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PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列.因此,引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否.要设计引物首先要找到DNA序列的保守区.同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构.如这个区域单链能形成二级结构,就要避开它.如这一段不能形成二级结构,那就可以在这一区域设计引物.现在可以在这一保守区域里设计一对引物.一般引物长度为15~30碱基,扩增片段长度为100~600碱基对.让我们先看看P1引物.一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%.而且四种碱基的分布最好随机.不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在.否则P1引物设计的就不合理.应重新寻找区域设计引物.同时引物之间也不能有互补性,一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补.引物确定以后,可以对引物进行必要的修饰,例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等,这对扩增的特异性影响不大.但3′端绝对不能进行任何修饰,因为引物的延伸是从3′端开始的.这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位,因为密码子第3位易发生简并,会影响扩增的特异性与效率.综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则：① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性.② 产物不能形成二级结构.③ 引物长度一般在15~30碱基之间.④ G+C含量在40%~60%之间.⑤ 碱基要随机分布.⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补.⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补.⑧ 引物5′端可以修饰.⑨ 引物3′端不可修饰.⑩ 引物3′端要避开密码子的第3位.PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列.如前述,引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否.对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功,但遵循某些原则,则有助于引物的设计.1.引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源.2.避开产物的二级结构区某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响,选择扩增片段时最好避开二级结构区域.用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构,有助于选择模板.实验表明,待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时,扩增往往不能成功.若不能避开这一区域时,用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的.3.长度寡核苷酸引物长度为15~30bp,一般为20~27mer.引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T+,Ln值不能大于38,因为>38时,最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性.4.G+C含量G+C含量一般为40%~60%.其Tm值是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度,有效启动温度,一般高于Tm值5~10℃.若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳.5.碱基础随机分布引物中四种碱基的分布最好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在.尤其3′端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发.6.引物自身引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性.这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合.若用人工判断,引物自身连续互补碱基不能大于3bp.7.引物之间两引物之间不应不互补性,尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成.一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性.8.引物的3′端引物的延伸是从3′端开始的,不能进行任何修饰.3′端也不能有形成任何二级结构可能,除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中,引物3′端不能发生错配.在标准PCR反应体系中,用2U Taq DNA聚合酶和800μmol/L dNTP（四种dNTP各200μmol/L）以质粒（103拷贝）为模板,按95℃,25s；55℃,25s；72℃,1min的循环参数扩增HIV-1 gag基因区的条件下,引物3′端错配对扩增产物的影响是有一定规律的.A∶A错配使产量下降至1/20,A∶G和C∶C错七下降至1/100.引物A：模板G与引物G：模板A错配对PCR影响是等同的.9.引物的5′端引物的5′端限定着PCR产物的长度,它对扩增特异性影响不大.因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性.引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等.10.密码子的简并如扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增特异性与效率.特殊目的的引物设计将在有关章节讨论.随着人们对引物的认识,一些引物的计算机设计程序也应运而生,下面将讨论有关引物计算机设计方法.现有的引物设计软件有primer5.0比较好.
