感受态细胞的分装必须在超净台价格下吗

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-09-28 03:38 标签： 单人超净台
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电转化注意事项
一、&&制备感受态的菌液收集时间：
1、准确测定OD值：OD在1.2～1.5之间。
1） 为了准确测定OD值，建议将菌液稀释不同浓度测定（1、2、4、8、16倍稀释，看其OD值是否呈线性关系）。每个倍数做3－5个重复，应该可以大致推断OD值是否准确！菌液看上去浑浊，但OD值不高，很可能OD稀释倍数不够！
2） OD值是否测准也可以这样估算：OD600为40左右时，菌体湿重（6000rpm离心5min）约0.95g/10ml。高密度发酵时菌体湿重将相应下降。
2、75ml的菌，经18h左右的培养，最后sorbital洗涤完毕后，50ml离心管里所剩菌体特别浓，需要1ml sorbitol才可溶解为糊状。正常培养的OD在1.2～1.5之间的500ml菌液，收集的感受态也用1ml稀释的，没那么粘稠。可以看看降低培养温度（27摄氏度）或缩短培养时间（12h）。
3、甚至不用转接,直接挑单克隆在50－100mlYPD中摇过夜，效果也很好
二、制备感受态的菌液量
如果只转一个样品，50ml就够了，一般50ml的培养液如果OD值正常的话够做10管感受态的，其他的按比例缩小。用大试管摇5ml菌液，然后取1ml毫升在1.5mlEP管中制感受态，每一步的离心时间30秒就行。整个流程时间短，制备好的感受态用来做转化的效率很高。
山梨醇离心，洗涤的过程之后的重悬的时候注意浓度，不要过于粘稠和稀释。
三、感受态的保存
感受态细胞做好后由于电转化杯还没有处理好等原因，在冰上放几个小时再做可能有一定的影响，尽量马上制备马上转化。如果感受态细胞要保存，不需要加甘油，一般80ul EP管分装，-70 或 -80 摄氏度保存。
另附：酵母GS115点种分离纯化
接种GS115于5ml YPD液体培养基，30℃，200rpm振荡过夜，涂布 YPD平板，30℃培养48 小时，用 YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板，4℃保存。
四、电转化注意点：
1、感受态做好后，最后一次吸出sorbital时，不是直接倒调的，而是用毛细管轻吸出来的，这样可能使剩下的感受态纯净些。
2、最后用毛细管取出100ul出来，加入质粒，混匀！（怕量不够，吸得很多，电转时效果反而不好。 ）
3、电转杯清洁处理:一般先冲洗，洗净；然后浸泡在75%的乙醇中；使用前我们都是放在超净台上，开启紫外，边吹风晾干，边进行紫外照射。电转杯的新包装或重复使用可能对转化率有一定的影响。
4、电击的时候，电压数以及电击时间可以摸索一下，适当增加电压或者延长电击时间都可以。电击条件比如1.5kv，放电4.8～5.5ms。电击所有过程都要尽量在冰上进行，电击时间可以减少一点，设置为5ms左右，电击之后马上加入预冷的山梨醇溶液，转移至EP管，30度静止培养1h。如果菌体悬液浓度比较大的时候，在制备感受态的时候要留心一下操作中的问题了。
5、电击之后，加入1ml的山梨醇，吸入1.5ml的ep管中，置于30度摇床低速培养1h，再涂板。
6、注意的是处理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT单独于-20度保存，可配成100倍的贮备液。
7、转化后1ml用sorbitol重悬的细胞悬液不能全部涂在一块板子上，按标准程序制作的感受态一般3块左右可能比较合适，以干燥后看见一薄层淡淡的白色为宜。转化子会在白色的薄层上长出圆韵、饱满的大菌落的。
五、转化试剂和培养基的正确准备方法
1、MD板子提前几天做好，放在冰箱里，涂板的时候吸收效果会好些。如果是新板子，可能吸收不是太好，板子上有些积层，反而不利于生长。
2、YNB42度水浴一会，然后过滤除菌，YNB是加到培养基里面的，去离子水pH偏低，建议直接用蒸馏水就可以（关系不是太大）。
3、山梨醇，以及无菌去离子水均是冰冻，存放在4度冰箱中
4、一般用10ug以上质粒用SalI酶切，然后直接加乙醇沉淀，70％乙醇洗一遍，约20ul ddH2O重溶。转化效率一般大于100个克隆每ugDNA。有人用LiCl和DTT处理细胞，转化效率很高，可以试试。建议你不要用胶回收kit，回收的DNA可能还有盐，导致电击时放电时间很短。
5个电转化方案
方法一：高效
1.收集菌体
取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP管中，4℃、10000g 离心1min，弃上清，沉淀用无菌水(4℃)洗涤，同样条件下离心，弃上清。
2.菌体处理
加入1ml处理液，室温下放置20min。
0.6M sorbitol
10mM TrisHCl(pH7.5)
3.离心，弃上清，加入1ml 1M sorbitol ，离心，弃上清，
4.用1M sorbitol洗涤二次，到最终体积约为80μl.（菌体太多可适当弃去部分）
5.加入10μl.经过BglⅡ酶切处理的工程质粒，混匀后转入 电击杯中，冰浴5min.
