基本内容/小胶质细胞
用碳酸银浸镀法显示的小胶质细胞是中枢神经系统中最小的一种胶质细胞。细胞体呈细长或椭圆，从胞体发出细长而有分支的突起，表面有许多小棘突。常规染色见核细长或三角形，染色较深。电镜下小胶质细胞染色深，核扁平或锯齿状，胞质内溶酶体较多。小胶质细胞数量少，约占全部胶质细胞的5%。此细胞是定居在脑内的吞噬细胞，在炎症刺激下，其抗原性增强，形态伸展，功能活跃。小胶质细胞在脑内各部分均有分布，在灰质中的数量比在白质中的多5倍。海马、嗅叶和基底神经节的小胶质细胞比丘脑和下丘脑的多，而脑干与小脑中最少。对小胶质细胞的起源尚有争议，主要存在两方面的意见：①起源于中胚层，包括起源于脑膜中胚层，毛细血管壁的周细胞(pericyte)或血循环中的单核细胞；②起源于外胚层，认为脑室室管膜附近有一些幼稚且具有变形运动能力的细胞，称阿米巴样小胶质细胞(ameboidmicroglia)，是小胶质细胞的前身。小胶质细胞(microglia)是神经胶质细胞的一种，相当于脑和脊髓中的巨噬细胞，是中枢神经系统(CNS)中的第一道也是最主要的一道免疫防线。小胶质细胞大约占大脑中的神经胶质细胞的20%。小胶质细胞不停的清除着中枢神经系统中的损坏的神经，斑块及感染性物质。无数临床上和神经病理学研究表明激活的小胶质细胞在神经退化类疾病的发病机理中起到十分重要的作用，如帕金森病，多发性硬化和阿兹海默症等。但是过多激活或失控的小胶质细胞会引起神经毒性。他们是促炎因子和氧化应激的重要来源，如肿瘤坏死因子（TNF），一氧化氮，白介素等有神经毒性的物质
万方数据期刊论文
临床神经病学杂志
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第二军医大学学报
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中国康复医学杂志
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贡献光荣榜N-(3-PYRIDINE FORMOXYL)- 3,5-DIMETHYL-1- AMANTADINE OR ITS PHARMACEUTICAL SALT FOR TREATING VASCULAR DEMENTIA
WIPO Patent Application WO/
The invention relates to the application of N-(3-pyridine formoxyl)- 3,5-dimethyl-1- amantadine or its pharmaceutical salt in treating vascular dementia.
Inventors:
XIONG, Xiaoyun (No.151 Hancheng Road, Xi'an, Shaanxi 7, 710077, CN)
熊晓云 (中国陕西省西安市陕西省西安市汉城南路151号, Shaanxi 7, 710077, CN)
SU, Jianying (No.151 Hancheng Road, Xi'an, Shaanxi 7, 710077, CN)
苏建英 (中国陕西省西安市陕西省西安市汉城南路151号, Shaanxi 7, 710077, CN)
TANG, Liu (No.151 Hancheng Road, Xi'an, Shaanxi 7, 710077, CN)
唐柳 (中国陕西省西安陕西省西安市汉城南路151号, Shaanxi 7, 710077, CN)
Application Number:
Publication Date:
03/21/2013
Filing Date:
04/19/2012
Export Citation:
XI'AN LIJUN PHARMACEUTICAL CO., LTD (No.151 Hancheng Road, Xi'an, Shaanxi 7, 710077, CN)
西安利君制药有限责任公司 (中国陕西省西安陕西省西安市汉城南路151号, Shaanxi 7, 710077, CN)
XIONG, Xiaoyun (No.151 Hancheng Road, Xi'an, Shaanxi 7, 710077, CN)
熊晓云 (中国陕西省西安市陕西省西安市汉城南路151号, Shaanxi 7, 710077, CN)
SU, Jianying (No.151 Hancheng Road, Xi'an, Shaanxi 7, 710077, CN)
苏建英 (中国陕西省西安市陕西省西安市汉城南路151号, Shaanxi 7, 710077, CN)
TANG, Liu (No.151 Hancheng Road, Xi'an, Shaanxi 7, 710077, CN)
International Classes:
A61K31/455; A61K9/08; A61K9/14; A61K9/20; A61K9/48; A61P9/10; A61P25/28
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Foreign References:
Other References:
LI YUANYOU ET AL.: 'The Effect of memantine hydrochloride on cognitive function in patients with vascular dementia' CHINESE JOURNAL OF GERONTOLOGY vol. 29, August 2009, pages 2114 - 2115
Attorney, Agent or Firm:
BEIJING HUAKE UNION PATENT OFFICE (Room 2303 HuaShen Hotel, No.5 Xizhimen Wai South Street Xicheng, Beijing 4, 100044, CN)
权利要求书
1、 K3-吡啶甲酰氧基 ) -3, 5-二甲基 -1-金刚烷胺或其可药用盐在制备治疗血管 性痴呆的药物中的应用。
2、 权利要求 1的应用， 其特征在于， 其中 Κ3-吡啶甲酰氧基 ) -3, 5-二甲基-l- 金刚烷胺如式 I所示
3、权利要求 1的应用， 其特征在于， 所述应用针对血管性痴呆病程中延缓病程发 展和改善记忆的应用。
4、权利要求 1的应用， 其特征在于， 所述应用针对减轻多发梗塞性痴呆神经病变 程度， 保护神经元正常功能。
5、 权利要求 1的应用， 其特征在于， 所述应用针对缺血再灌注损伤的保护作用。
6、权利要求 1的应用， 其特征在于， 所述应用针对增加谷氨酸损伤神经元的细胞 活性并增加培养液中神经生长因子 (NGF)和突触素（SYN)水平而减少细胞内钙 浓度以及增加突触长度的作用。
7、 权利要求 1的应用， 其特征在于， 所述应用针对增加 02损伤神经元的细胞活 性作用。
8、 权利要求 1的应用， 其特征在于， 所述可药用盐选自： 盐酸盐、 硝酸盐、 硫酸 盐、 氢溴酸盐、 磷酸盐、 甲酸盐、 乙酸盐、 苯甲酸盐、 苹果酸盐、 马来酸盐或柠 檬酸盐。
9、 权利要求 1的应用， 其特征在于， 所述药物是是任何一种药物制剂形式。
10、 权利要求 1的应用， 其特征在于， 所述药物制剂形式选自： 片剂、 胶囊、 口 服液、 颗粒剂或粉剂。
Description:
N- (3-吡啶甲酰氧基) -3, 5-二甲基 -1-金刚烷胺或其可药用盐治疗血管性痴呆 技术领域：
本发明涉及 N- (3-吡啶甲酰氧基 ) -3, 5-二甲基 -1-金刚烷胺或其可药用盐的 一种新适应症， 即其在治疗血管性痴呆方面的应用。
背景技术：
血管性痴呆是由于脑血管病变引起的痴呆， 如多发性梗塞以及脑出血等， 主 要是由于脑动脉硬化后， 脑血管变窄堵塞， 脑部氧及血液供给不足造成的。 既往 称多发性梗塞性痴呆 （multi-infarct dement ia, 简称 MID)， 新出版的诊断分 类系统都已改称为血管性痴呆 （vascular dementia, 简称 VD)。 VD多见于 60岁 以上伴动脉硬化的老年人， 男性多于女性。血管性痴呆发病率很高， 约 1/4的脑 中风存活者可能发生。 有数据显示， 中国 65岁以上人群痴呆发病率为 3. 9%， 其 中血管性痴呆占半数以上， 严重地影响着老年人的生活质量。
VD 的起病相对较急， 一般是在某次卒中后痴呆症状变得明显。 病程多呈阶 梯式加重。 少数慢性起病的患者， 开始表现为情绪改变， 其后才有记忆和智能损 害。 临床表现主要有以下几方面： 1、 全面的认知功能下降， 包括记忆力、 语言 功能、 视空间能力、 认知功能（计算、 理解、 判断、 抽象思维、 学习能力等）； 2、 脑卒中的症状与体征， 多灶梗塞性痴呆患者多有两次或两次以上的卒中史； 多发 腔隙性； 脑梗死患者常有轻微脑卒中史； 3、 脑卒中与痴呆在时间上有相关性： 卒中后 3个月内发生的痴呆， 认知功能呈突然或阶梯性恶化； 4、 常有强哭、 强 笑及假性球麻痹的表现； 5、常有精神行为异常， 如情绪激动、暴躁、精神混乱、 骂人、 虚构等， 但人格相对保持良好； 6、 常合并有抑郁。
