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【交流】有关神经干细胞原代培养和传代方面的问题
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这个帖子发布于8年零219天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
最近，我开始进入神经干细胞方面的研究。首先是查阅大量神经干细胞培养的方法和protocol，然后进行胚胎12~14天的胎鼠/小鼠神经干细胞培养，7~8天后进行传代，现把在实验中遇到的问题发出，向大家请教，谢谢。具体疑问如下：1、一般胚胎神经干细胞培养原代接种密度是2*10E5/ml，但我的神经干细胞必须达6*10E5/ml，甚至更高，才能出现漂亮的神经球，不知什么原因？2、我的培养液是DMEM/F12+N2+肝素钠+bEGF+FGF+Glu+双抗，有人建议我尽量再加上B27,否则成球不好，我不知两者有什么区别？还有文献加LIF,有什么作用？3、传代时用胰酶硝化37度10 min，再用胰酶抑制剂终止，接种时发现细胞形态与原代细胞不太一样，呈现条索状，且遮光性不好，不知怎么造成？4、传代培养24 h发现所有培养皿“神经球”出现贴壁，更奇怪的是球四周长了很长的绒毛，但中间质地同原代神经球，不知什么原因？因实验需要，急需解决问题，麻烦高手赐教，我先谢@
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我养过多年人、 鼠神经球，试着回答一下。1.
胎鼠/小鼠的胎龄、周龄最重要，一般胎鼠优于新生鼠，早龄胎鼠优于晚龄胎鼠。我一般用E12.5天的端脑，此时神经元发生才刚刚开始，皮质层次大概在10几个细胞左右。取得细胞活力高、生长快，不管高低密度都没问题。如果是E14.5天及之后的，皮质中已有大量postmiotic的分化细胞，最好是低密度接种，否则这些细胞会聚团成球状，干扰真正的前体/神干成球。2.
B27的成分远远多于N2（具体成分见1993年Neuroscience Method中的原文），对细胞的保护性更好（尤其是人的神干），但比N2贵，条件允许的话，建议一直用B27现在invitrogen有几种B27，配方略有不同，我用的是，不含RA的。3.
鼠的神经球传代基本不用酶，纯机械吹打就可。你所见的条索状是由于部分细胞破损，释放的DNA成了球粘附的基质（这好像是胰酶消化特有的现象，其他方法不见）。对于人的神经球，要脆弱一些，需多多炼习手法。经济条件好的话，可试试Sigma的Acctuase，一个相不错的消化酶，有可能在将来取代胰酶，用于这些娇气细胞的消化。4.
培养基换得勤的话，贴壁并不就意味着分化，现在一个趋势大概就是以贴壁取代悬浮吧。我也做过不少尝试，也很成功，但没打算在这方面深究，毕竟这只是方法问题，不是研究的目的。减少贴壁的一个方法是低密度接种，如果以accutase传代的话，基本不会有贴壁问题。这些只是我的经验，欢迎讨论啊。附：B27的具体成分已是invitrogen的专利，可能只有查原文才知道，不过我校没有订此刊。曾经咨询过国外同行，给了一张语焉不详的单子，似乎不太全，也没有标浓度。如果你能找到配方，还请千万分享哈。
可知的是B27包含N2的所有成分，故不必两者都加，太浪费。
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神经干细胞（NS）与胚胎干细胞（ES）在概念上有一个极大的不同。ES是一个单一群体，世界上所有成系的ES，也许或多或少有点差异，但其本质是同一的，在基本概念之下，只有名称的不同，而不能再行分类。而在NS名下，是可以再详细划分类别的，这个类别的第一层次就是成体神干和胚胎神干。成体神干（adult NS)和胚胎神干(embryonic NS)的不同是从内到外的，内涵不同，外延也不同。说到胚胎神干，大概可以追溯到Cajal（1906年与Golgi分享Noble prize）时代，虽然还没有用到stem cell这个词，但其基本理念已经具备了。