四、思考题
1．病毒大小的测量单位及基本形态是什么？
2．病毒包涵体的概念及意义？&
实验二十六& 临床标本的细菌学检验
以下实验内容是前面所学过的细菌学检验的总复习，也是实习前的综合性训练，可作为学生技能考试成绩的依据。每个标本的细菌种类应因地制宜，无法限定，故具体的实验材料、实验方法不作统一要求。&&&
为了培养学生独立思考，灵活分析问题的能力，能顺利地过渡到实习阶段，每次课都采用“学生讨论→制订方案→教师指导→统一要求→独立操作→教师总结”的教学方法。
每个标本检验的大体程序是：（1）参照送检单内容的提示，进行涂片镜检或增菌。根据镜检结果，讨论选用何种分离培养法。（2）观察菌落，涂片镜检，根据菌落特征和菌落涂片镜检结果，讨论下一步采用何种鉴定试验。（3）进行生化反应或其它鉴定试验，并做药物敏感试验。根据鉴定试验结果，讨论如何进行结果报告。（4）写出实验报告。
一、血液标本的细菌学检验
一、实验目的
1．能独立完成血液标本的细菌检验。
2．学会制订临床标本细菌检验的计划，有条不紊地按计划做实验，养成每次都做实验记录的习惯，能全面分析归纳，做出准确的报告。
二、实验材料
1．链球菌（或沙门氏菌、其他细菌）感染的血液标本。
2．血液标本细菌分离鉴定所需的各种培养基、鉴定试验所需的各种试剂及仪器。
3．革兰染液、载玻片显微镜、接种环、药敏纸片、小镊子、培养箱等。
三、实验内容与方法
（一）增菌培养
1．分组讨论，参考送检单内容提示，制订所需培养基种类及检验步骤。
2．按比例把血液标本接种于增菌培养基上。
（二）分离培养
1．观察血液标本在增菌液上的生长现象。
2．取液体培养物涂片染色镜检。
3．根据上述2项特征，讨论拟定下一步计划后选择合适的平板进行接种。
（三）菌落观察、鉴定试验及药敏试验
1．观察平板上的菌落特征。
2．取菌落涂片染色镜检。&&&
3．根据上述2项特征，讨论拟定应选用的鉴定试验（包括试验名称、试剂、方法或培养基名称），然后逐个试验进行操作。同时应做药物敏感试验。
若第三次实验需转种培养后才能做生化反应，则另安排时间做第四次实验，完成整个鉴定过程。
四、实验报告
将检验内容及各步骤检验结果列表，按顺序记录血液检验过程中的每步结果，做出最终报告并报告药敏试验结果。
五、思考题
1．血液标本一般是否需要直接涂片？为什么？
2．使用过抗菌药物的血液标本应如何加拮抗剂于增菌液中？
3．如何分析培养物是否被污染？应怎样才能避免污染？
一、实验目的
1．能独立完成脓液标本的细菌检验。
2．进一步复习巩固病原球菌的鉴定程序。
3．进一步熟练药敏试验的操作。
二、实验材料
1．病原性球菌(或其他化脓性细菌)感染的脓液标本。
2．脓液标本细菌分离、鉴定所需的各种培养基、试剂和仪器。
3．药敏试验所用的培养基、小镊子和药敏纸片。
4．革兰染液、显徼镜、接种环、培养箱等。
三、实验内容与方法
（一）形态检查及分离培养
1．取脓液标本涂片染色镜检。
2．根据镜检结果及送检单内容，讨论制订检验计划，选取合适的培养基进行接种。
（二）菌落观察、生化反应及药敏试验
1．观察平板上的菌落特征。
2．取菌落涂片染色镜检。
3．根据上述2项，拟定可疑菌，列出应做的鉴定试验的名称及生化反应培养基的种类。然后转种生化反应培养基或直接做生化反应。
4．做药敏试验。
（三）继续完成生化反应
1．取生化反应管培养物做生化反应或直接观察生化反应结果。
2．观察药敏试验结果。
四、实验报告
1．将检验内容及各步检验结果列表，按顺序记录脓液检验过程的每步结果。
2．报告脓标本细菌鉴定及药敏试验结果。
五、思考题
1．脓液标本是否都要直接涂片?为什么?
2．脓液标本细菌检验应如何初报？对你这次的脓液标本检验进行初报。
3．怎样做好药敏试验的质控?