血管性痴呆与老年性痴呆症状极其相似， 临床上常常将二者混为一谈， 老年 性痴呆， 又称阿尔茨海默病， （Alzheimer' s disease, AD), 是一种进行性发展 的致死性神经退行性疾病， 临床表现为认知和记忆功能不断恶化， 日常生活能力 进行性减退， 并有各种神经精神症状和行为障碍。 二者是有区别的： 1、 病因不 同： 血管性痴呆是由于患者的脑动脉出现了粥样硬化， 引起脑部血液流动缓慢， 导致脑组织缺血、缺氧甚至脑梗塞造成的；老年性痴呆的病因目前尚不十分清楚， 临床上多认为该病是由于患者的脑神经细胞变性坏死所致。 2、 病程不同： 血管 性痴呆患者的病程往往具有波动性， 其病情时轻时重， 呈现出一种阶梯型进展的 趋势， 并可出现相对缓解的时候； 该病患者在接受治疗后病情可明显缓解。 而老 年性痴呆的病程往往呈缓慢发展的趋势， 没有相对的缓解期， 其症状相对比较固 定， 无明显的波动性。 3、 以住病史不同： 血管性痴呆患者往往都有高血压、 脑 血管， 粥样硬化等病史； 而老年性痴呆患者有高血压和脑血管病病史的人不多。 4、 发病时的情况不同： 血管性痴呆往往发病较急， 患者家属一般都可以准确地 说出其发病的时间； 而老年性痴呆大多起病比较隐匿， 无明显的时间界限， 患者 隶属常常无法准确地说出其发病的具体时间。 5、 临床表现略有不同： 血管性痴 呆患者在发病的早期可出现情感不稳定、爱发脾气、容易出现情绪低落和恐惧不 安等症状， 到了晚期则会出现情绪失控； 老年性痴呆患者在发病后可出现情， 感 淡漠、 反应迟钝等症状， 少数患者可出现不明原因的傻笑等。 6、 患者对所患疾 病的态度不同： 血管性痴呆患者对自己出现的记忆力下降、 智力下降、情绪变化 以及身体不适等症状存在着一定的认识能力， 希望得到治疗； 而老年性痴呆患者 则对自己所患的疾病缺乏分析、判断的能力， 有的患者甚至还认为自己的身体很 好， 不需要治疗。 7、 进行辅助检查后的结果不同： 对血管性痴呆患者进行 CT、 核磁共振等辅助检查时可发现他们中多数人患有脑血管疾病：对老年性痴呆患者 进行上述检查后可发现他们中的多数人患有弥漫性脑萎缩。
治疗血管性痴呆的原则是改善脑血流、预防脑梗塞、促进大脑代谢以达到阻 止病情发展和改善症状的目的。根据治疗原则， 目前临床上主要可以选用下列药 物治疗血管性痴呆引起的各种症状： 1、 血管扩张药： 这类药物主要能增加脑血 流量， 如脑益嗉、 环扁桃脂、 盐酸氟桂嗉 （西比灵） 等； 2、 大脑代谢调节药： 这类药物主要能改善认知功能， 如氢化麦角碱 （喜得镇）、 都可喜、 脑复康、 脑 复新、 氯酯醒、 石杉碱甲等都有不同程度的改善智能作用。 3、 抗凝血药物： 肝 素、 双香豆素、 新抗凝片等。 4、 溶血栓药物： 链激酶、 尿激酶等。 5、 改善精 神症状药物： 抗焦虑及抗抑郁药物， 如舒乐安定、 佳静安定、 罗拉、 多虑平等； 使用上述药物时， 因药物吸收与排泄慢， 容易发生蓄积中毒与副作用， 且仅能改 善某一方面症状。另外目前用于治疗该疾病的药物存在种类较少、作用靶点单一、 长期疗效欠佳等问题， 临床上迫切需要研究开发具有新型作用特点、有效、 安全 的 VD治疗药物。
本发明在于采用化合物 (3-吡啶甲酰氧基 ) -3, 5-二甲基 -1-金刚烷胺或其 可药用盐， 该化合物公开在专利号： . 4， 专利名称： 用于老年痴呆 症治疗的 N- (3-吡啶甲酰氧基) -3, 5-二甲基 -1-金刚烷胺或其可药用盐中。本发明 经过研究显示，对大鼠慢性低灌注损伤致痴呆模型有延缓病程发展改善记忆的作 用； 减轻多发梗塞性痴呆模型神经病变程度， 保护神经元正常功能； 对大鼠局灶 性脑缺血再灌注损伤有减轻保护作用；可明显改善东莨菪碱所致小鼠获得性记忆 障碍； 有增加谷氨酸损伤神经元的细胞活性并增加培养液中神经生长因子 (NGF) 和突触素（SYN)水平而减少细胞内钙浓度以及增加突触长度的作用； 有增加 02 损伤神经元的细胞活性作用。其作用机理与抑制受损脑组织 NMDA受体过表达， 维 持氨基酸释放平衡， 增加乙酰胆碱合成能力以及抑制炎性反应等作用有关。提示 本化合物在治疗血管性痴呆有显著作用。
本发明目的在于提供 N- (3-吡啶甲酰氧基 ) -3, 5
治疗血管性痴呆的药物中的应用。
本发明的应用， 其中 (3-吡啶甲酰氧基 ) -3, 5 本发明的应用，其中所述应用针对血管性痴呆病程中延缓病程发展和改善记 忆的应用。
本发明的应用， 其中所述应用针对减轻多发梗塞性痴呆神经病变程度， 保护 神经元正常功能。
本发明的应用， 其中所述应用针对缺血再灌注损伤的保护作用。
本发明的应用，其中所述应用针对增加谷氨酸损伤神经元的细胞活性并增加 培养液中神经生长因子（NGF)和突触素（SYN)水平而减少细胞内钙浓度以及增 加突触长度的作用。
本发明的应用， 其中所述应用针对增加 02损伤神经元的细胞活性作用。 本发明的应用， 其中所述可药用盐选自： 盐酸盐、 硝酸盐、 硫酸盐、 氢溴酸 盐、 磷酸盐、 甲酸盐、 乙酸盐、 苯甲酸盐、 苹果酸盐、 马来酸盐或柠檬酸盐。
本发明的应用， 其中所述药物是是任何一种药物制剂形式。
本发明的应用， 其中所述药物制剂形式选自： 片剂、 胶囊、 口服液、 颗粒剂 或粉剂。
本发明的应用， 在改善学习记忆能力、 调节关神经递质水平、 调节 NMDA受 体表达方面有明确的效果； 在抗炎方面有一定的作用；
本发明的化合物为烟酸与盐酸美金刚胺通过酰胺键偶合的化合物。该化合物 不仅可避免烟酸口服的副作用，而且可协同发挥烟酸和美金刚胺的多靶点痴呆防 治作用； 并且还可通过增加盐酸美金刚胺的脂溶性和代谢稳定性， 使其更易通过 血脑屏障， 增加其在脑脊液的分布浓度和作用时间， 从而达到降低盐酸美金刚胺 外周不良反应的目的。 MeN061016_l作用机制新颖， 除能治疗老年痴呆外， 还可 为血管性痴呆临床治疗药物找到全新的治疗方案，具有极大的社会价值和临床价 值。
本发明的化合物在治疗效果上也优于现有技术， 如优于烟酸和盐酸美金刚。 以下通过实验数据进一步说明本发明的有益效果， 实验中本发明药物称为 MEN或 MEN。
MEN对大鼠慢性低灌注损伤致痴呆模型的影响
大鼠水合氯醛麻醉 （350mg/kg)， 颈部正中切口， 分离双侧颈总动脉并结扎 (假手术组只分离不结扎颈总动脉）， 缝合后回笼词养， 青霉素抗感染 4天。
2、分 ^ 3/4 给药
1个月后进行 MORRIS水迷宫游泳试验，以持续时间为指标筛选出现学习记 忆障碍趋势的大鼠， 随机分组： 模型组， 盐酸美金刚 20mg/kg组， 烟酸 20mg/kg 组， MEN 2.5mg/kg组， MEN 5mg/kg组， MEN 10mg/kg组， MEN 20mg/kg组， MEN6 40mg/kg组。 每日经口给药一次 （2mL/kg)， 连续 3个月。 假手术组和模 型组给予等体积蒸馏水。
慢性脑缺血是血管性痴呆 （VaD)、 Alzheimer病 （AD) 及 Binswanger病等 多种疾病发展过程中的一个共同病理过程。 研究证实， 大鼠双侧颈总动脉结扎 (2VO) 后血流可持续下降， 3周后为慢性期， 1个月仍低于正常组； 皮质、 海 马等参与学习记忆的神经元萎缩、 变性、 脱失呈进行性加重； 2VO后 3个月皮 质和海马 M型乙酰胆碱受体结合力下降； 学习记忆等行为学出现明显障碍。
许多研究表明， 脑缺血后可引起兴奋性氨基酸过度释放， 与抑制性氨基酸 GABA的比例失衡， 导致 NMDA受体过度激活， 细胞内 Ca2 + 超载及氧化应激等 一系列反应， 从而引起线粒体损害， 直至神经元病变或坏死， 功能破坏。 大脑前 额叶和海马的神经元对缺血十分敏感，而这些区域是与学习记忆能力密切相关的 脑区。脑缺血后这些脑区神经元功能和结构的损害会造成与学习记忆相关的神经 递质紊乱， 引起学习记忆能力的下降， 甚至痴呆。
本试验以慢性低灌注损伤致痴呆模型证实了上述生化、病理学及行为学变化 过程，并观察到 MEN以 2.5-40mg/kg剂量经口给药 3个月，可观察到大鼠 MORRIS 水迷宫寻找平台时间及路径长度显著缩短。 以 HPLC-ECD检测脑内神经递质的 结果表明， 2.5-20mg/kg剂量组前皮层的 GABA水平升高， GLU/GABA降低； 海马 ACh水平升高。 用免疫组化检测大鼠前皮层 NMDA受体表达的结果发现， 给药的五个剂量组 NR1、 NR2A、 NR2B受体高表达均有显著抑制。 进一步的原 位杂交对大鼠前皮层 NMDA受体亚基 mRNA的分析表明， 5-40mg/kg剂量组 NRlmRNA高表达均有显著抑制， 2.5-40mg/kg剂量组 NR2AmRNA、NR2BmRNA 高表达也有显著抑制。病理学检查表明： 模型组前皮层区神经元排列稀疏， 细胞 核可见皱缩， 核仁较小， 深染， 周边可见空隙， 核仁消失， 神经元变性坏死严重， 有明显的软化灶， 还可见间质炎性细胞及胶质细胞增生。 MEN 2.5-40mg/kg组 前皮层细胞排列有序，细胞间结构紧密，核膜较饱满，神经病变有不同程度减轻。 MEN061016可明显提高学习记忆能力， 其机制可能与抑制 NMDA受体， 降低 GLU/GABA比值， 保护受损神经细胞， 从而间接提高海马 ACh水平有关， 但同 时观察到 40mg/kg有激惹和紧张的现象， 具体原因有待进一步考察。
结果见表 1-7。 MEN对多发梗塞性痴呆模型大鼠的影响
大鼠水合氯醛腹腔麻醉 （400mg/kg)， 颈部备毛、 消毒， 正中切口， 分离右 侧颈总动脉、 颈内动脉及颈外动脉。 结扎颈外动脉， 动脉夹夹闭颈总动脉， 以注 射器从颈外动脉向颈内动脉注入 O.lmL KMG， 松开动脉夹， 结扎颈外动脉， 缝 合伤口， 回笼词养。 假手术组只分离颈总动脉、 颈内动脉及颈外动脉， 向颈内动 脉注射等体积葡萄糖生理盐水。注射用青霉素钠抗感染四天。手术次日观察动物 行为表现， 以前肢有行为学改变者判定为模型成立 (否则弃去不用)。
2分组及给药
将模型成功者分为 8组： 假手术组， 模型组， 盐酸美金刚 20mg/kg组， 烟酸 20mg/kg组， 盐酸美金刚 +烟酸等摩尔浓度 （美金刚 13.5mg+烟酸 7.7mg/kg) 组， MEN 2.00mg/kg组， MEN 6.3mg/kg组， MEN 20.00mg/kg组。 手术 10天后开始 灌胃给药， 给药量 2 ml/kg， 假手术组和模型组均灌胃等体积蒸馏水， 每日一次， 连续 60天。