到1960年代，放射自显影技术用于生物成像，脉冲式3H掺入发现小鼠CNS细胞一共经历11个细胞周期，同时stem cell一词也开始应用于神经发育领域。胚胎神干可再分为几类：1）神经上皮细胞（neuroepithelium cell，NEP)，这是整个中枢神经系统中最早出现的细胞，神经板到神经管的发育就是这类细胞的事件。NEP基本上以对称性分裂增殖为主，其早期子代细胞仍是NEP，使神经管从单层上皮细胞状变为假复层上皮状，其晚期子代细胞为放射状胶质细胞。在小鼠NEP存在的时期大约为E8~E12.2）放射状胶质细胞（radial glial cell)，这是整个CNS所有细胞谱系最直接的干细胞，参与一切最重要的神经发生过程。一直是神经发育学的热点细胞，相关文章很多。现在甚至有人认为一个皮质功能柱中所有的细胞——包括神经元和胶质，都是源于同一个放射状胶质细胞。3）神经嵴干细胞（neural crest cell)，这是生成PNS所有神经细胞的干细胞。神经嵴干细胞是一种极为引人入胜的细胞，它无所不至的迁移能力让它的触角遍布每一寸皮肤（生成皮肤黑素细胞）和脏器（生成感觉神经元和雪旺细胞），强劲有力的分化功能（神经细胞、黑素细胞、面颈部的部分骨骼和肌肉、APUD系统的内分泌细胞，等），使众多干细胞黯然失色。虽然胚胎神干功能强大，也很有趣，但真正使“神经干细胞”这个概念妇孺皆知的却是成体神干。1992年，Rynold实验室发表于Science的文章终结了流行一个世纪的“成体神经系统不可再生”观点。但直到现今，成体神干到底是一个怎样的角色？仍如Avalon 迷雾一样不可捉摸。有一点公认是，成体神干是藏于SVZ或SGZ的一小群星形胶质样细胞，但又与普通星形不同，在应激或损伤刺激下可重新进入细胞周期。所以胚胎神干与成体神干概念不同，形态不同，功能不同。下面附图是给wh2008参考的，贴壁但保持干细胞状态的培养。左侧是小鼠的，20X物镜；右侧是人的，10X物镜。突起肥短，末端可见叶状伪足，高密度时，排列成经典的鱼网状。
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多谢你找到的原文，我长久以来的夙愿啊，哈哈。对你补充问题的几点考虑：1. 其实只要方法得当，从胎鼠到成年鼠都能成功地养出神干。但是现在已经渐渐明确，成体的神干和胚胎的神干是大不相同的，至少在体时两者完全不可同日而语。至于在体外长期培养后是否会变得逐渐相同？目前尚无有报导。所以选择时间还是要根据自己的实验目的来。比如说，你想用胚胎来源的神干来证明成体神干的抗氧化能力，那就得好好考量一下，review会否严格到提出质疑。通常选择12.5天，是因为此时是干扰因素和可操作性的最佳平衡点。更早的胚能取得更纯粹的神干，但太小不好操作；更晚的操作性更好，但分化细胞过多。可以参阅下图CNS发育中各系细胞的发生时间。原文见2. 那就用B27吧，对鼠的神干来说问题不大。（说错了，应该是那就用N2吧，哈）3. 周围已经长了很长的突起，那最好弃之，神干即使贴壁也是形成双极短突，回头我贴张照片给你作参考。4. 以个人经验看，半量换液与全换差别不太大，液量可以较普通细胞培养时多一点。
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通过查找文献和论坛学习，我来回答以上问题，若有不同意见请指正：1、可能与取材部位有关，我取材时范围较大，含有大量的杂细胞，于是必须用大量计数细胞来培养成球；也可能是我培养的NSC的细胞存活下降所致。2、有人说一般神经干细胞原代培养最好用B27，传代后可改用N2（原因有待追究）3、已经订购invotrigen公司的胰酶替代物trypLE TM express，不需进行终止反应，且对神经干细胞损伤不大，增加细胞存活。4、传代细胞贴壁神经球已经发上分化，许多神经干细胞已经从球内迁移出而进行分化，可能与没有半量换液所致，直接用新鲜培养液培养传代。
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我养过多年人、 鼠神经球，试着回答一下。1.