一、实验目的
1．能独立进行尿液标本的细菌鉴定过程。
2．进一步复习巩固肠道杆菌或非发酵菌的鉴定程序。
3．学会尿液细菌计数的检查。
4．能娴熟地进行药敏试验。
二、实验材料
1．大肠埃希菌（或变形杆菌、其他肠道杆菌、非发酵菌）感染的中段尿液标本。
2．尿液标本细菌分离、鉴定、菌落计数所需的各种培养基、试剂及仪器。
3．定量接种环，离心机、革兰染液、显微镜、培养箱等。
4．药敏试验用的培养基，药敏纸片，小镊子。
三、实验内容与方法
（一）形态检查、分离培养及菌落计数
1．分组讨论：尿液标本应如何分别进行菌落计数及涂片染色镜检?订出检验计划。
2．尿液菌落计数：常用定量接种环法。
（1）定量接种环的制作：取直径约0．35mm的镍铬电热丝（相当于500W或600W）一小段，制成内径约为1.5mm的接种环。然后用电子分析天平称量法测定沾取量。亦可用此接种环蘸取清水后用滤纸吸干，如此反复，计算出每一接种环的实际沾取量。如100环可将0.1ml清水沾完，则此接种环定量为0.001ml。定量接种环以0.001~0.005ml为宜。太大或太小可适当矫正，以后还需定期较正或更新。
（2）接种方法：用定量接种环沾满一环新鲜原尿，均匀涂布于平板上（平板种类依菌而定）。培养18～24h后，按下式计数菌落。
&&& 每ml尿液菌落数=1环尿液的菌落数×（1／1环尿液的含量（ml））
定量接种环法简便易行，已被多数临床细菌实验室采用。细菌菌落计数尚有倾注平板法等，可视具体情况选用。
如果是检查特殊细菌，如淋病奈瑟菌、结核分枝杆菌等则不需进行菌落计数。
（3）报告方式：尿液菌落计数××/ml。若菌落生长过多不易计数，则报告：尿液菌落计数大于105/ml。
（4）结果分析：革兰阴性杆菌&105/ml，革兰阳性球菌&104/ml有诊断意义，可作为判断泌尿道感染的依据。
但应注意，在以下情况下：①正在使用抗菌药物；②患侧输尿管阻塞；③尿液被过度稀释（大量饮水、补液、使用利尿剂等）；④某些感染的细菌繁殖力低（如肠球菌）等，即使是泌尿道感染，尿液菌落计数也可小于10万，甚至细菌培养为阴性。有报道，泌尿道感染的尿液标本实际上有60％～80％菌落计数小于1万。故定量培养的结果须结合临床表现及所检出的菌类进行分析。
3．取5～7mL尿液放入无菌试管经3000转/分30min离心后取沉渣涂片染色镜检。
4．结合形态特征，讨论如何选用合适的培养基；取尿沉渣接种培养。
（二）菌落观察、生化反应和药敏试验
1．观察平板上的菌落特征。
2．取菌落涂片染色镜检。
3．根据上述2项特征，讨论并拟定可疑菌，列出应做的生化反应（包括名称、试剂、方法、培养基等），然后进行接种或直接取菌落做试验。
4．转种M-H平板做药敏试验。
5．计数定量接种环法的菌落数。
注意：若是化脓性尿液，病人有泌尿系统感染的症状，但常规细菌培养呈阴性者，应考虑特殊细菌如结核分枝杆菌、L型细菌、厌氧菌等感染的可能，采用相应的培养基进行培养。
（三）继续完成生化反应&&&
1．直接观察生化管上培养物的反应结果或按实际情况加试剂后观察反应结果。
2．观察药敏试验结果。
四、实验报告
1．列出检验内容，各步实验结果的表格，按顺序记录尿液检验过程的每步结果。
2．分别报告尿液细菌鉴定、菌落计数及药敏试验的结果。
五、思考题
1．在进行尿液细菌菌落计数时，尿标本的采集及送检应注意什么事项？如何分析尿液细菌培养阳性结果的临床意义?
2．尿液的细菌鉴定与菌落计数的标本处理及接种方法各有何不同?
3．尿液培养出细菌后，如何分析其是否有诊断意义?
