什么是生物分离?与化学分离相比有何特点?
生物分离的基本概念生物分离是从生物材料、微生物的发酵液、生物反应液或动植物细胞的培养液中分离并纯化有关产品（如具有药理活性作用的蛋白质等）的过程,又称为下游加工过程.生物分离过程的主要特点n 常无固定操作方法可循生物材料组成非常复杂n 分离操作步骤多,不易获得高收率培养液（或发酵液）中所含目的物浓度很低,而杂质含量却很高n 分离进程必须保护化合物的生理活性生物活性成分离开生物体后,易变性、破坏n 基因工程产品,一般要求在密封环境下操作.生物分离的一般工艺流程发酵液→预处理→细胞分离→（ 细胞破碎→细胞碎片分离 ）↙→初步纯化→高度纯化→成品加工注：（1）胞内产物需经细胞破碎,细胞碎片分离等步骤；胞外产物则将细胞去除后,对余下的液体即可进行初步纯化.（2）在初步纯化及其以前的各步操作,处理的体积较大,着重于浓缩,称为提取或分离；以后各步为精细的分离操作,着重于纯化,称为精制（或纯化）.生物分离的各阶段的常用方法（1）发酵液的预处理n 加热 n 调pHn 絮凝和凝聚（2 ）固液分离n 沉降n 离心分离n 过滤n 错流过滤（3）细胞破碎n 机械法高压匀浆、高速珠磨、超声波破碎 n 非机械法化学法、酶解法、渗透压冲击法、冻结融化法、干燥法（4 ）初步纯化n 沉淀法n 吸附法n 萃取法n 超滤法（5）高度纯化n 层析亲和层析、凝胶层析、离子交换层析n 电泳n 结晶和重结晶（6 ）成品加工n 无菌过滤n 去热原n 干燥冷冻干燥、喷雾干燥n 制剂生物分离方法的选择依据n 传统生物药物（抗生素）根据具体条件,通过小实验决定,选择时应考虑两个因素.（1）抗生素的理化性质：极性、酸碱性、溶解度等,了解其理化性质,通常利用纸层析和纸电泳的方法.（2）抗生素的稳定性：要了解它在什么样的pH和温度范围易受破坏.纸层析抗生素在某一种溶剂中的Rf值大,表明它在该种溶剂中溶解度大；相反,如Rf值小,则溶解度小.如Rf为零,则说明不能溶解.如抗生素在极性强的溶剂中有较大的Rf值,则表明该抗生素是极性化合物；而非极性抗生素在非极性溶剂中Rf值较大,在极性溶剂中Rf值较小.纸电泳通过纸层析判断为水溶性的抗生素,可用纸电泳法进一步判断其电离性质.电泳结果与样品性质的判断见课本第六页表1-1.生物分离方法的选择依据n 基因工程药物应根据目标蛋白和杂蛋白在物理、化学和生物化学方面性质的差异,如,生物特异性、分子量、等电点值和稳定性等.当几种方法联用时,最好以不同的分离机理为基础,且前一种方法处理过的液体应能适于后一种方法的料液.
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【精品】生物工业下游技术习题(附答案)
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机械法细胞破碎，细胞破碎机
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机械法细胞破壁，IKN细胞破壁机，植物细胞破碎机，细胞破壁的方法，多种细胞破壁法
随着重组DNA技术得到广泛应用以来，生物技术发生了质的飞跃。很多基因工程产物都是胞内物质，必须将细胞破壁，使产物得以释放，才能进一步提取，因此细胞破碎是提取胞内产物的关键步骤，破碎方法的得当与否，直接影响到所提取产品的产量、质量和生产成本。现将近年来常用的几种细胞破碎方法介绍一下。
1. 高压匀浆法
设备是高压匀浆器，它由高压泵和匀浆间组成，美国Microfluidics公司和ATS公司均有产品出售。其破碎机理：细胞在一系列过程中经历了高速造成的剪刀，碰撞以及由高压到常压的变化从而造成细胞的破碎。
存在的问题；较易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性首以及有些亚细胞器，质地坚硬，易损伤匀浆阀，也不适合用该法处理。
2. 高速珠磨法
设备是珠后机，瑞士WBC公司和德国西门子机械公司均制造各种型号的珠磨机，其破碎机下：微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂在搅拌浆作用下充分混合，珠子之间以及珠子和细胞之间和互相剪切、碰撞，促使细胞壁破碎，释出内含物，在珠波分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出，从而实现连续操作，破碎中，生的热量由夹套中的冷却液带走。
存在的问题：操作参数多，一般赁经验估计并且珠子之间的液体损失30％左右。
3. 超声破碎
频高于15-20KHz的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎。其破碎机理：可能与空化现象引起的冲击波和剪切力有关。超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及首种类型等因素有关。
存在问题；超声波破碎在实验室规模应用较普遍，处理少量样品时操作简便，液量损失少，但是超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质变性失活。而且大容量装置声能传递，散热均有困难。