胎鼠/小鼠的胎龄、周龄最重要，一般胎鼠优于新生鼠，早龄胎鼠优于晚龄胎鼠。我一般用E12.5天的端脑，此时神经元发生才刚刚开始，皮质层次大概在10几个细胞左右。取得细胞活力高、生长快，不管高低密度都没问题。如果是E14.5天及之后的，皮质中已有大量postmiotic的分化细胞，最好是低密度接种，否则这些细胞会聚团成球状，干扰真正的前体/神干成球。2.
B27的成分远远多于N2（具体成分见1993年Neuroscience Method中的原文），对细胞的保护性更好（尤其是人的神干），但比N2贵，条件允许的话，建议一直用B27现在invitrogen有几种B27，配方略有不同，我用的是，不含RA的。3.
鼠的神经球传代基本不用酶，纯机械吹打就可。你所见的条索状是由于部分细胞破损，释放的DNA成了球粘附的基质（这好像是胰酶消化特有的现象，其他方法不见）。对于人的神经球，要脆弱一些，需多多炼习手法。经济条件好的话，可试试Sigma的Acctuase，一个相不错的消化酶，有可能在将来取代胰酶，用于这些娇气细胞的消化。4.
培养基换得勤的话，贴壁并不就意味着分化，现在一个趋势大概就是以贴壁取代悬浮吧。我也做过不少尝试，也很成功，但没打算在这方面深究，毕竟这只是方法问题，不是研究的目的。减少贴壁的一个方法是低密度接种，如果以accutase传代的话，基本不会有贴壁问题。这些只是我的经验，欢迎讨论啊。附：B27的具体成分已是invitrogen的专利，可能只有查原文才知道，不过我校没有订此刊。曾经咨询过国外同行，给了一张语焉不详的单子，似乎不太全，也没有标浓度。如果你能找到配方，还请千万分享哈。
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wangbadan 我养过多年人、 鼠神经球，试着回答一下。1.
胎鼠/小鼠的胎龄、周龄最重要，一般胎鼠优于新生鼠，早龄胎鼠优于晚龄胎鼠。我一般用E12.5天的端脑，此时神经元发生才刚刚开始，皮质层次大概在10几个细胞左右。取得细胞活力高、生长快，不管高低密度都没问题。如果是E14.5天及之后的，皮质中已有大量postmiotic的分化细胞，最好是低密度接种，否则这些细胞会聚团成球状，干扰真正的前体/神干成球。2.
B27的成分远远多于N2（具体成分见1993年Neuroscience Method中的原文），对细胞的保护性更好（尤其是人的神干），但比N2贵，条件允许的话，建议一直用B27现在invitrogen有几种B27，配方略有不同，我用的是，不含RA的。3.
鼠的神经球传代基本不用酶，纯机械吹打就可。你所见的条索状是由于部分细胞破损，释放的DNA成了球粘附的基质（这好像是胰酶消化特有的现象，其他方法不见）。对于人的神经球，要脆弱一些，需多多炼习手法。经济条件好的话，可试试Sigma的Acctuase，一个相不错的消化酶，有可能在将来取代胰酶，用于这些娇气细胞的消化。4.
