自然出版集团（Nature Publishing Group,简称NPG）合作出版的中国第一本开放获取的光学期刊，2014年它获得了自创刊以来的首个影响因子：8.476，在JCR收录的82种光学类期刊中排名第四位。
推荐原文摘要：Ultrafast photonic PCRAbstract: Nucleic acid amplification and quantification via polymerase chain reaction (PCR) is one of the most sensitive and powerful tools for clinical laboratories, precision medicine, personalized medicine, agricultural science, forensic science and environmental science. Ultrafast multiplex PCR, characterized by low power consumption, compact size and simple operation, is ideal for timely diagnosis at the point-of-care (POC). Although several fast/ultrafast PCR methods have been proposed, the use of a simple and robust PCR thermal cycler remains challenging for POC testing. Here, we present an ultrafast photonic PCR method using plasmonic photothermal light-to-heat conversion via photonCelectronCphonon coupling. We demonstrate an efficient photonic heat converter using a thin gold (Au) film due to its plasmon-assisted high optical absorption (approximately 65% at 450 nm, the peak wavelength of heat source light-emitting diodes (LEDs)). The plasmon-excited Au film is capable of rapidly heating the surrounding solution to over 150 °C within 3 min. Using this method, ultrafast thermal cycling (30 heating and cooling rate of 12.79±0.93 °C s−1 and 6.6±0.29 °C s−1, respectively) from 55 °C (temperature of annealing) to 95 °C (temperature of denaturation) is accomplished within 5 min. Using photonic PCR thermal cycles, we demonstrate here successful nucleic acid (λ-DNA) amplification. Our simple, robust and low cost approach to ultrafast PCR using an efficient photonic-based heating procedure could be generally integrated into a variety of devices or procedures, including on-chip thermal lysis and heating for isothermal amplifications.
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