就是用生物酶将细胞壁和细胞腊消化溶解的方法。常用的溶酶有溶菌酶β-1．3-葡聚糖酶、蛋白酶等。
存在的问题；易造成产物抑制作用，这可能是导致胞内物质释放率低的一个重要因素。而且溶酶价格高，限制了大规模利用。若回收溶酶，则又增加百分离纯化溶酶的操作。另外酶港法通用性差，不同菌种需选择不同的酶。
5. 化学渗透法
某些有机溶剂（如苯、甲苯）、抗生素、表面活性剂、金属螯合剂、变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性从而使内合物有选择地渗透出来。其作用机理；化学渗透取决于化学试剂的类型以及细胞壁和膜的结构与组成。
存在的问题；时间长，效率低；化学试剂毒性较强，同时对产物也有毒害作用，进一步分离时需要用透析等方法除去这些试剂；通用性差：某种试剂只能作用于某些特定类型的微生物细胞。
机械法细胞破壁，IKN细胞破壁机，植物细胞破碎机，细胞破壁的方法，多种细胞破壁法
CMD2000系列细胞破壁机的结构：
IKN细胞破壁机是由锥体磨,分散机组合而成的高科技产品。
第一级由具有精细度递升的三级锯齿突起和凹槽。定子可以无限制的被调整到所需要的与转子之间的距离。在增强的流体湍流下，凹槽在每级都可以改变方向。
第二级由转定子组成。分散头的设计也很好地满足不同粘度的物质以及颗粒粒径的需要。在线式的定子和转子（乳化头）和批次式机器的工作头设计的不同主要是因为 在对输送性的要求方面，特别要引起注意的是：在粗精度、中等精度、细精度和其他一些工作头类型之间的区别不光是指定转子齿的排列，还有一个很重要的区别是 不同工作头的几何学特征不一样。狭槽数、狭槽宽度以及其他几何学特征都能改变定子和转子工作头的不同功能。根据以往的惯例，依据以前的经验指定工作头来满 足一个具体的应用。在大多数情况下，机器的构造是和具体应用相匹配的，因而它对制造出最终产品是很重要。当不确定一种工作头的构造是否满足预期的应用。
CMD2000系列细胞破壁机的特点：
① 线速度很高，剪切间隙非常小，当物料经过的时候，形成的摩擦力就比较剧烈，结果就是通常所说的湿磨，转速高达14000转
② 定转子被制成圆椎形，具有精细度递升的三级锯齿突起和凹槽。
③ 定子可以无限制的被调整到所需要的与转子之间的距离
④ 在增强的流体湍流下，凹槽在每级都可以改变方向。
⑤ 高质量的表面抛光和结构材料，可以满足不同行业的多种要求。
利用IKN细胞破碎机，进行海藻细胞破壁，可将细胞破壁率提高到95%以上
机械法细胞破壁，IKN细胞破壁机，植物细胞破碎机，细胞破壁的方法，多种细胞破壁法
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& 1998 - 2006 COOVEE Inc. All Rights Reserved细胞破碎技术_百度百科
细胞破碎技术
细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。 结合重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。
细胞破碎技术破碎阻力
细胞破碎技术细菌
几乎所有细菌的细胞壁都是由肽聚糖（peptidoglycan）组成，它是难溶性的聚糖链（glycan chain），借助短肽交联而成的网状结构，包围在细胞周围，使细胞具有一定的形状和强度。短肽一般由四或五个氨基酸组成，如L-丙氨酰-D-谷氨酰-L-赖氨酰-D-丙氨酸。而且短肽中常有D-氨基酸与二氨基庚二酸存在。 破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度，如果交联程度大，则网结构就致密。
高压连续流细胞破碎效果
细胞破碎技术酵母菌
酵母细胞壁的最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状，覆盖在细纤维上面的是一层糖蛋白，最外层是甘露聚糖，由1,6一磷酸二酯键共价连接，形成网状结构。在该层的内部，有甘露聚糖-酶的复合物，它可以共价连接到网状结构上，也可以不连接。与细菌细胞壁一样，破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。
细胞破碎技术真菌
霉菌的细胞壁主要存在三种聚合物，葡聚糖（主要以β-1,3糖苷键连接，某些以β-1,6糖苷键连接），几丁质（以微纤维状态存在）以及糖蛋白。最外层是α-和β-葡聚糖的混合物，第2层是糖蛋白的网状结构，葡聚糖与糖蛋白结合起来，第3层主要是蛋白质，最内层主要是几丁质，几丁质的微纤维嵌入蛋白质结构中。与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。
细胞破碎技术植物细胞