培养基换得勤的话，贴壁并不就意味着分化，现在一个趋势大概就是以贴壁取代悬浮吧。我也做过不少尝试，也很成功，但没打算在这方面深究，毕竟这只是方法问题，不是研究的目的。减少贴壁的一个方法是低密度接种，如果以accutase传代的话，基本不会有贴壁问题。这些只是我的经验，欢迎讨论啊。附：B27的具体成分已是invitrogen的专利，可能只有查原文才知道，不过我校没有订此刊。曾经咨询过国外同行，给了一张语焉不详的单子，似乎不太全，也没有标浓度。如果你能找到配方，还请千万分享哈。
可知的是B27包含N2的所有成分，故不必两者都加，太浪费。谢谢你的经验分享。我还有几个问题请教：1、胎鼠周龄选择，我是参照nature protocol的，但我查找的大多数文献都是孕12.5天，不知这是什么原因？2、我一直不敢用B27，主要是里面含抗氧化剂，而我的实验是研究氧化应激方面的内容，我担心有影响，可能我要改变方案了，必须先把细胞养好，然后再做深入研究。咋办？3、我的神经干细胞已经分化？贴壁，但周围已经长了很长的突起，以后会不会再悬浮？4、传代时有人说要半量换液，这是十分重要吗？我上次没有半量，会不会有这种原因。据说神经球本身也分泌一些生长因子？
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你好，想请问一下你的DMEM+F12的配方，我按照说明配的，加2。438的NAHCO3，可是放在后副20度再拿出来就有析出，培养细胞不行，老污染，谢谢，
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fenglibo1980 你好，想请问一下你的DMEM+F12的配方，我按照说明配的，加2。438的NAHCO3，可是放在后副20度再拿出来就有析出，培养细胞不行，老污染，谢谢，我养细胞已经一个多月了，防止污染我十分注重，否则全盘皆输了，以下是我的防范事项：1、做好细胞室无菌。进入前紫外消毒30 min和操作台消毒30 min；1-2周用消毒液拖地；2、实验者进入后需换无菌鞋、穿无菌衣，并戴口罩、手套、帽子，并对操作台用70%酒精擦台面；3、操作期间，任何操作尽可能在酒精灯旁边，有时要在火焰上灼烧，除含有培养液的枪头等，凡无菌器械接触到污染区和可疑污染区，尽量仍掉。4、实验结束后，操作台用70%酒精擦台面，垃圾及时清除出去，并对操作台和细胞室紫外消毒30 min；5、细胞培养用液一定要注意过滤消毒和高压消毒，对使用器械也要注意消毒。无菌应该是细胞培养成功的关键所在，祝你实验早日成功！
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终于找到B27的具体成分，发现B27基本含有N2中的孕酮、腐胺、胰岛素、转铁蛋白，尽管不含亚硒酸钠，但含有硒，且还含有还原性谷胱甘肽、SOD/CAT等氧化剂等，所以两种附剂只要选择B27就可以了，但做氧化应激相关实验时，需要慎重考虑。具体见文献中第四页中Table 1（1993 Journal of neuroscience research）：
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多谢你找到的原文，我长久以来的夙愿啊，哈哈。对你补充问题的几点考虑：1. 其实只要方法得当，从胎鼠到成年鼠都能成功地养出神干。但是现在已经渐渐明确，成体的神干和胚胎的神干是大不相同的，至少在体时两者完全不可同日而语。至于在体外长期培养后是否会变得逐渐相同？目前尚无有报导。所以选择时间还是要根据自己的实验目的来。比如说，你想用胚胎来源的神干来证明成体神干的抗氧化能力，那就得好好考量一下，review会否严格到提出质疑。通常选择12.5天，是因为此时是干扰因素和可操作性的最佳平衡点。更早的胚能取得更纯粹的神干，但太小不好操作；更晚的操作性更好，但分化细胞过多。可以参阅下图CNS发育中各系细胞的发生时间。原文见2. 那就用B27吧，对鼠的神干来说问题不大。（说错了，应该是那就用N2吧，哈）3. 周围已经长了很长的突起，那最好弃之，神干即使贴壁也是形成双极短突，回头我贴张照片给你作参考。4. 以个人经验看，半量换液与全换差别不太大，液量可以较普通细胞培养时多一点。