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扫描下载二维码检测人bk病毒核酸的引物与荧光探针及其应用的制作方法
专利名称检测人bk病毒核酸的引物与荧光探针及其应用的制作方法
技术领域本发明涉及一套检测人BK病毒核酸的引物和荧光探针，及其在制备人BK病毒核酸的荧光定量检测试剂盒中的应用。
背景技术多瘤病毒属于乳多空病毒属。其中BK病毒(BKV)的原发感染主要在儿童期，可以无症状或仅有轻微的呼吸道症状。以后病毒停留在肾脏进入潜伏状态，但BKV具有高传播性、低致病性的特点。在肾移植病人，多瘤病毒的潜伏感染率较高。约10% 60%的健康肾移植患者有可能出现无症状的多瘤病毒复活，常常是间隙性的，且不影响肾功能。但如果病毒持续大量复制可以导致肾小管上皮细胞溶解、坏死，并出现基底膜的裸露，从而进入血液循环。病毒血症表明病毒处于极度活跃状态，有进一步导致移植物损害的危险。当病毒血症持续发展，BKV不断在靶细胞就可能导致BKV相关性肾病(BKVAN)。目前对BK病毒的检测多采用PCR方法，本专利则根据该BK病毒VPl基因序列设计荧光定量PCR引物和荧光探针，采用本套引物和MGB探针的TaqMan荧光定量PCR技术使得人们可以在利用PCR高灵敏性的情况下，对BK病毒进行实时精确定量检测，不仅解决了 PCR的定量问题，而且还大大提高了病毒检测的特异性。
本发明目的是提供一种可应用于TaqMan荧光定量PCR技术检测BK病毒核酸载量的引物和荧光探针，及其在制备人BK病毒核酸的荧光定量检测试剂盒中的应用。本发明采用的技术方案是一套检测人BK病毒核酸的特异性扩增引物与荧光探针，上游引物序列为5，-CAAGAATTCCCCTCCCCAAT-3，；下游引物序列为5，-GTACAGTTACAGCCTCCCACATCA-3，；荧光探针序列为5，-FAM-TGAATGAGGACCTAACCTG-MGB-3，；探针5，端标记FAM荧光基团，3，端标记MGB荧光淬灭基团。在实时荧光定量PCR检测技术出现之前，人们对PCR模板的定量不论是直接PCR 还是竞争性PCR，基本上都要通过PCR产物电泳，再将电泳结果经计算机图像处理，根据电泳条带的亮度来确定最终PCR产物量的多少，或将带标记的PCR产物以ELISA的方式进行检测，再由此推测起始模板的量，但这些方法实际上都属于半定量水平，因为即使PCR条件已最优化，电泳及后续步骤的操作的不稳定性仍会给结果分析带来影响，从而影响定量这一目的。随着实时荧光定量PCR技术的出现，人们可以真正地做到对PCR模板的精确定量， 这种定量不仅保持了常规PCR的高灵敏性，而且由于特异性荧光探针杂交技术的应用，使得被检测基因的特异性大大提高。本发明检测人BK病毒核酸的引物，使得病毒核酸载量的检测敏感性大大提高，另外由于荧光探针的应用，使得其特异性亦大大提高，降低了常规PCR扩增的假阳性率，使得检测者可以在极少的标本中获得足够的信息。本发明还涉及所述的引物与荧光探针在制备人BK病毒核酸的荧光定量检测试剂盒中的应用。所述试剂盒主要包括特异性引物、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA 聚合酶等。该试剂盒关键在于特异性引物和荧光探针的设计，试剂盒中其他组成，可按本领域常规进行选择。为达到定量检测的目的，所述试剂盒还可包括人BK病毒核酸标准品，所述标准品序列如下CAAG AATTCCCCTC CCCAATTTAAATGAGGACCT AACCTGTGGA AATCTACTGA TGTGGGAGGCTGTAACTGTA C。检测时先以梯度浓度的标准品溶液在相同条件下进行检测，绘制标准曲线，根据待测样品CT值，对照标准曲线，即可获知样品中人BK病毒核酸拷贝数。将所述试剂盒应用于人BK病毒核酸的检测时，具体检测方法如下(1)提取样品DNA ；待测样品可以是患者尿液、血液等；(2)荧光PCR扩增检测取PCR缓冲液、DNA聚合酶、脱氧三磷酸核苷混合物、特异性扩增引物和荧光探针配成反应液，加入样品DNA为模板进行扩增反应，反应条件为42°C 逆转录30min ；95°C预变性2min ；95°C，k变性，55°C复性与延伸40s，收集FAM荧光，共40 个循环；(3)结果分析如果有HEX荧光积累，则表示样品中存在人BK病毒；如果没有荧光出现，则表示样品中不存在人BK病毒。定量检测时，则同时以梯度浓度的标准品在相同条件下进行荧光PCR扩增，根据拷贝浓度的对数值与标准品Ct值的关系可绘制得到标准曲线，测得样品DNA的Ct值后，对照标准曲线即可获得样品DNA的拷贝浓度。所述PCR反应条件可按参照本领域常规荧光定量PCR方法，具体的，本发明中PCR 反应条件如下94°C预变性2分钟，94°C 15秒、60°C 45秒，进行40个循环扩增，最后置于 4°C。PCR反应液通常按如下组成配制(终浓度):1XPCR buffer,0. 3 0· 5μ M的引物、0. 1 0. 3μΜ的荧光探针、1 5U的DNA聚合酶、0. 2 0. 4mM的dNTPs，通常取2μ L 的模板，反应总体积通常为20 50 μ L0缓冲液终浓度为1 X，是指缓冲液中各组分在反应体系中终浓度与IXPCR buffer相同。本发明的有益效果主要体现在使用本发明检测人BK病毒核酸的引物和荧光探针对人BK病毒核酸进行检测，敏感性和特异性大大提高，亦降低了常规PCR扩增的假阳性率，可快速作出鉴定，大大减少了人力、物力的耗费。