对于已生长结束的植物细胞壁可分为初生壁和次生壁两部分。 初生壁是细胞生长期形成的。 次生壁是细胞停止生长后，在初生壁内部形成的结构。 目前，较流行的初生细胞壁结构是由Lampert等人提出的“经纬”模型，依据这一模型，纤维素的微纤丝以平行于细胞壁平面的方向一层一层敷着在上面，同一层次上的微纤丝平行排列，而不同层次上则排列方向不同，互成一定角度，形成独立的网络，构成了细胞壁的“经”，模型中的“纬”是结构蛋白（富含羟脯氨酸的蛋白），它由细胞质分泌，垂直于细胞壁平面排列，并由异二酪氨酸交联成结构蛋白网，径向的微纤丝网和纬向的结构蛋白网之间又相互交联，构成更复杂的网络系统。半纤维素和果胶等胶体则填充在网络之中，从而使整个细胞壁既具有刚性又具有弹性。 在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初生壁增加很多，纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规则，而且存在木质素（酚类组分的聚合物）的沉积。因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植物细胞具有很高的机械强度。
细胞破碎技术破碎方法
目前已发展了多种细胞破碎方法，以便适应不同用途和不同类型的细胞壁破碎。 破碎方法可规纳为机械法和非机械法两大类。
细胞破碎技术机械法
高压匀浆破碎法（homogenization）
高压匀浆器是常用的设备，它由可产生高压的正向排代泵（positive displace
用高压原理对细胞进行挤压
nemt pump）和排出阀（discharge valve）组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节。细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在20℃左右。在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。
振荡珠击破碎法 (Skaking Bead)
将等体积的小量组织样品与高密度的ZircoBeads放入可密封的2ml螺旋盖微量管中,再加入缓冲液与稳定成份到1.5ml的体积, 用6500RPM振荡机高速上下振动8秒,休息8秒,再振动8秒即可.此方法是目前最快且一次可处理最多样品的方法. 一台机器最多可以在一天处理2400支样品.对小量且多样的人很方便.
高速搅拌珠研磨破碎法（fine grinding）
研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一起快速搅拌，使细胞获得破碎。在工业规模的破碎中，常采用高速珠磨机 。
超声波破碎法（ultrasonication）
超声波破碎法利用超声波振荡器发射的15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。 超声波振荡器有不同的类型，常用的为电声型，它是由发生器和换能器组成，发生器能产生高频电流，换能器的作用是把电磁振荡转换成机械振动。超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。
细胞破碎技术非机械法
渗透压冲击破碎法（osmotic shock）
渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），由于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。
冻融破碎法（freezing and thawing）
将细胞放在低温下冷冻（约-15℃），然后在室温中融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能，另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。
酶溶破碎法（enzyme lysis）
酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的通透性。溶菌酶（lysozyme)适用于革兰氏阴性菌细胞的分解，应用于革兰氏阳性菌时，需辅以EDTA使之更有效地作用于细胞壁。 真核细胞的细胞壁不同于原核细胞，需采用不同的酶。
化学破碎法（chemical treatment）
采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分。常用酸、碱、表面活性剂和有机溶剂等化学试剂
去垢剂破碎法（detergents）
蛋白质复性利用包含体与细胞碎片的密度差，用离心法将包含体与细胞碎片和可溶性蛋白质分开，获得了干净的包含体，再对包含体溶解复性。这样首先就摆脱了大量的杂蛋白、核酸、热原、内毒素等杂质，使后面的分离纯化简单了。从这个角度上讲，包含体的形成对分离纯化亦有好处。
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第二章 细胞分离与破碎
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