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十分感谢你的详细答复，多多交流。
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wangbadan 多谢你找到的原文，我长久以来的夙愿啊，哈哈。对你补充问题的几点考虑：1. 其实只要方法得当，从胎鼠到成年鼠都能成功地养出神干。但是现在已经渐渐明确，成体的神干和胚胎的神干是大不相同的，至少在体时两者完全不可同日而语。至于在体外长期培养后是否会变得逐渐相同？目前尚无有报导。所以选择时间还是要根据自己的实验目的来。比如说，你想用胚胎来源的神干来证明成体神干的抗氧化能力，那就得好好考量一下，review会否严格到提出质疑。通常选择12.5天，是因为此时是干扰因素和可操作性的最佳平衡点。更早的胚能取得更纯粹的神干，但太小不好操作；更晚的操作性更好，但分化细胞过多。可以参阅下图CNS发育中各系细胞的发生时间。原文见2. 那就用B27吧，对鼠的神干来说问题不大。（说错了，应该是那就用N2吧，哈）3. ，那最好弃之，神干即使贴壁也是形成双极短突，回头我贴张照片给你作参考。4. 以个人经验看，半量换液与全换差别不太大，液量可以较普通细胞培养时多一点。想请教您几个问题1.”成体的神干和胚胎的神干是大不相同的“，我猜想的话，两者的增殖能力可能存在差异，不知道是否正确？除了这一点以外，两者最大的不同是什么？2.”神干即使贴壁也是形成双极短突“，的确是这样，神经干细胞的培养方法有两种：一种就是常用的悬浮培养法，另外就是贴壁法，此种方法培养出来的神经干细胞其胞体的确是有突起伸出的，有些还伸的”比较长“。
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神经干细胞（NS）与胚胎干细胞（ES）在概念上有一个极大的不同。ES是一个单一群体，世界上所有成系的ES，也许或多或少有点差异，但其本质是同一的，在基本概念之下，只有名称的不同，而不能再行分类。而在NS名下，是可以再详细划分类别的，这个类别的第一层次就是成体神干和胚胎神干。成体神干（adult NS)和胚胎神干(embryonic NS)的不同是从内到外的，内涵不同，外延也不同。说到胚胎神干，大概可以追溯到Cajal（1906年与Golgi分享Noble prize）时代，虽然还没有用到stem cell这个词，但其基本理念已经具备了。到1960年代，放射自显影技术用于生物成像，脉冲式3H掺入发现小鼠CNS细胞一共经历11个细胞周期，同时stem cell一词也开始应用于神经发育领域。胚胎神干可再分为几类：1）神经上皮细胞（neuroepithelium cell，NEP)，这是整个中枢神经系统中最早出现的细胞，神经板到神经管的发育就是这类细胞的事件。NEP基本上以对称性分裂增殖为主，其早期子代细胞仍是NEP，使神经管从单层上皮细胞状变为假复层上皮状，其晚期子代细胞为放射状胶质细胞。在小鼠NEP存在的时期大约为E8~E12.2）放射状胶质细胞（radial glial cell)，这是整个CNS所有细胞谱系最直接的干细胞，参与一切最重要的神经发生过程。一直是神经发育学的热点细胞，相关文章很多。现在甚至有人认为一个皮质功能柱中所有的细胞——包括神经元和胶质，都是源于同一个放射状胶质细胞。3）神经嵴干细胞（neural crest cell)，这是生成PNS所有神经细胞的干细胞。神经嵴干细胞是一种极为引人入胜的细胞，它无所不至的迁移能力让它的触角遍布每一寸皮肤（生成皮肤黑素细胞）和脏器（生成感觉神经元和雪旺细胞），强劲有力的分化功能（神经细胞、黑素细胞、面颈部的部分骨骼和肌肉、APUD系统的内分泌细胞，等），使众多干细胞黯然失色。虽然胚胎神干功能强大，也很有趣，但真正使“神经干细胞”这个概念妇孺皆知的却是成体神干。1992年，Rynold实验室发表于Science的文章终结了流行一个世纪的“成体神经系统不可再生”观点。但直到现今，成体神干到底是一个怎样的角色？仍如Avalon 迷雾一样不可捉摸。有一点公认是，成体神干是藏于SVZ或SGZ的一小群星形胶质样细胞，但又与普通星形不同，在应激或损伤刺激下可重新进入细胞周期。所以胚胎神干与成体神干概念不同，形态不同，功能不同。下面附图是给wh2008参考的，贴壁但保持干细胞状态的培养。左侧是小鼠的，20X物镜；右侧是人的，10X物镜。突起肥短，末端可见叶状伪足，高密度时，排列成经典的鱼网状。