一、实验目的
1．能独立完成粪便标本的细菌鉴定。
2．学会按步骤进行志贺菌属或沙门菌属的血清玻片凝集。
3．总结前几次临床标本细菌检验的实验，进一步明确细菌检验程序，更熟练地掌握细菌形态检查、接种培养、无菌操作、生化反应操作等技术。能独立完成常见临床标本细菌检验，准确地做出检验报告。
二、实验材料
1．志贺菌（或沙门菌、其他腹泻病原菌）感染的粪便标本。
2．常规分离粪便标本及被检细菌所需的培养基、生化反应试剂和诊断血清。
3．革兰染液、载玻片、显微镜、接种环、药敏试纸、培养箱等。
三、实验内容与方法
（一）分离培养
分组讨论，按常规检验要求及参考送检单内容提示，订出检验计划，并取粪便标本接种于所选用的平板上。
（二）生化反应及药敏试验
1．观察分析菌落特征，讨论拟定应选择的菌落。
2．取应选择的菌落涂片染色镜检。
3．根据菌落及形态特征，讨论拟定应选择的生化反应管并进行接种。必要时直接取菌落进行试探性玻片凝集试验。
4．转种M-H平板做药敏试验。
（三）继续完成生化反应及血清学诊断
1．直接观察，或根据实际情况加试剂后观察各种生化反应结果。
2．根据生化反应结果，讨论拟定应增加的鉴定试验，如血清玻片凝集（包括诊断血清的种类及操作顺序），然后进行操作。
3．必要时取生化反应管上的菌苔再涂片染色镜检，以证实所菌落是否准确。
四、实验报告
列出检验内容、各步结果两项表格，按顺序记录粪便检验过程的每步结果并做出终报，并报告药敏试验结果。化验单归纳_图文_百度文库
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1 微生物菌种保藏的基拳原理 菌种保藏主要是根据微生物生理生化特点, 人工 创造条件, 使微生物代谢处于不活泼、 生长繁殖受抑 制的休眠状态, 即采取低温、 干燥、 缺氧 3 个条件, 使 菌种暂时处于休眠状态. 一种好的保藏方法首先应能 长期保持菌种原有的优良性状不变, 同时还需考虑到 方法本身的简便和经济, 以便生产上能推广使用[ 妇 .
2 微生物菌种的保藏方法 2 ． 1 定期移植法 亦称传代培养保藏法, 包括斜面培养、 穿刺培养、
液体培养( 保藏厌氧细菌用) 等. 将菌种接种于适宜的 培养基中, 最适条件下培养, 待生长充分后, 于 4 ～ 6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养. 保藏时 间依微生物的种类不同而不同.
此法操作简单, 但保存时间短, 需要经常移种, 易 于变异.只能作为菌种的短期保藏.
2 ． 2 液体石蜡保藏法 亦称矿物油保藏法.选用优质化学纯液体石蜡,
采用以下两种方式进行灭菌：①1 2 1℃湿热灭菌 3 0
m i n , 置 4 0℃恒温箱中蒸发水分, 经无菌检查后 备用.②1 6 0℃干热灭菌 2
h , 冷却后, 经无菌检查后 [ 收稿 日期] 2 0 0 9 — 0 3 — 1 3
【 作者简介】 董 昧 ( 1 9 7 8 - ) , 女, 助工, 从事菌种选育工作.
备用圆.把液体石蜡注入已长好菌的斜面上并高出斜 面顶端 1
c m , 使菌种与空气隔绝.将试管直立, 置低 温( 4 ～6℃)干燥处或室温下保存. 保藏期间应定期 检查, 如培养基露出液面, 应及时补充无菌的液体石 蜡.
此方法简便有效, 保藏时间2 - - ~ i 0年, 可用于丝 状真菌、 酵母、 细菌和放线菌的保藏. 特别对难于冷冻 干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的 担子菌等的保藏更为有效.缺点是必须直立存放, 占 空间大, 不便携带嘲 .某些以石蜡为碳源, 或对液体石 蜡保藏敏感的菌株都不能用此法保藏闯 .