研究认为脑梗塞是否引起痴呆主要与梗塞灶的大小、 多少及部位有关。 调 查表明， 梗死灶体积大于 50mL可以合并痴呆， 大于 lOOmL则经常合并痴呆； 也有调查发现， VaD患者中大面积梗死占 11.2%， 小面积梗死灶占 88.8%， 多发 病灶占 97.6%， 提示病灶体积小， 也可发生痴呆， 尤其是梗死灶数目越多， 痴呆 发生率越高。 也有研究认为， 脑梗死的部位是导致痴呆的关键性因素； 多数报道 指出， CT 上发现有脑室旁白质病变改变者， 痴呆发生率显著增高。 因而基于 MID进行相关研究对判断药物治疗 VaD的有效性有指导作用。
试验以生物微球注入颈内动脉的方法， 造成大鼠多发梗塞性痴呆（MID)模 型， 灌胃给予 MEN个月， 观察药物对 MID的治疗作用。 结果显示， 模 型组动物出现学习记忆障碍， MORRIS水迷宫潜伏期和寻找平台的路径长度显著 延长， 皮层和海马 GLU、 GABA水平均显著降低， NMDA受体 NR1、 NR2A、 NR2B过表达， 皮层组织均浆中 CHAT活性显著降低， TNF水平显著升高。表明 模型组大鼠缺血后神经元变性坏死，与学习记忆相关的氨基酸水平及乙酰胆碱合 成能力下降， 学习记忆能力降低。
给药 4周， 与模型组比较， 烟酸组大鼠 MORRIS水迷宫潜伏期和游泳路径 长度均显著缩短，其他组没有显著性差异;给药 8周第 1天，所有给药组 MORRIS 水迷宫潜伏期均显著缩短， 除美金刚组外其余各组路径长度均显著缩短； 给药 8 周第 5天， 烟酸组和 MEN组潜伏期和路径长度显著缩短， 美金刚及美金刚 +盐 酸组没有显著性差异。 表明各组均有改善记忆能力的作用， 烟酸和 MEN尚有改 善学习能力的作用， 且烟酸起效最快， 而美金刚组学习能力较弱。
给药 8周后， 盐酸美金刚抑制 NMDA受体、升高脑组织 GLU水平及 CHAT 活性的作用均略强于盐酸， 学习记忆能力及抑制炎性反应的能力弱于盐酸， 但组 间比较均无显著性差异。 同等剂量下的 MEN组学习记忆能力优于盐酸美金刚组 和烟酸组，皮层和海马 GLU水平的升高幅度小于盐酸美金刚组大于烟酸组， MEN 抑制 NMDA受体 NR1、 NR2A高表达的强度弱于盐酸美金刚强于盐酸， 抑制 NR2B高表达的强度高于两者， 但组间比较均无显著性差异。 MEN升高脑组织 CHAT活性的作用强于两者且与烟酸组比较有显著性差异。 MEN抑制脑组织中 TNF水平的作用强于盐酸美金刚， 与盐酸相当。
MEN可使 MID大鼠提高学习记忆能力，显著升高皮层和海马中 GLU水平， 显著抑制 NMDA受体 NR1、 NR2A、 NR2B表达， 显著增强皮层 CHAT活性， 显著降低皮层 TNF水平。提示 MEN具有保护神经元正常功能，抑制受损脑组织 NMDA受体过表达， 维持氨基酸释放平衡， 增加乙酰胆碱合成能力以及抑制炎 性反应等作用， 这可能是其治疗大鼠多发梗塞性痴呆的作用途径。与对照药盐酸 美金刚和烟酸比较， 不同的指标作用强弱有所不同。
结果纖 844。
MEN对缺血再灌注损伤恢复期大鼠的影响
动物 4.0%水合氯醛腹腔注射麻醉 (400 mg/kg体重)， 保温毯上仰卧位固定， 分离右侧颈总动脉 (CCA；)、 颈内动脉 (ICA)及颈外动脉 (ECA),结扎 ECA并剪断， CCA用丝线打活结暂时阻断， 用动脉夹夹闭 ICA后,于 ECA剪开切口,插入直径 为 0.24 mm的尼龙线至有明显阻力，插入深度 20±2 mm (从颈总动脉分叉处计）， 致使大脑中动脉阻塞缺血； lh后抽出尼龙线， 放开 CCA丝线， 实现再灌注。 实验过程中保温毯设定温度 37 °C至 37.5 °C， 监测大鼠肛温。 再灌后次日以行为 学障碍判定阳性为模型成功， 随机分组： 模型组， 盐酸美金刚 20mg/kg组， 烟酸 20mg/kg组； 盐酸美金刚 +烟酸等摩尔浓度 （美金刚 13.5mg+烟酸 7.7mg/kg) 组， MEN 2.00mg/kg组， MEN 6.3mg/kg组， MEN 20.00mg/kg组； 以 2mL/kg 体积灌胃给药。 假手术组只分离 CCA结扎 ECA， 不插尼龙线， 按 2 mL/kg体积 给予蒸馏水。
2、 给药及取材
连续给药 10d，动物经腹主动脉取血分离血浆，断头取脑，在囟门后 4.3-4.5mm 处冠状切一刀， 将右侧半脑（缺血侧）分离为前后半脑， 后面部分中性福尔马林 固定， 3日后， 经脱水、 浸蜡、 包埋、 切片、 脱蜡至水、 抗原修复等程序， 进行 免疫组化观察 NMDA受体 NR1、 NR2A、 NR2B表达。 在囟门后 2mm处冠状切一 刀，分别将前后两部分装入冷冻管，液氮固化，后部分脑区冰浴中以 0.15M HCL04 勾浆（lOOmg脑重；
3/4 lmL) 14000xg 4°C离心 20min，取上清液， 0.22μηι滤膜过滤， 自动进样器将 50μ1衍生试剂加入到 25μ1样品中， 混合 3次， 静置 lmin， 进样 20μ1。 前部分脑区以生理盐水制成 10%均浆， 3000rpm离心 30min， 分别测定缺血侧脑组 织 SOD及 GSH-PX活性， MDA含量； 血浆测定 NOS活性及 NO含量。
试验用线栓法造成大鼠局灶性脑缺血模型， lh后再灌注， 于再灌注后次日 灌胃给药， 连续 7d。
试验观察到模型组大鼠脑内 MDA水平及 SOD、 GSH-PX活性显著升高， 分 析可能是脑缺血后过氧化物大量产生并发生炎性反应，脑组织代偿性的增强抗氧 化 SOD、 GSH-PX活性； 脑内 GLU及 GAB A水平降低， NMDA受体亚型 NR1、 NR2A及 NR2B过表达， CHAT活性降低； 分析是由于局灶性脑缺血致使神经元 凋亡或坏死造成的。
观察 MEN 在改善脑内 GLU、GABA等神经递质异常释放及 NMDA 受体表达、 抗氧化等方面的神经保护作用。 结果表明， 与模型组比较， MEN三个剂量组脑内 MDA水平显著降低， 20.0mg/kg组血浆 NO水平 显著下降， GLU水平显著升高， NMDA受体 NR1、 NR2A、 NR2B缺血后过表 达显著抑制； 皮层神经元变性程度， 软化灶， 胶质细胞增生以及海马锥体细胞坏 死程度等病变均得到抑制和改善。 提示， MEN 对大鼠局灶性脑缺血再 灌注损伤有一定的保护作用。
结果见表 15-19 MEN对缺血大鼠局部脑血流量的影响
1、造模雄与分组
实验分为 7组： 模型组； 盐酸美金刚 20 mg/kg组； 烟酸组； 盐酸美金刚 +烟 酸等摩尔浓度组 （美金刚 13.5mg+烟酸 7.7mg/kg); MEN 2 mg/kg组； MEN 6.32 mg/kg组； MEN 20 mg/kg组。
动物 4.0 %水合氯醛腹腔注射麻醉 (400 mg/kg体重)， 保温毯上仰卧位固定， 分离右侧颈总动脉 (CCA；)、颈内动脉 (ICA) 及颈外动脉 (ECA),结扎 ECA并剪断备 用。 切开大鼠头顶部皮肤， 于囟门后 2 mm， 右 5 mm处电钻磨薄颅骨， 医用胶 固定电极固定座， 插入 PROBE 407-1 KIT 多用途表面电极， 气管切开， 插入三 通， 连接呼吸机及麻醉机维持麻醉深度。 呼吸机参数为呼吸频率 70次 /min， 吸 呼比 1:2.， 潮气量 9ml。 医用氧流量为 900ml/min， 异氟烷浓度为 3%。 大鼠右侧 肋下备皮， 开一 1cm切口， 小心找出十二指肠， 穿线后放回。 连接激光多普勒 血流测定仪， 记录大鼠脑血流量 （rCBF)， 当血流稳定 lOmin后 CCA丝线系活 结， 用动脉夹夹闭 ICA,于 ECA剪开切口， 插入直径为 0.24 mm的尼龙线至有明 显阻力， 插入深度 20±2 mm (从颈总动脉分叉处计），致使大脑中动脉阻塞缺血， 以 rCBF下降 70 %以上为模型成功指标， 没达到标准的弃去不用。在造模血流下 降达到标准后十二指肠给药， 给药体积为 2 mL/kg, 激光多普勒血流仪记录缺血 前至缺血 120 min大鼠 rCBF， 缺血 2 h拔出尼龙线， 松开 CCA活结， 实现再灌 注， 继续观察 60 min。 实验期间保温毯设定温度为 37.0±0.5 °C。
试验用线栓法造成大鼠脑缺血再灌注损伤模型，缺血即刻一次性十二指肠给 药，激光多普勒血流仪记录缺血前至缺血 120 min和再灌后 60 min大鼠局部脑血 流量 （rCBF)。 结果表明， 与模型组比较， 对照药烟酸组大鼠给药后 rCBF显著 增加， 并可持续至缺血后 120min， 再灌后血流量继续升高； 对照药美金刚组、 美金刚 +烟酸等摩尔组及 MEN三个剂量组 rCBF均未见显著增加， 再灌后 rCBF 亦无统计学差异。
大脑局灶性缺血后血液再恢复（再灌注）对脑组织的影响受到缺血时间和再 灌注血流量的影响， ω·缺血较长时间后大量的血流复灌， 会形成再灌注性损伤， 使脑组织损伤进一步加重。如药物在缺血期就能增加对脑组织的供血， 减少脑组 织缺氧造成的损害。血流恢复时，未达到不可逆损伤程度的脑组织获得血流供应， 血流量增加， 脑组织损伤及梗死面积缩小。药物在缺血期对缺血组织缺氧改善不 明显， 未形成有效保护时， 则在血流恢复期适当缓慢增加再灌血流量亦对缺血组 织有一定的益处。 实验仅观察到对照药烟酸有显著增加缺血大鼠 rCBF的作用， 对照药美金刚和受试药 MEN则无此作用。 提示 MEN—次性十 二指肠给药， 在缺血 120 min内及再灌注 60 min内无增加缺血大鼠局部脑血流量 的作用。
结果见附表 20， 图 1、 图 2。
MEN对东莨菪碱所致小鼠获得性记忆障碍的影响
动物雌雄各半， 随机分为 7组： 空白对照组， 模型组， 盐酸美金刚 30mg/kg 组， 烟酸 30mg/kg 组， 盐酸美金刚 +烟酸等摩尔浓度组 （美金刚 20.2mg+烟酸 11.52mg/kg) ,ΜΕΝ 3.0mg/kg组, MEN 9.5mg/kg组, MEN 30.0mg/kg组。