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wangbadan edited on
4. 培养基换得勤的话，贴壁并不就意味着分化，现在一个趋势大概就是以贴壁取代悬浮吧。我也做过不少尝试，也很成功，但没打算在这方面深究，毕竟这只是方法问题，不是研究的目的。减少贴壁的一个方法是低密度接种，如果以accutase传代的话，基本不会有贴壁问题。非常感谢你的经验分享！还有个问题要请教：请问，如何知道贴壁不一定分化呢？贴壁的细胞还可以是神经干细胞？不知道这个说法是从何而来呢？我正在做小鼠的神经干细胞培养，遇到问题就是很多细胞都贴壁了，有很多分化的，但也有圆形的象克隆一样的贴壁细胞团。神经球长得很慢，不知道该怎么办。请多指教！谢谢！
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zling03朋友可以参看我在上面贴的图。神干贴壁后是有其特殊形态的，一般胞体肥状，略呈长梭形，单个细胞时可见两个突起，通常一长一短，有时短突不甚明显；当高密度时，细胞呈极性排列，较长突起向外伸展，平行或放射状，很少交叉；密度再高的话，细胞就排成网状了。从很多特性来看，从胚胎获取的神干都极为类似在体时的“放射状胶质细胞”。神经球的经典方法已经有15年以上的历史了，经近年方法学的进步，观念的革新，已经认识到悬浮球状生长既非神经干细胞的充分条件，也非必要条件。可以找一下04年之后cell,PNAC等杂志的相关文章。当然如果是初次做的话，球比贴壁的要容易上手，好处理一些，文献也多。至于你养的球状态不佳，如果手法没有问题的话，首先要怀疑生长因子活性好不好，我的bFGF,EGF都是用的PeproTech的。现在最头痛的问题是细胞生长太快，从单细胞到约100微的球只用3－4天，工作量很大。
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非常感谢！我的因子是从STEM CELL TECHNOLOGY. 订的，应该没问题吧？我在神经球长起来以后，没有及时半量换液，不知道是不是这个原因，导致细胞分化。自从细胞分化后，长得就很慢。不知道该怎么半量换液，是不是离心以后留一半培养基然后再加一半新的，再把细胞分散开？真羡慕你，我现在盼啊盼啊，刚有新长起来的球就又有不少贴壁分化了，所以悬浮的球的数量总是不多。本来想冻存些的，看来是不可能了。现在这些不知道该继续养还是扔掉。。。决定再取一次，重新养一批试试。
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wangbadan zling03朋友可以参看我在上面贴的图。神干贴壁后是有其特殊形态的，一般胞体肥状，略呈长梭形，单个细胞时可见两个突起，通常一长一短，有时短突不甚明显；当高密度时，细胞呈极性排列，较长突起向外伸展，平行或放射状，很少交叉；密度再高的话，细胞就排成网状了。从很多特性来看，从胚胎获取的神干都极为类似在体时的“放射状胶质细胞”。神经球的经典方法已经有15年以上的历史了，经近年方法学的进步，观念的革新，已经认识到悬浮球状生长既非神经干细胞的充分条件，也非必要条件。可以找一下04年之后cell,PNAC等杂志的相关文章。当然如果是初次做的话，球比贴壁的要容易上手，好处理一些，文献也多。至于你养的球状态不佳，如果手法没有问题的话，首先要怀疑生长因子活性好不好，我的bFGF,EGF都是用的PeproTech的。现在最头痛的问题是细胞生长太快，从单细胞到约100微的球只用3－4天，工作量很大。您好，我是参照文献所说的分离大鼠的海马神经干细胞，由于没有经验，做了5、6次了。总是失败，很恼火！主要的问题是：得到的干细胞数目少，养不起来，且里面有很多碎片，离心的话细胞碎片和活的细胞还是分不出来！不知道如何纯化！请高手指点！！！