6.电转. 1.5kv，25μF，200Ω条件下进行电转。
7.电击后立刻加入1mL 1M sorbitol，吸出后于30℃培养2h。
8.取一定量涂平板(YPDS + Zeocin，涂布的量分别为100、200微升，剩余的经离心处理后全部涂在一个平板上)
有一点要注意的是处理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT单独于-20度保存，可配成100倍的贮备液。
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随时随地聊科研大肠杆菌感受态细胞的制备与转化实验：在转化实验中,涂平板前需要在37度下振荡培养30-60min大肠杆菌感受态细胞的制备与转化实验：在转化实验中,涂平板前需要在37度下振荡培养30-60min,请说出这一实验步骤的目的?
两个目的：①热激后的大肠杆菌细胞比较脆弱,培养可以恢复细胞的活性；②进一步培养,提高菌液中大肠杆菌的浓度.
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摘要: [关于超净台的问题（实验室细胞大批污染）] 细胞培养的超净台我们实验室的三台是2005年买的最近大家的细胞大面积污染一直找不到原因把可能的原因都排除了液体、操作、枪头……发现台子外面的操作部分有一排灯旁边写的life这是不是显示的是超净台过滤器或者滤膜的寿命啊三台中有两台那一排全亮了有一台还差几个格求大侠指导那一排灯到 关键词:[滤膜 实验室 空气过滤器 感受态细胞 寿命 紫外灯 过滤器]……
细胞培养的超净台
我们实验室的三台是2005年买的
最近大家的细胞大面积污染
一直找不到原因
把可能的原因都排除了
液体、操作、枪头……
发现台子外面的操作部分有一排灯
旁边写的life
这是不是显示的是超净台过滤器或者滤膜的寿命啊
三台中有两台那一排全亮了
有一台还差几个格
求大侠指导
那一排灯到底是什么啊？回复换换感受态细胞吧回复做个平皿培养看看，如果污染的话，那就是超净工作台的原因回复
换换感受态细胞吧 我们不用感受态细胞
谢了回复空气过滤器是有寿命的，用一段时间后需要维护或更换，你们做过检测没啊，时间长了的话说不定是过期了回复空气过滤器 换新的吧回复空气过滤器一般一年更换一次，可以检测一下、回复该换滤膜了，这个要定期检查的回复很可能是滤膜的问题
换一个吧回复先用二楼的方法确认一下问题根源，然后召唤厂家更换滤器（出了问题得不偿失）。回复要换滤膜，或者要清洗。连细胞培养箱的空气过滤的都有使用寿命回复可以从两个方面检查：1、滤膜。2、紫外灯。我们实验室一般2个月清洗一次滤膜，一般累计使用1800小时就更换一次紫外灯。现在实验室运行了二十多年一直没有出现过大面积污染的情况。回复细胞间是玻璃密闭吗~ 会不会墙上长霉菌呢？ 我们遇过回复哦，我们的超净台回头检查一下，怎么换滤膜呢？回复最简单的办法就是先打扫细胞间， 然后用甲醛熏蒸一下，之后基本就没问题了
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