动物每日按 20mL/kg体积灌胃给药，空白对照组及模型组动物给予蒸馏水， 每日一次， 连续 15 日。 第 14天给药后 50min按 lOmL/kg体积给予空白对照组 小鼠腹腔注射生理盐水， 其余各组动物均注射东莨菪碱 （6mg/kg)。 lOmin后将 小鼠放入跳台程序自动控制仪内适应 3min， 然后通电， 使小鼠遭受电击剌激 5 次， 小鼠遭到电击时跳上跳台， 逃避电击， 训练 5min， 使获得记忆。 第 15日给 药后 60min， 将各组动物放入跳台程序自动控制仪中， 测定小鼠离开跳台遭受电 击的次数 （错误次数） 及发生时间 （潜伏期）。 结果进行统计学处理 （t检验）。
训练前给予小鼠 M-受体阻断剂东莨菪碱， 可造成脑内乙酰胆碱含量降低， 形成获得性记忆缺损。 本试验在此化学损伤基础上进行跳台试验， 以小鼠 5min 内错误次数、 潜伏期为指标， 观察 MEN 对该模型的影响。 结果表明 MEN 显著改善东莨菪碱所致小鼠获得性记忆障碍， 提示该药可能有增 加脑内乙酰胆碱含量的作用。 见表 21。
MEN对神经元、 胶质细胞及脑微血管内皮细胞的影响
1 内皮细胞培养旅及分组
雄性 SD大鼠 12只， 体重 60-80g， 无菌条件下取出双侧大脑半球， 置预冷的 冲洗液中， 剔除软脑膜、 表面血管及白质， 收集皮质。 剪碎成 lmm3的小块， 置手 动玻璃勾浆器，冰上操作上下勾浆约 25次。依次通过 80目和 200目尼龙网过滤， 收集 200 目网上微血管段。 用 0. 1%胶原酶， 37°C消化 30分钟。 冲洗液冲洗两 遍， 1000r/min离心 5min， 将微血管段重悬于完全培养基中， 接种于 2%明胶预先 包被的 25cm2培养瓶中， 共接种 2瓶。 37°C、 5%(：02培养箱静置培养 48小时后， 第一次换液。 以后 2?3d更换一次完全培养液， 约 6?7d细胞基本融合成片， 进 行消化传代， 消化液为 0. 125%的胰蛋白酶 _0. 02%EDTA (1 : 1)。 本实验用第三代 细胞， 90%汇合培养的脑微血管内皮细胞经消化后传代， 接种于 2%明胶包被的 96 孔板， 台盼蓝计活细胞数， 调整传代密度为 1*105 · cm2。 37°C、 5 %C02培养 24小 时后， 加药， 24h后进行 2μΜ谷氨酸处理 2h， 测 MTT。 分预加药， 后加药和正常加 药三种， 每种药物设个计量， 分别为 200nM、 400nM、 800nM。
2星形胶质细胞培养纯化
1 )初接种： 取出生 2— 3d内的大鼠， -20°C预冻 lOmin左右取出，以 75%的洒精 消毒两次， 无菌条件下断头取脑，并置盛有解剖液的培养皿内。 剥除脑膜， 取下 大脑皮质， 剪成碎块后， 用初接种消化液， 在 37°C 5 %C02培养箱消化 30min,中 间振摇 1一 2次。 收集上述组织液于离心管中， 2000rpm离心 5min， 去上清液， 加 入完全培养液终止消化， 并用细口径吸管反复轻轻吹打， 直到形成均勾的细胞悬 液。 再用 200目不锈钢网过滤使成单细胞悬液。 用血球计数板计数细胞， 调节细 胞密度为 5. O X 105个 /ml， 将细胞接种于预先经 0. 001%多聚赖氨酸浸泡的无菌塑 料培养瓶中，每瓶 5ml， 而后置于 37°C、 5%的 C02培养箱内， 24h后全部更换培养液。 此后每 2-3d换培养液一次， 每次更换 1/2培养液。 当单层细胞生长且融合成片状 时进行传代。
2) 转接种： 当 Ast培养至第 8d (细胞融合成片状） 时， 全换培养液， 培养 箱内孵育 2-3h后， 置于 37°C恒温摇床内， 240rpm振荡 18h。 去除全部培养液， 用预温的解剖液洗 2— 3次， 每个培养瓶内加入转接种消化液 1ml进行消化， 镜 下观察， 见 50%— 70%的细胞回缩、 脱落时立即终止消化。 用吸管反复吹打使细 胞从瓶壁脱落， 收集细胞悬液， 2000rpm离心 5min。去上清， 加完全培养液吹打， 使细胞再分散成细胞悬液， 调节细胞浓度为 1. 0 X 10 Vml， 转接种于铺被有多 聚赖氨酸的 96孔板， 置培养箱内孵育。 24h后全部更换培养液， 第 3d换半液， 用于实验， 预加药 24h， 24h后进行 2μΜ谷氨酸处理 2h， 测 MTT。 分预加药， 后加 药和正常加药三种， 每种药物设 3个剂量， 分别为 200nM、 400nM、 800nM。 每个 实验重复一次。 3结果
本实验选用谷氨酸造模模拟了脑损伤。谷氨酸是脑内兴奋性氨基酸， 它的增 多是众多脑损伤的中间环节。 阻抑谷氨酸损伤， 可以得到脑细胞保护的结论。
本实验所用药物均为成品， 按分子量计算出摩尔数， 所加摩尔浓度相同， 同 摩尔浓度之间比较， 各组再分别与模型组比较， 正常加药与正常组比较， MEN 在星形胶质细胞造模后再给药 48小时效果显著， 明显优于美金刚和烟酸组， 预 加药也表现很好， 与模型组比较差异显著？& 0. 01， 具有很好的保护作用， 但与 美金刚组比较无显著差异。美金刚大剂量组表现出较强毒性， MEN没有明显毒性。 烟酸也有脑保护作用。 对脑微血管内皮细胞的保护作用美金刚表现突出； MEN则 表现不突出。
MEN 对谷氨酸损伤的星形胶质细胞有显著的保护作用， 并在给药 48h作用略优于美金刚。对正常脑微血管内皮细胞及谷氨酸损伤脑微血管内皮细 胞活性有一定的增强作用。实验还发现 MEN在 800nM浓度下对星形胶质 细胞及脑微血管内皮细胞试验中没有表现出明显毒性。
从以上结果可以看出， 2μΜ的谷氨酸 2h模型是成功的，造成了细胞的可逆 性损伤， 利于药效的观察， 且比较灵敏。脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞都是 脑内神经元的支持细胞， 是神经血管单元的组成部分， 是药物作用到神经元的必 由之路。
结果见图 3-14。
MEN对亲代谢型和离子型谷氨酸受体机制研究
1、 MEN逆转 1-甲基- 4-苯基吡啶离子（MPP+)抑制 胶质细胞活性 ①星形胶质细胞培养
无菌条件下取出新生 Id SD 大鼠的全脑， 去除脑膜和血管， 用 0. 25%胰蛋白 酶消化成细胞悬液后， 接种到预先用多聚赖氨酸 0. 1 g/L—1处理 24 h 的培养瓶内， 24 h 后更换培养基， 以后 3 d 更换一次培养基。 d 7 时， 放入恒温摇床内 100 r/min— 1 振摇 5 h， 弃去培养基， 用 0. 5% 的胰蛋白酶消化吹勾后， 接种于培养 板中， 待长成连续单层后， 按试验需要分组给药， 每组 6个复孔， 继续培养 48 h。 ②结果
试验一、 II组 mGluRs激动剂 DCG_IV、 III 组 mGluRs 激动剂 L一 AP4， II组 mGluRs 拮抗剂 APICA和 III组 mGluRs拮抗剂 MSOP对 MPP+抑制星形胶质细胞 MTT的影响 本实验结果发现， ΜΡΡ+150 μ Μ可明显抑制星形胶质细胞增殖。 II组 mGluR4 激动剂 DCG-IV100 μ Μ可逆转 ΜΡΡ+150 μ Μ作用，该作用可被 200uMII组 mGluRs 拮抗 剂 APICA抑制， 而 DCG- ?ν ?Ο μ Μ、 APICA 50uM 没有作用。 同样， III 组 mGluRs 激 动剂 L一 AP4100 μ Μ可逆转 ΜΡΡ+150 μ Μ作用，该作用可被 200uMIII组 mGluRs拮抗剂 MS0P抑制， 而 L一 ΑΡ4 10 μ Μ、 MSOP 50uM 没有作用。 试验一结果确定了下一步实 验的工具药浓度。
试验二、 MEN对 MPP+抑制星形胶质 MTT的影响
本实验测定了 MPP+对星形胶质细胞活性的影响。 结果发现， ΜΡΡ+150 μ Μ可以 抑制星形胶质细胞活力， ΜΕΝ50、 500ηΜ均不同程度可逆转 ΜΡΡ作用， 推测 MEN可能 有 II、 III组 mGluRs受体激动作用或 GluTs激活作用。 进一步研究发现 I I、 III组 mGluRs受体激动剂 DCG_IV、 L一 AP4与 Men无叠加作用， II组 mGluRs 拮抗齐 [JAPICA 和 III组 mGluRs拮抗剂 MS0P可逆转 Men作用， 推测 MEN具有部分 II、 III组 mGluRs 受体激动作用。
结果见图 15-16。
Glu 是中枢神经系统中主要的兴奋性神经递质。 由于细胞外液中没有使 Glu 灭活的酶系统，突触间隙中 Glu 清除的主要途径是通过胶质细胞上高亲和力 Glu 转运体（ glutamate transporters, GluTs) 对 Glu 的主动摄取。 1■ 甲基■ 4■ 苯基吡啶离子（ 1■ methyl■ 4■ phenylpyridinium, MPP+)可以抑制神经胶质细 胞摄取 Glu， 被认为是 MPP+ 间接损伤神经元的一个重要机制。
根据信号转导途径可以把谷氨酸受体分为两大类： 亲离子型谷氨酸受体 ( ionotropic glutamate recep " tors , iGluRs)禾口亲代谢型谷氨酸受体 ( metabotropicglutamate receptors , mGluRs)。 mGluRs 是广泛分布于中枢神 经系统的一类 G 蛋白耦联受体， 根据氨基酸序列同源性、信号转导机制和药理学 特性将其分为三组， I 组 mGluRs 包括 mGluRl 和 mGluR5， II组 mGluRs 包括 mGluR2 和 mGluR3， III组 mGluRs 包括 mGluR4、 mGluR6、 mGluR7 和 mGluR8。 研究发现， 各组 mGluRs 在星形胶质细胞上均有分布。激活星形胶质细胞上的 mGluRs 可以释 放多种神经生长因子， 包括转化生长因子、神经生长因子 (NGF)等， 而发挥神经 保护作用； 另外， 激活星形胶质细胞上的 mGluRs 也可以改变谷胱甘肽 (glutathione, GSH) 的代谢。这些研究都表明激活星形胶质细胞上 mGluRs 有神 经保护作用。研究表明 MPP+抑制星形胶质细胞摄取 Glu 可能与直接影响谷氨酸转 运体（GluTs) 的功能有关， 采用 II、 III组亲代谢型谷氨酸受体激动剂激活星形 胶质细胞上的 I I、 III组 mGluRs 可以通过促进 GluTs 摄取 Glu、 进而降低细胞外 液的 Glu 浓度而发挥神经保护作用。