图1为带有标准品序列的质粒标准品实时荧光定量PCR检测结果；从左至右分别为 Io8Uo7Uo6Uo5Uo4Uo3Uo2Uo1c0PiesZyLfemS (横坐标PCR 循环数；纵坐标为荧光强度)。图2为实时荧光定量PCR标准曲线；标准曲线为Y = -3. 236X lgX+38. 465 ；Y 对应的CT值；X 人BK病毒VP基因的copies。图3为1例临床标本荧光定量PCR检测结果，CT值分别为27. 42，拷贝数分别为 2. 59X IO3Copies/μ L(横坐标PCR循环数；纵坐标为荧光强度)。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1 一、材料病毒基因组DNA提取试剂购自大连宝生物技术有限公司；限制性内切酶购自美国 LTI/Gibco公司，pGEM-T-Easy克隆系统、Taq DNA聚合酶购自美国!Iomega公司，测序试剂、 377型测序仪、9600型PCR仪及7000型定量PCR仪均为美国ABI公司产品。二、引物及探针设计与合成以BK病毒VPl基因序列为模板，使用I^rimer Express (V2. 0，美国ABI公司)软件分析引物和TaqMan-MGB探针位点，并根据同时考虑VPl基因DNA序列情况，从中选择最
佳组合上游引物序列5，-CAAGAATTCCCCTCCCCAAT-3，下游引物序列5，-GTACAGTTACAGCCTCCCACATCA-3，荧光探针序列5，-FAM-TGAATGAGGACCTAACCTG-MGB-3，，均由大连宝生物技术公司合成。三、检测标准品制备患者的尿液标本用病毒DNA提取试剂提取基因组DNA，取5. 0 μ 1做PCR反应模板， 用上下游引物在ΡΕ9600型PCR仪上进行PCR扩增，条件为94°C 5分钟变性，94°C 20秒、 550C 20秒、72°C 20秒进行35个循环扩增，最后于72°C延伸5分钟后置4°C。PCR产物经电泳检测后即用克隆系统插入pGEM-T-Easy克隆载体，并将阳性克隆经测序验证。提取质粒，测定浓度并换算(拷贝数/体积)。标准品序列如下-.CkkGAATTCCCCTC CCCAATTTAAATGAGGACCT AACCTGTGGA AATCTACTGA TGTGGGAGGCTGTAACTGTA C。实施例2 一、标本检测102例肾移植患者尿液标本，采用病毒DNA提取试剂提取基因组DNA，取1. 0 μ L做模板，用检测用上下游引物和荧光探针在ABI公司7000型定量PCR仪上进行PCR扩增。PCR反应液组成如下
1.检测人BK病毒核酸的特异性扩增引物与荧光探针，其特征在于 上游引物序列为5，-CAAGAATTCCCCTCCCCAAT-3，；下游引物序列为5，-GTACAGTTACAGCCTCCCACATCA-3，； 荧光探针序列为5，-FAM-TGAATGAGGACCTAACCTG-MGB-3，； 其中FAM为荧光基团，MGB为荧光淬灭基团。
2.如权利要求1所述的特异性扩增引物与荧光探针在制备人BK病毒核酸的荧光定量检测试剂盒中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述试剂盒还包括人BK病毒核酸标准品，所述标准品序列如下CAAG AATTCCCCTCCCCAATTTAA ATGAGGACCT AACCTGTGGA AATCTACTGATGTGGGAGGC TGTAACTGTAC。
本发明提供了一套检测人BK病毒核酸的引物和荧光探针，及其在制备人BK病毒核酸的荧光定量检测试剂盒中的应用。上游引物序列为5’-CAAGAATTCCCCTCCCCAAT-3’；下游引物序列为5’-GTACAGTTACAGCCTCCCACATCA-3’；荧光探针序列为5’-FAM-TGAATGAGGACCTAACCTG-MGB-3’；使用本发明检测人BK病毒核酸的引物和荧光探针对人BK病毒核酸进行检测，敏感性和特异性大大提高，亦降低了常规PCR扩增的假阳性率，可快速作出鉴定，大大减少了人力、物力的耗费。
文档编号C12Q1/68GKSQ
公开日日 申请日期日 优先权日日
发明者吴忠标, 曾爱平, 林国兵, 郑敏巧, 陈军 申请人:温岭市第一人民医院关注今日：3 | 主题：305580
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【求助】大神们，急问如何在NCBI上查基因序列及引物设计啊？？？
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这个帖子发布于2年零332天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
问题已解决悬赏丁当:2
各位大神：
我也看了好多关于如何用NCBI查基因序列的帖子（基本都是5年前的咯），但是不知道自己查的对不对，查的序列不知道是不是，**高手指点啊。
不知道邀请谁？试试他们
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NCBI、UCSC、Ensemble都可以查基因的序列啊。。个人比较，后两者比较好用，呵呵，鄙人尤其偏好用UCSC。很直观，也很方便
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抽风的地瓜 各位大神：
我也看了好多关于如何用NCBI查基因序列的帖子（基本都是5年前的咯），但是不知道自己查的对不对，查的序列不知道是不是，**高手指点啊。 1.这个问题很简单的,不过是要对NCBI的各个子数据库有点了解.简单地说,你查的基因序列是mRNA.我的经验是在KEGG中找到这个基因的纪录，然后再去看这个基因的信息。比如，我想了解下猪中的IL-8基因的信息。2.引物的设计。根据你的实验目的，是做克隆还是做检测来讲。一般来说，做克隆的话，最好是做亚克隆，直接的克隆出新基因来比较麻烦。检测分rt-prc,qpcr,还分sybr,taqman体系。一般是根据你实验室所用的系统来确定。这可以与师兄师姐请教下。一般的方法是，先是文献检索，后是验证。
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多谢楼上的
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楼上回复的很详细！好人！
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KEGG，主要是分析关联和通路的，UCSC或者Ensembl比这个直观多了呵呵。
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楼上的回复好棒，多谢
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