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sdlvyanling02 您好，我是参照文献所说的分离大鼠的海马神经干细胞，由于没有经验，做了5、6次了。总是失败，很恼火！主要的问题是：得到的干细胞数目少，养不起来，且里面有很多碎片，离心的话细胞碎片和活的细胞还是分不出来！不知道如何纯化！请高手指点！！！多读文献多琢磨。你取材是胚胎的还是新生的？新生24小时之后海马干细胞就不好养了
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forem战友：我取的是出生24-48h的幼鼠！你们用的什么培养基？我的是自己买的粉末DMEM/F12通过抽虑配成溶液，然后再加上B27, EGF,bFGF。这样整个过程比较容易污染。有没有直接拿来用的培养基啊?
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最近要做神经细胞的原代培养，浏览了园内很多帖子，受益匪浅。关于培养神经细胞和神经干细胞还有一些疑问:1 神经干细胞分成体干细胞和胚胎干细胞，除了取材的时间不同，培养的方法好像一样？2 如果我想培养原代神经细胞，取材的时间应该是E18－新生24小时，根据Invitrogen的protocol的说法，更早的细胞很难在体外分化成成熟的神经元。可很多人建议用E14.5天，说是细胞的活力强。3 神经干细胞和原代神经细胞的培养，方法上差异不大，神经干细胞多添加了两种生长因子。简化我的问题，如果我养了一盘原代神经细胞，如何证明如它们就是体内的细胞换了个生长地方，而不是由干细胞体外分化的。如果我要做神经干细胞体外分化的过程，如何证明最终得到的成熟神经元是由干细胞分化而来的呢？
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我的神经干细胞一般养5天就用来做实验了，想知道养多少天得到的神经干细胞会比较纯
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yebodavid你好
5天的细胞球多不啊？希望和你交流，很想看你5天的细胞长的啥样。
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不是说原代神经元不能传代吗
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wangbadan 我养过多年人、 鼠神经球，试着回答一下。1.
胎鼠/小鼠的胎龄、周龄最重要，一般胎鼠优于新生鼠，早龄胎鼠优于晚龄胎鼠。我一般用E12.5天的端脑，此时神经元发生才刚刚开始，皮质层次大概在10几个细胞左右。取得细胞活力高、生长快，不管高低密度都没问题。如果是E14.5天及之后的，皮质中已有大量postmiotic的分化细胞，最好是低密度接种，否则这些细胞会聚团成球状，干扰真正的前体/神干成球。2.
B27的成分远远多于N2（具体成分见1993年Neuroscience Method中的原文），对细胞的保护性更好（尤其是人的神干），但比N2贵，条件允许的话，建议一直用B27现在invitrogen有几种B27，配方略有不同，我用的是，不含RA的。3.
鼠的神经球传代基本不用酶，纯机械吹打就可。你所见的条索状是由于部分细胞破损，释放的DNA成了球粘附的基质（这好像是胰酶消化特有的现象，其他方法不见）。对于人的神经球，要脆弱一些，需多多炼习手法。经济条件好的话，可试试Sigma的Acctuase，一个相不错的消化酶，有可能在将来取代胰酶，用于这些娇气细胞的消化。4.