本实验测定了 MEN对星形胶质细胞活性的影响。结果发现，给予 MPP+ 可抑制星形胶质细胞活力， MEN可逆转 MPP作用， MEN的这一作用可被 II、 III组 mGluRs拮抗剂阻断， 推测 MEN有 II、 III组 mGluRs受体激动作用激活作用。
MEN逆转 1-甲基 -4-苯基吡啶离子 (MPP+)抑制谷氨酸摄入的影响 ①星形胶质细胞培养
无菌条件下取出新生 1 d SD 大鼠的全脑， 去除脑膜和血管， 用 0. 25%胰 蛋白酶消化成细胞悬液后， 接种到预先用多聚赖氨酸 0. 1 g/L— 1处理 24 h 的培 养瓶内， 24 h 后更换培养基， 以后 3 d 更换一次培养基。 d 7 时， 放入恒温摇 床内 100 r/min— 1 振摇 5 h， 弃去培养基， 用 0. 5% 的胰蛋白酶消化吹勾后， 接种 于培养板中， 待长成连续单层后， 按试验需要分组给药， 每组 6 个复孔， 继续培 养 48 h o
② [ ] - D， L-Glu摄取的测定
在星形胶质细胞培养基中加入 [ 3/4 ] -D， L-Glu (终浓度 0. 19 μ mol · L— ， 共 同孵育 15 min 后， 用冰冷的 0. 9% NaCl 溶液终止反应并冲洗 3 遍， 随即加入 200 μ 1 NaOH溶液 0. 3 mol · L— 1裂解细胞， 最后离心， 收集上清液加入闪烁液， 使用 液闪计数仪测定 L- [ 3/4 ] -Glu 摄取量 (nmol · ιι?η— 1 * g— ^rot) 。 考马斯亮兰法测定 每孔细胞蛋白质含量。
将 MPP+ 与星形胶质细胞共同孵育 48 h 然后测定星形胶质细胞对 [ 3/4 ] D， L-Glu 的摄取能力。结果发现， MPP+ 150 uM 能明显抑制星形胶质细胞摄取 Glu。 而预先给予 MEN孵育 1 h可以逆转这种抑制作用。 mGLU受体激动剂 DCG IV 和 LAP40 100 uM与 MENMEN无叠加作用。 推测 MEN 有类似于 DCG IV和 LAP40的亲代谢型谷氨酸受体激动作用。进一步研究发现 II组 mGluRs 拮抗剂 APICA和 III组 mGluRs拮抗剂 MS0P可逆转 MEN 作用， 推测 MEN具有部分 II、 III组 mGluRs受体激动作用。 结果见图 17。 ④结论
Glu 是中枢神经系统主要的兴奋性神经递质，但是细胞外 Glu 浓度过高时， 会产生兴奋毒性。 Glu 的神经毒性是通过 NMDA 和非 NMDA 受体介导的， 但在大 多数病理情况下， 尤其是在中枢神经系统慢性进行性疾病中， NMDA 受体在过度 兴奋介导的神经细胞迟发性变性或坏死起重要作用。 MPP+ 是目前研究谷氨酸毒 性常用的神经毒素， 它主要通过抑制线粒体复合物 I 发挥神经毒性作用。本文工 作选择星形胶质细胞作为研究的工具细胞，研究结果表明， 在不影响星形胶质细 胞活性的浓度时， MPP+ 即可显著抑制 Glu 的摄取能力。 同时本研究证明 MEN可以逆转 MMP+抑制谷氨酸摄入作用，可能有类似亲代谢型谷氨酸受 体激动作用。
本实验测定了 MEN对星形胶质细胞谷氨酸摄入的影响。 结果发现， 给予 MPP+ 可抑制星形胶质细胞谷氨酸摄入， MEN可逆转 MPP作用， MEN 的这一作用可被 II III组 mGluRs拮抗剂阻断， 推测 MEN有 II III组 mGluRs受体 激动作用。
3 MEN对大鼠脑皮质 MDA受体与其配体结合的影响
脑皮质受体悬液的制备： 放射配基结合检测当天， SD大鼠断头处死， 每个 1. 5 mL Eppendorf 离心管中加入脑皮质 0. 1 g， 每只鼠共取 6管， 每管加 1 mL 0. 32 mol/L冰冷蔗糖溶液， 用 1 mL—次性注射器反复抽吸脑组织勾浆。 900 g 低温离 心 10 min， 取上清， 11500 g 低温离心 20 min， 取沉淀， 加冰冷 50 ol/L Tris- HC1 (pH 7. 7) 0. 5 mL,悬浮， 11500 g 低温离心 20 min,取沉淀，每管加 Tris-HCl 0. 5 mL, 混勾， 6管混合， 加 50 mmol/L Tris-HCl 5 mL, 考马斯亮兰法测定蛋白 浓度， 用 Tris-HCl调为 0. 4 g/L， 备用。 以上操作均在冰浴下进行。
放射配基结合分析： 总反应体积为 200 L0 每管内加入 100 L 脑皮质受 体悬液， 不同浓度药物及
3/4 -MK-801。 非特异性结合管加入非标记 MK-801， 使其 终浓度为 1 mol/L0 37 °C反应 30min，力口 3 m L冰冷 50 mmol/L Tris- HCl (pH 7. 7) 终止反应， 用 Whatman滤纸抽滤， 用 3 mL冰冷 Tris- HC1冲洗滤片 2次， 取出滤膜 于 80 °C烘干 20 min。 放入闪烁瓶中， 用液闪仪计数
②分组及药物配制： 药物或
3/4 -MK-801均以 50 mmol/L Tris- HC1 (pH 7. 7) 配 置， 药物浓度以终浓度计， 分组如下： ( 1 ) lOOul脑皮质悬液 +3H-MK-801 (10nM)
( 2) lOOul脑皮质悬液+美金刚 500nM+ 3/4 -MK-801 (ΙΟηΜ)
( 3) lOOul脑皮质悬液+美金刚 100nM+ 3/4 -MK-801 (ΙΟηΜ)
(4) lOOul脑皮质悬液 +Men 500nM+ 3/4 -MK-801 (ΙΟηΜ)
( 5) lOOul脑皮质悬液 +Men 100nM+ 3/4 -MK-801 (ΙΟηΜ)
③结果及结论
盐酸美金刚（Memantine H ydrochlo ride) 是一种新型、 低、 中度亲和力、 电压依赖、 非竞争性 NMDA ( N- methyl- Daspastate)受体拮抗剂， 能显著改善阿 尔茨海默氏病 (Alzheiner' s disease, AD) 禾口血管性痴呆 (vascular dementia, VaD) 患者认知障碍、 精神运动驱动缺乏、 抑郁程度、 运动障碍， 提高其日常生 活能力和社交活动。 分别于 2002 年和 2003 年被欧洲 CPMP 和美国 FDA批准用于 治疗中、 重度 AD。
谷氨酸作为脑中最常见的兴奋性神经递质，与痴呆患者脑中神经细胞死亡密 切相关。谷氨酸浓度增加或神经节对谷氨酸敏感性增强均可增加受体 NMDA、 AMPA 与谷氨酸结合， 引起电压调控性钙通道开放或激活磷酸肌醇环路， 使细胞内钙超 载， 导致神经细胞凋亡。 盐酸美金刚可非竞争性阻断 NMDA 受体， 降低谷氨酸引 起的 NMDA 受体过度兴奋， 防止细胞凋亡， 从而改善记忆， 增强患者认知功能。 由于盐酸美金刚与 NMDA 受体亲和力呈低、 中度， 因此， 在阻断谷氨酸兴奋性毒 性的同时， 不妨碍谷氨酸参与正常学习和记忆的生理作用。本研究通过比较药物 干预脑皮质 NMDA受体与
3/4 标记非竞争性 NMDA受体拮抗剂 MK-801的结合， 来比较 MEN和美金刚对 NMDA受体亲和力的大小。
目前 NMDA受体分子结构还未充分认识， 在药理学上至少有 6个独立的位点， 分别是受体表面的 NMDA/谷氨酸独立位点、 甘氨酸 （gly) 位点、 Zn2+位点； 位于 离子通道内的 Mg2+位点、 PCP位点。 NMDA受体拮抗剂可分为竞争性和非竞争性拮 抗剂， 后者又可分为离子通道阻滞剂、 Gly和 PA部位拮抗剂。 目前已进入临床的 非竞争性 NMDA受体拮抗剂有 MK801和 DX等。
本实验观测到美金刚可拮抗 NMDA受体与其配体
3/4 -MK 801的结合， 且有剂量- 效应对应关系， 提示美金刚可抑制兴奋性氨基酸毒性作用， 从而发挥对脑损伤的 保护作用。 MEN对丽 DA受体与其配体
3/4 -MK 801的也有一定的结合， 说 明对 NMDAR受体有弱抑制作用。 结果见表 22。
以下为表格:
表 1 - 对 VaD大鼠 MORRIS水迷宫潜伏期的影响 ( X ±s ) 剂量 潜伏期 （s)
(mg/kg) 给药 2个月 给药 3个月 假手术组 12 4.30+1.43 3.78±1.05 模型组 10 17.03+8.74## 11.10+5.84## 美金刚组 20 10 10.64+7.62 5.64+3.33* 烟酸组 20 11 10.67+6.69 6.81+2.41*
2.5 10 11.40+4.72 8.93±4.94 5 10 9.73±6.59 6.44+3.81* MEN组 10 9 8.34+5.45* 5.82±1.66*
20 10 7.78±5.78* 5.81+2.21* 40 6 6.12+3.22** 4.33+1.90* 注： 与假手术组比较： ##Ρ&0.01', 与模型组比较: *P&0.05, **尸&請。 表 2 对 VaD大鼠 MORRIS水迷宫路径长度的影响 ( X ±s ) 剂量 路径长度 （cm) 分组 n
(mg/kg) 给药 2个月 给药 3个月 假手术组 12 54.76+19.00 58.96±15.02 模型组 10 218.98+135.58## 163.36+99.16## 美金刚组 20 10 142.51+107.56 139.53+109.66 烟酸组 20 11 141.53+90.51 120.87+56.20