2 ． 3 沙土管保藏法 取 6 0 ~ - - 8 0目河沙, 用吸铁石吸去铁质, 用 1 0 ％ 盐 酸浸泡 2 4
h 后弃盐酸, 用水洗至中性, 将沙子烘干备 用. 取地面下4 0 - - - , 6 0
c m非耕作层贫瘠且粘性较小的 土, 研碎后 1 0 0目过筛并用水洗至中性, 烘干备用. 将 处理后的沙、 土按质量比2： 1 混合. 混匀的沙土分装 入安瓿管或小试管中, 高度为 1
a m左右, 塞好棉塞,
1℃湿热灭菌 3 0
m i n , 无菌检验合格后方可使用.
把制备好的菌悬液分装每支沙土管0 ． 5
m L ,放线菌 和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中. 塞好棉塞放入 盛有干燥剂的容器中, 用真空泵抽去水分.抽检合格 后封口, 存放于低温( 4 - - ． , 6℃) 干燥处保藏, 每隔半年 验证 1 次.
本法方法简便, 设备简单, 适用于产孢子和有芽 孢的菌种保藏, 可保存两年, 但对营养细胞不适用. 由
于在真空干燥过程中,机械力容易造成孢子的死亡,
因此在保藏放线菌和部分真菌的孢子时最好用干法 接种闯 .
2 . 4 真空冷冻干燥保藏法 第 7期
董 昧： 微生物菌种保藏方法
2 ． 4 ． 1 好氧茵冷冻干燥管的制备 安瓿管用 2 9 6 盐酸浸泡过夜,用 自来水冲洗并用 蒸馏水浸泡至p H中性, 烘干后加入脱脂棉塞, 灭菌备 用. 保护剂可选择血清、 脱脂牛奶和海藻糖等. 将培养 好的茵体或孢子加入保护剂制成菌悬液, 分装于安瓿 管中, 每支 0 ． 2
m L .然后放入冰箱冷冻 2
h以上, 达 到一 2 0 ～3 5℃左右.再置于冷冻干燥箱内进行冷冻 干燥直至其中水分被抽干, 时间一般为 8 - - - 2 0
h .将 安瓿管在真空条件下熔封, 低温或常温保藏.
2 ． 4 ． 2 厌氧茵冷冻干燥管的制备 主要程序与需氧茵操作相同, 注意保护剂的选择 和准备,保护剂使用前应在 1 0 0℃的沸水中煮沸 1 5
m i n左右, 脱气后放入冷水中急冷, 除掉保护剂中 的溶解氧.
此法为菌种保藏方法中应用最广泛的, 是国际菌 种保藏机构通常采用的方法之一, 几乎所有的微生物 均可采用此法保藏.适用于菌种长期保存, 一般可保 存数年至十余年翻.方便之处在于因冷冻干燥管无需 低温保藏, 所以运输方便, 但此法所需设备要求高, 操 作复杂, 费用昂贵.
2 ． 5 冷冻保藏法 2 ． 5 ． 1 普通冷冻保藏技术( _ 2 0℃)
将培养好的固体或液体菌种用橡胶塞封口, 置于 普通冰箱中保藏. 这一方法虽操作简单但不适宜长期 保藏.
2 ． 5 ． 2 超低温冷冻保藏技术( - 6 0 ～ - 8 0℃)
将生长至对数生长中后期的微生物细胞, 加入新 鲜培养基使其悬浮,然后加入等体积的2 0 ％ 甘油或 1 0 ％~ - -甲基亚砜作为冷冻保护剂,混匀后分装入冷冻 管或安瓿管中, 于 - 7 0℃超低温冰箱中保藏.若干细 菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏 5 年而活力不 受影响.
2 ． 5 ． 3 液氮超低温保藏法 主要程序与超低温冷冻保藏技术( 一 6 0 ～一 8 0℃)
相同. 需注意分装好的安瓿管在放入液氮前需用控速 冷冻机预冻,冷冻速率以 l℃／ m i n为宜,冷冻到 一3 5℃.如果无控速冷冻机, 可将安瓿管置于- 7 0℃ 冰箱中冷冻4
h , 然后迅速移入液氮罐中保存.使用 时从液氮罐中取出, 立即放置在 3 8 " ' 4 0℃水浴中使 其溶化, 而后直接将其接种到适宜的培养基中即可.
此法存活率高, 稳定性强, 保藏时间长, 是长期保 藏菌种的最好方法.适用于各种菌种的保藏, 特别适 用于难以用真空干燥保藏等方法保藏的菌种翻.此法 需定期向液氮罐中补充液氮,以保证液氮罐中的温 度.
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