培养基换得勤的话，贴壁并不就意味着分化，现在一个趋势大概就是以贴壁取代悬浮吧。我也做过不少尝试，也很成功，但没打算在这方面深究，毕竟这只是方法问题，不是研究的目的。减少贴壁的一个方法是低密度接种，如果以accutase传代的话，基本不会有贴壁问题。这些只是我的经验，欢迎讨论啊。附：B27的具体成分已是invitrogen的专利，可能只有查原文才知道，不过我校没有订此刊。曾经咨询过国外同行，给了一张语焉不详的单子，似乎不太全，也没有标浓度。如果你能找到配方，还请千万分享哈。
可知的是B27包含N2的所有成分，故不必两者都加，太浪费。你好，我用的invitrogen DMEM/F12，b27+EGF+bFGF培养基，用于养人脊髓来源的原代神经干细胞，但生长情况非常的不好，希望可以得到你的指导。1：我的标本来源于医院流产，但不是很新鲜，这个对细胞情况的影响会有多大？2：纯化问题，用胰酶消化对细胞损失太大，但机械吹打又会有太多的组织块杂质，应该怎样中和?3：人的神经干细胞培养周期大概多长，文献报道有很大差别，有说3天就有球，5-7天一传代；也有15天一次传代的，据您的经验来说，是什么样的情况？4：我换液时用1000转离心半量换液，但换液后发现细胞损失非常之大，应该如何操作？5：换液频率据您的经验，应控制在几天为宜?非常感谢，我已论坛短消息您，若可以的话可否Q：，再具体请教！
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有用，谢谢
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楼市图片中的细胞实际上已经在分化了。我做干细胞培养只是在第一代时加如4X的液体，以后的都不用换液，长的很好。
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原代培养时不换液对细胞的影响大吗？如果换液该怎样换？请高手指导，谢谢
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各位老师，我养神经干细胞的时候遇到了问题。每次传代的时候，干细胞球都不能完全吹散，加了Accutase吹打依然效果不明显。我又不敢一直用枪吹，生怕把已经吹下来的干细胞被吹碎。想请教各位老师，有没有什么好的方法。
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本人研一小硕，正在做新生鼠神经干细胞培养，对与原代培养和传代有好多问题需要请教：1、原代培养是悬浮还是贴壁比较好？ 2、原代消化时用机械消化比较好还是胰蛋白酶？浓度多少，消化时间怎么控制3、传代怎么吹打成单细胞悬液？总是吹打不好好多好多问题，希望有人解答，不胜感激
如有志同道合朋友需要讨论请加
备注神经干细胞 望共同进步
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wing00024 各位老师，我养神经干细胞的时候遇到了问题。每次传代的时候，干细胞球都不能完全吹散，加了Accutase吹打依然效果不明显。我又不敢一直用枪吹，生怕把已经吹下来的干细胞被吹碎。想请教各位老师，有没有什么好的方法。我也遇到了同样的问题，accutase加吹打不能使神经球完全散开，吹打太多又怕细胞死掉，哪位大侠知道解决办法？
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我也用了accutase，但是球只是变小而不能 变成单细胞悬液，是不是消化时间太短还是加入的量太少，请问哪位前辈有建议？
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我也遇到了accutase酶消化不彻底的问题
那个大神来解决下？
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我养的是成体神经干细胞，传代24后就有很多细胞贴壁了，而且传代时吹打乐100多下，结果还有好几个球没有被吹散，现在细胞状态很差啊，隐约可以看到些贴壁的已经分化的细胞，形态上有点像神经元，求大神指导
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你好，养原代神经干的时候，如何选择悬浮培养或者贴壁培养，是加入特殊的试剂还是特殊操作？？
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请问：鼠的神经干细胞贴壁培养方法的protocol在哪里有啊？谢谢！
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