2.5 10 124.20+71.69 156.29+133.74 5 10 121.46+88.08 91.94+57.44 MEN组 10 9 105.54+54.06* 97.90±48.91
20 10 95.95+66.52* 93.22+29.10* 40 6 59.86+31.66** 64.37+38.41* 注： 与假手术组比较： ##Ρ&0.01', 与模型组比较: *P&0.05, **尸&請。 表 3 对 VaD大鼠前皮层 Glu、 GABA水平及 Glu/GABA的影响 （ ±s) 齐糧 Glu GABA
删 (mg^ n ^g/g脑重） ^g/g脑重） Glu/GABA
12 181.5±68.2 25.7±13.7 8.66+4.36 灘且 9 99.5±63.7## 8.3±6.5## 13.64±6.98#
20 9 22.3+11.8** 3.8±2.8 7.86+4.55* 髓且 20 9 77.5+30.4ΛΛ 12.8±8.5ΔΔ 8.34+5.57* 2.5 10 151.4+76.7ΛΛ Α 24.4+11.9*ΛΛ Α 7.92+5.07* 5 9 158.6+79.3ΛΛ Α Α 23.1+11.3**ΛΛ Α 8.46+4.97* 10 171.3+27.8**ΛΛ Α 28.7+15.3**ΛΛ Α
ME 组 9 ▲ 7.96+4.78*
20 10 155.6+81.0ΛΛ Α 17.6+9.2*ΛΛ 11.96+9.14 40 6 32.2+12.8*Α Α 2.5±0.8Α 13.25+4.00' 注：与假手术组比较： ** Ρ&0.01 与模型组比较： *Ρ&0.05, **Ρ&0.01;与盐酸美金刚组比较： Ρ&0.01 ; 与烟酸组比较： P&0.05， K KP&0.01 表 4 对 VaD大鼠海马 ACh水平的影响 （ X ）
删 η (ng/g脑重）
灘且 9 917.1+263.5##
髓且 20 10 .0**
2.5 10 .5**
ME 组 10 7 163.23+58.17**
注： 与假手术组比较： ** P&O.OI 与模型组比较： *ρ&αο5, **ρ&ο.οι. 表 5 对 VaD大鼠前皮层 NMDA受体 NR1、 NR2A、 NR2B表达的影响 （ ) ~~ S 积分灰度值 （IOD )
(mg/kg) n Rl NR2A NR2B m 5 923.5+106.7 742.4+156.3 800.6+120.1 灘且 5 .8## .7## 7.8##
20 5 .4** .8** .3** 髓且 20 5 .8** .7** .2**
2.5 5 .5** 2.8** .3** 5 5 .7** .4** .5** ME 组 10 5 .9** .8** .1**
20 5 .5** 7.6** .9** 40 5 .6**' .5**A .3** 注： 与假手术组比较： M P&0.01 与模型组比较： **Ρ&0.01 ·' 与盐酸美金刚组比较： ΔΡ&0.05·' 与烟酸 组比较： P&0.05, "P&0.01 表 6对 VaD大鼠前皮层 NMDA受体 NRl、 NR2A、 NR2B mRNA表达的影响 （ ±s) 剂量 积分灰度值 （IOD )
(mg/kg) NRlmRNA NR2A mRNA NR2B mRNA
5 854.9+137.0 894.6+118.5 904.4+94.6 灘且 5 0.2## 6.6## .5## .8** .6** .2**
.1** .9** .2** .0 .8** .3* .8* .4** .7** ME 组 .3** .1** .3**
.5** .6** .0** .1** .6** .2** 注： 与假手术组比较： m P&0.01 与模型组比较： *P&a05， **P&0.0L 表 7对 VaD大鼠血桨 SS水平的影响 （； C ±s)
删 η (pg/mL脑重）
灘且 9 228.98+32.80##
20 9 235.21+46.33
髓且 20 9 312.43+68.17**
2.5 10 265.58+23.93**
5 9 260.55+56.58
ME 组 10 9 279.55+35.10**
20 10 269.26+36.29*
40 6 248.88+43.10
注： 与假手术组比较： ** P&0.01 与模型组比较： &0.05, **P&0.01。 表 8 对 MID大鼠 MORRIS水迷宫潜伏期的影响（ ±s) 剂量 给药 4周 给药 8周 给药 8周 组别 动物数
(mg/kg) 第 5天 （s) 第 1天 （s) 第 5天 （s) 假手术组 11 17.15±9.77 37.16±23.86 12.50+9.09 模型组 11 68.11±69.15# 91.86±73.33# 45.23+36.41## 美金刚组 20.0 12 49.78+48.24 42.92+30.33* 24.09+25.74 烟酸组 20.0 12 16.03+13.94* 21.89±22.52** 13.64+9.22* 美 +烟等摩尔组 13.5+7.7 12 45.46+65.91 25.07+15.44* 22.67+25.67 MEN组 2.0 11 39.53±49.91 31.53+28.21* 19.60+14.94* MEN组 6.3 12 36.56+34.12 23.97+21.27** 17.33+10.45* MEN组 20.0 10 35.00+42.07 20.98+12.59** 10.67+4.84** 注： 与假手术组比较： * P&0.05, mP&0.01; 与模型组比较： *P&0.05, **P&0.01。
表 9 对 MID大鼠 MORRIS水迷宫路径长度的影响 （x ±s) 剂量 给药 4周 给药 8周 给药 8周 组别 动物数
(mg/kg) 第 5天 （s) 第 1天 （s) 第 5天 （s) 假手术组 11 220.7±135.02 384.4+317.8 139.5+99.5 模型组 13 914.0+950.5# .0# 597.8+455.7## 美金刚组 20.0 12 765.4± 783.9 553.3+489.4 326.7+370.5 烟酸组 20.0 12 214.0+185.9* 294.7+401.7* 168.5+123.0** 美 +烟等摩尔组 13.5+7.7 12 568.4+837.8 284.8+180.7* 303.0+392.8 MEN组 2.0 11 465.9+545.9 351.2+277.9* 293.7+269.6 MEN组 6.3 12 516.0+433.6 327.5+339.9* 223.0+145.8* MEN组 20.0 10 445.1+510.0 235.6+140.9** 125.3+66.5** 注： 与假手术组比较： * P&0.05， **Ρ&0.01; 与模型组比较： *P&0.05, **P&0.0 表 10对 MID大鼠皮层 Glu、 GABA水平的影响 （ ±s) 齐糧 Glu GABA 删 η ^g/g脑重） ( g g脑重）
11 123.88+56.73 18.93±10.14 灘且 13 75.33±14.06## 12.70±5.28#
m 20.0 12 153.58+108.39* 22.84+17.52* 髓且 20.0 12 105.48+36.17* 11.24+6.19 鋼 瞧 13.5+7.7 12 136.22+43.49** 18.69+5.81**
ME 组 2.0 11 123.14+26.98** 12.27+5.65
ME 组 6.3 12 128.81+78.66* 12.20+4.77
ME 组 20.0 10 135.76+44.99** 12.59±8.12 注： 与假手术组比较： m P&0.01 与模型组比较： *P&ft05， K0.01; 表 11 对 MID大鼠海马 Glu、 GABA水平的影响 （ ±s) 齐糧 Glu GABA 删 η ^g/g脑重） ( g g脑重）
11 109.43+52.82 24.21+17.34 灘且 13 59.44±23.99## 16.93±7.24
20.0 12 136.48+46.81** 18.21+10.76 髓且 20.0 12 96.85±21.39 23.21+8.76 鋼 瞧 13.5+7.7 12 129.17+39.82** 26.44+7.23** ME 组 2.0 11 94.22+32.66** 14.87+7.56
ME 组 6.3 12 97.98+40.28** 18.46+7.66
ME 组 20.0 10 128.74±23.26**A A 27.23+10.41* 注： 与假手术组比较： ** P&0.01 与模型组比较： *P&0.05, **P&0.01; 与烟酸组比较： "P&0.01 表 12对 MID大鼠 NMDA受体 NR1、 NR2A、 NR2B表达的影响 （ ±s ) 剂量 积分灰度值 （IOD ) 组别 (mg/kg) n
NR1 NR2A NR2B 5 831.65+212.64 732.65+119.08 877.15+115.13 灘且 5 .70## 9.14## 1.46##
20.0 5 .81** .68* .48** 髓且 20.0 5 .02** .23 .21** 鋼 瞧 13.5+7.7 5 .27** .17** .85** ME 组 2.0 5 .23* .31 .82** ME 组 6.3 5 .47* .62 .85** ME 组 20.0 5 .82** .46 .03** 注： 与假手术组比较： ** P&0.01 与模型组比较： &0.05, **P&0.01; 表 13 对 MID大鼠脑组织 CHAT及 ACHE活性的影响 （； ）
灘且 13 251.03±31.91# 3.332+0.886
^m m 20.0 14 312.72+23.18* 2.977+0.407 髓且 20.0 13 267.79+58.83 2.930+0.553 鋼 瞧 13.5+7.7 11 266.96+33.67 0.977+0.891** ME 组 2.0 11 284.83+31.82* 3.340±1.038
ME 组 6.3 11 290.67+47.66* 2.600+0.431*
ME 组 20.0 11 357.51+71.21**A A 3.299+0.448 注： 与假手术组比较： # P&0.05 与模型组比较： *P&0.05, **P&0.01; 与烟酸组比较： A AP&0.01 表 14对 MID大鼠脑组织 TNF水平的影响 （ X ）
11 1.97士1.00
灘且 13 3.97士 0.94#
20.0 14 3.52士 0.70
髓且 20.0 13 2.29士 0.46*
鋼 瞧 13.5+7.7 11 2.52士 0.73*
ME 组 2.0 11 3.21士 1.29
ME 组 6.3 11 2.74士 0.80
ME 组 20.0 11 2.30士 0.53*
注： 与假手术组比较： * P&0.05 与模型组比较： *P&0.05, **P&0.01 表 15 对 MCAO大鼠脑组织 SOD及 GSH-PX活性的影响 （ 士 灘且 13 367.57±116.90# 130.02+47.48#
20.0 10 337.42+89.60 128.37+49.62 髓且 20.0 14 371.97+89.89 153.05+45.23 鋼 瞧 13.5+7.7 13 350.08+51.13 120.43+24.63 ME 组 2.0 11 326.47+81.22 127.79+39.10 ME 组 6.3 11 356.54+33.93 137.93+42.17 ME 组 20.0 11 366.54+33.93 123.39+25.35 注： 与假手术组比较： * P&0.05 对 MCAO大鼠脑组织 MDA及血桨 NO水平的影响 （ ±s)
11 24.96+3.1 7.98±0.86 灘且 13 33.67+12.6# 7.64+2.71
20.0 10 24.91+6.3 6.20+1.85** 髓且 20.0 14 26.12+6.0 5.12+1.60** 鋼 瞧 13.5+7.7 13 24.01+2.3* 5.07+1.38** ME 组 2.0 11 23.96+5.0* 6.19+2.93 ME 组 6.3 11 24.27+3.2* 5.96+1.49 ME 组 20.0 11 24.66+4.6* 5.52+1.47* 注： 与假手术组比较： * P&0.05与模型组比较： *P&0.05, **P&ftW。 表 17对 MCAO大鼠脑组织 Glu、 GABA水平的影响 （ ±s) 齐糧 Glu GABA 删 n ^g/g脑重） ( g g脑重）
11 156.16+64.54 28.63+8.25 灘且 13 35.33±25.08## 9.84±5.62## ^m m 20.0 10 123.11+77.71** 23.20+16.25* 髓且 20.0 13 53.27+22.88 12.46+7.00 鋼 瞧 13.5+7.7 12 96.53+32.21** 21.48+11.62** ME 组 2.0 11 101.28+57.92** 17.19+9.31
ME 组 6.3 11 108.73+46.88** 16.18+9.32
ME 组 20.0 10 107.8+48.00** 20.66±10.15 注： 与假手术组比较： m P&0.01与模型组比较： *P&ft05， **P&0.01 表 18 对 MCAO大鼠皮层 NMDA受体 NR1、 NR2A、 NR2B表达的影响 （ ±s) 剂量 积分灰度值 （IOD )
组别 (mg/kg) n
NR1 NR2A NR2B 5 8.1 702.0+48.6 952.9+69.2 灘且 5 .0## .1## .8## m 20.0 5 .0 .6** .7** 髓且 20.0 5 .0 .3^ ' .7** 鋼 瞧 13.5+7.7 5 .2 .9=· :* 3.5** ME 组 2.0 5 .2 .6** .1** ME 组 6.3 5 .1 .4** .5** ME 组 20.Q 5 .3* .3** .8** ~~注： 与假手术组比较： ## P&0.01与模型组比较： K0.01 ;
19 对 MCAO大鼠脑组织 CHAT活性的影响 （； C ±s)
删 η (U/g)
灘且 13 103.12+47.27##
20.0 10 119.96+49.14
髓且 20.0 14 98.28+32.52
鋼 瞧 13.5+7.7 13 98.08+40.76
ME 组 2.0 11 121.26+31.43
ME 组 6.3 11 125.77+30.94
ME 组 20.0 11 128.89+30.12
注： 与假手术组比较： ** P&0.01
表 20 对大鼠 rCBF的影响 （； c ±s)
iCBF (%) 娜 J n 再數
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165
16.7 23.3 23.1 18.7 16.9 19.4 17.5 19.3 57.4 72.8 69.9 68.8 模型组 10 100
±2.8 ±3.2 ±3.3 ±3.5 ±3.6 ±3.5 ±3.5 ±3.6 ±26.2 ±27.3 ±27.2 ±28.8 20.9 24.2 19.1 18.7 17.8 16.6 16.3 18.4 49.2 82.0 82.6 86.7 美金刚组 20.0 10 100
±3.1 ±4.7 ±3.3 ±3.3 ±3.2 ±2.7 ±2.8 ±3.8 ±12.7 ±32.8 ±32.8 ±33. 16.3 54.4 45.8 54.9 55.5 54.3 51.8 51.4 107.2 112.7 115.4 119.9 烟酸组 20.0 10 100
±3.2 +9.4** ±8.2* +7 9*^ ' ±10.5** ±10.6** ±10.4** ±10.3** ±34.4 ±30.6 ±29.3 ±30. 18.9 24.5 24.3 24.2 25.4 26.4 26.5 26.8 20.4 21.9 23.1 21.4 美金刚 +烟酸组 13.5+7.7 10 100
±2.3 ±3.0 ±2.4 ±3.2 ±5.4 ±7.3 ±7.7 ±8.3 ±8.1 ±9.7 ±10.3 ±8.6 13.3 21.6 28.0 27.2 27.6 25.5 22.6 20.9 18.8 20.1 20.1 20.7 MEN组 2.0 10 100
±2.1 ±4.2 ±5.8 ±5.2 ±5.5 ±4.8 ±4.8 ±3.3 ±8.9 ±7.4 ±6.3 ±7.2 15.7 24.1 30.2 25.8 27.0 27.7 25.8 25.0 34.4 41.0 47.2 42.2 MEN组 6.3 10 100
±2.8 ±4.1 ±4.2 ±4.4 ±3.5 ±3.5 ±3.7 ±3.9 ±9.1 ±8.1 ±8.9 ±7.1 13.3 22.5 28.4 30.4 29.3 27.0 25.9 25.9 28.8 29.2 30.3 31.0 MEN组 20.0 10 100
±3.4 ±5.1 ±6.5 ±6.8 ±7.2 ±6.9 ±7.7 ±8.2 ±9.5 ±9.2 ±9.4 ±10. 注： 与模型组比较： *Ρ&0.05， **尸&0.01
表 21 对东莨菪碱所致小鼠获得性记忆障碍的影响 （x ±s)
剂量 5min内
(mg/kg) 错误次数 潜伏期 （S) 空白对照组 16 0.7士 0.8 173.8士132.9 模型组 15 1.7士1.7# 71.0士100.3# 美金刚组 30.0 16 1.6士1.2 141.5士107.8 烟酸组 30.0 16 1.4±1.4 146.1±130.3 美金刚 +烟酸组 20.2+11.52 16 1.1士1.3 177.3士118.8* MEN组 3.0 14 1.4士1.7 150.2士124.8 MEN1组 9.5 14 0.9士 1.1 171.4士 134.6* MEN组 30.0 14 0.9士 0.8 176.4士 119.1* 注： 与空白对照组比较： ff P&0.05 ; 与模型组比较： *P&0.05。 不同浓度 MEN和美金刚对 N DA受体与3 H-MK801结合的影响
组别 丽 DA受体与
3/4 -MK-801结合量 脑皮质悬液 + 3/4 -ΜΚ-801 (ΙΟηΜ) (空白对照组） 447. 96 ±66. 00
脑皮质悬液+美金刚 500ηΜ+ 3/4 -ΜΚ-801 (ΙΟηΜ) 195. 46 + 26. 94
lOOul脑皮质悬液+美金刚 100nM+3H-MK-801 (10nM) 343. 58 + 35. 89 *** lOOul脑皮质悬液 +Men 500nM+ 3/4 -MK-801 (10nM) 405. 29 ± 33. 78
lOOul脑皮质悬液 +Men 100nM+ 3/4 -MK-801 (ΙΟηΜ) 397. 58 ±62. 29 *
注： *** p&0. 001 , * p&0. 5vs空白对照组;
附图说明：
图 1-2为 MEN对缺血大鼠局部脑血流量的影响 图 3-14为 MEN对神经元、 星形胶质细胞及脑微血管内皮细胞的影响 图 15-17为 MEN对亲代谢型和离子型谷氨酸受体机制研究
图 1、 MEN对大鼠脑缺血 /再灌注局部脑血流量 （rCBF) 的影响 图 2、 MEN对大鼠脑缺血时局部脑血流量 （rCBF) 的影响
图 3、 正常星形胶质细胞加药 48小时 MTT值
图 4、 正常星形胶质细胞加药 48小时 MTT值 （重复）
图 5、 星形胶质细胞预加药 24h谷氨酸处理 2hMTT值
图 6、 星形胶质细胞预加药 24h谷氨酸处理 2hMTT值 （重复） 图 7、 星形胶质细胞预加药 24h谷氨酸处理 2h后再加药 48h测 MTT值
图 8、 星形胶质细胞预加药 24h谷氨酸处理 2h后再加药 48h测 MTT值 （重复） 图 9、 正常脑微血管内皮细胞加药 72hMTT值 图 10、 正常脑微血管内皮细胞加药 72MTT值 （重复）
图 11、 脑微血管内皮细胞预加药 24h谷氨酸处理 2h后再加药 24hMTT
图 12、 脑微血管内皮细胞预加药 24h谷氨酸处理 2h后再加药 24hMTT (重复） 图 13、 脑微血管内皮细胞预加药 24h谷氨酸处理 2h后再加药 96hMTT
图 14、 脑微血管内皮细胞预加药 24h谷氨酸处理 2h后再加药 120hMTT 图 15 激动剂及拮抗剂对 MPP+ 抑制星形胶质细胞 MTT的影响
图 16 MEN对 MPP+ 抑制星形胶质 MTT的影响
图 17 MEN逆转 1_甲基 _4_苯基吡啶离子 (MPP + )抑制谷氨酸摄入的影响
以下列举具体实例以进一步阐述本发明，应理解实例并非用于限制本发明的保护 范围。
DCC/DMAP法 (活性酯法)制备 N-(3-吡啶甲酰氧基）_3，5-二甲基 -1-金刚烷胺
2.46g (0.02mol)烟酸和 4.32g (0.02mol) 盐酸美金刚胺室温下溶于干燥的 120 mL DMF中， 滴加 2.30 mL无水 TEA后加入 0.30g (0.002mol) DMAP, 搅拌均勾。 于 0-5°C滴加 6.19g (0.03mol) DCC的50mL DMF溶液， 室温搅拌过夜， 过滤， 减压 浓缩， 加入适量乙酸乙酯， 过滤， 依次用水、 0.1N HC1、 饱和 NaHC03、 饱和食 盐水洗 3次， 无水硫酸镁干燥， 减压浓缩， 快速柱层析 (硅胶 H， 洗涤液： 石油醚- 丙酮)， 得 N-(3-吡啶甲酰氧基 ) -3,5-二甲基 -1-金刚烷胺， 无色粘稠状物质, 3.58 g， 产率 63%。
MS(EI) , m/z:284(M+)， 269(M+-C 3/4 ), 178(C12H2。NO+)， 106(C6H4NO+)， 78(C5H4N+)。
1HNMR(400MHz, CDC13)， (400MHz, D20+CDC13)， 8(ppm):
0.86(6H,s,美金刚胺两个甲基上的 H);l.l?2.4(13H,m,金刚烷上各碳原子上 的 H);5.86(lH,s,N-H,氘代后积分面积减少）； 7.33(lH,m,5-H); 8.02(lH,d, J=8Hz, 4-H); 8.65(lH,d, J=4Hz,6-H); 8.67(lH,s,2-H)。
IR(NaCl晶体涂抹)： 1417 cm"1, 1473 cm—1处的吸收峰为 吡啶环的骨架振动,其与羰基共轭，向低波数位移。 1317 cm— 1处的吸收峰为 C-N的 伸缩振动吸收峰， 1645 cm— 1处为酰胺的羰基吸收峰， 3309 cm— 1处为酰胺的 N-H的 伸缩振动峰。
CDI/DMAP法 (活性酯法)制备 N-(3-吡啶甲酰氧基) _3，5-二甲基 -1-金刚烷胺
0.62g (5 mmol)烟酸溶于干燥的 25 mL DMF溶液中，快速加入 0.81g (0.002mol) CDI和 0.08g (0.5 mmol)DMAP， 于 0-5°C搅拌反应 1 h。滴加 1.08g (5 mmol) 盐酸美 金刚胺的 2.30 mL无水 TEA和 25mL DMF溶液的混合溶液， 室温搅拌过夜， 减压 浓缩， 加入适量乙酸乙酯， 过滤， 依次用水、 0.1N HC1、 饱和 NaHC03、 饱和食 盐水洗 3次， 无水硫酸镁干燥， 减压浓缩， 快速柱层析 (硅胶 H， 洗涤液： 石油醚- 丙酮)， 得 N-(3-吡啶甲酰氧基 ) -3,5-二甲基 -1-金刚烷胺， 无色粘稠状物质, 0.99 g， 产率 70%。
混合酸酐法制备 N-(3-吡啶甲酰氧基) -3,5-二甲基 -1-金刚烷胺
冰盐浴下将 0.32 g (2.60mmol)烟酸溶于适量无水 CH2C12中， 依次缓慢滴加 1 mL (7.18 mmol) TEA和 0.4 mL (3.13 mmol) 无水苯磺酰氯， 搅拌反应 1 h， 力口 入 0.40 g ( 1.86 mmol)美金刚胺盐酸盐和 TEA的 CH2C12混合溶液， 搅拌反应 3 h， 减压浓缩， 加入适量乙酸乙酯， 过滤， 依次用水、 0.1 N HC1 、 饱和 NaHC03、 饱和食盐水洗 3次， 无水硫酸镁干燥， 减压浓缩， 得红色油状物， 柱层析分离纯 化 (硅胶 H, 洗脱液：石油醚-丙酮混合溶剂)得 N-(3-吡啶甲酰氧基） -3,5-二甲基 -1- 金刚烷胺， 无色粘稠状物质, 0.41 g， 产率 77%。 实施例 4
酰氯法制备 N-(3-吡啶甲酰氧基 ) _3，5-二甲基 -1-金刚烷胺
在干燥无水条件下， 装好干燥装置及气体吸收装置， 将 10 mL氯化亚砜加 入反应瓶中，用冰水浴冷却到 0°C左右，搅拌， 向其中加入 3.0 g(24.37mmol)烟酸， 并滴入 5-7滴无水 DMF， 油浴缓慢升温至 77°C左右回流， 3 h后减压蒸除过量氯化 亚砜， 得烟酰氯盐酸盐 (浅黄色固体)。 冰盐浴下向干燥的反应瓶中加入适量无水 丙酮， 强烈搅拌， 滴加 2.10 mL无水 TEA,加入盐酸美金刚胺 0.50 g C2.32 mmol),撤 去冰浴，换为油浴， 加热回流反应 2 h。 停止反应， 滤过， 滤液减压浓缩后加入适 量乙酸乙酯， 依次用水、 0.1N HC1、 饱和 NaHC03、 饱和食盐水洗至中性， 无水 硫酸镁干燥， 过滤， 减压浓缩， 快速柱层析 (硅胶 H， 洗涤液： 石油醚-丙酮)， 得 N-(3-吡啶甲酰氧基 ) -3,5-二甲基 -1-金刚烷胺，无色粘稠状物质, 0.64 g，产率 97%。 实施例 5
N-(3-吡啶甲酰氧基 ) _3，5-二甲基 -1-金刚烷胺盐酸盐的制备
将 1 g (3.5 mmol)N-(3-吡啶甲酰氧基） -3,5-二甲基 -1-金刚烷胺溶于 30ml乙醚 和 30ml异丙醇中， 缓缓滴加适量重量浓度为 14%的盐酸溶液， 析出白色固体， 过 滤， 异丙醇 -水重结晶， 干燥得 N-(3-吡啶甲酰氧基） -3,5-二甲基 -1-金刚烷胺盐酸 盐 1 g， 经 HPLC分析， 含量 98%。
Ν-(3-吡啶甲酰氧基 ) _3，5-二甲基 -1-金刚烷胺硫酸盐的制备
将 1 g (3.5 mmol)N-(3-吡啶甲酰氧基） -3,5-二甲基 -1-金刚烷胺溶于 30ml乙醚 和 30ml丙酮中，缓缓滴加适量重量浓度为 20%的硫酸溶液，析出白色固体，过滤， 丙酮 -水重结晶，干燥得 N-(3-吡啶甲酰氧基 ) -3,5-二甲基小金刚烷胺硫酸盐 1.2 g， 经 HPLC分析， 含量 98%。
N-(3-吡啶甲酰氧基 ) _3，5-二甲基 -1-金刚烷胺柠檬酸盐的制备
将 1 g (3.5 mmol)N-(3-吡啶甲酰氧基） -3,5-二甲基 -1-金刚烷胺溶于 40 ml石油 醚和 20 ml丙酮中， 加入 0.7 g(3.5 mmol)柠檬酸， 回流 1 h， 冷却， 减压浓缩析出白 色固体， 丙酮 -水重结晶， 干燥得 N-(3-吡啶甲酰氧基） -3,5-二甲基 -1-金刚烷胺柠 檬盐 1.3 g， 经 HPLC分析， 含量 98%。 实施例 8
N-(3-吡啶甲酰氧基 ) _3，5-二甲基 -1-金刚烷胺盐酸盐片剂的制备
处方 ( 10000片)
制备方法： 将 N-(3-吡啶甲酰氧基） -3,5-二甲基 -1-金刚烷胺盐酸盐粉碎并过 100 目筛， 称重后， 与已过 100目筛的预胶化淀粉、 磷酸氢钙及乳糖混合均勾， 加入 10%淀粉浆制成软材， 以 16目尼龙筛制粒， 湿粒于 40°C干燥， 干颗粒与硬脂酸镁 混合均勾， 再经 16目筛整粒， 经含量测定后， 计算出片重， 选择 6mm浅凹或平冲 模压片即得。 成人推荐口服用量 1 片 /次， 2次 /日。
N-(3-吡啶甲酰氧基 ) _3，5-二甲基 -1-金刚烷胺盐酸盐胶囊剂的制备
处方 ( 10000粒)
制备方法： 将 N-(3-吡啶甲酰氧基） -3,5-二甲基 -1-金刚烷胺盐酸盐粉碎并过 100目 筛， 称重后， 与已过 100目筛的淀粉、 微晶纤维素混合均勾， 加入 10%淀粉浆制 成软材， 以 16目尼龙筛制粒， 湿粒于 40°C干燥， 干颗粒再经 16目筛整粒， 分装于 3号硬胶囊壳， 盖上节， 压平， 打光即可。 成人推荐口服用量 1粒 /次， 2次 /日。 实施例 10
N-(3-吡啶甲酰氧基 ) _3，5-二甲基 -1-金刚烷胺马来酸盐的制备
将 1 g (3.5 mmol)N-(3-吡啶甲酰氧基） -3,5-二甲基 -1-金刚烷胺溶于 40 ml石油 醚和 20 ml乙酸乙酯中， 加入 0.4 g(3.5 mmol)马来酸的乙酸乙酯溶液， 回流 1 h， 冷 却，减压浓缩析出白色固体，异丙醇 -水重结晶，干燥得 N-(3-吡啶甲酰氧基 ) -3,5- 二甲基 -1-金刚烷胺马来酸盐 1.1 g， 经 HPLC分析， 含量 98%。
N-(3-吡啶甲酰氧基 ) _3，5-二甲基 -1-金刚烷胺盐酸盐口服液的制备
处方 ( 10000 ml)
制备方法： 分别称取 N-(3-吡啶甲酰氧基） -3,5-二甲基 -1-金刚烷胺盐酸盐、 山梨酸钾，溶于适量蒸馏水中，加入果味香精后添加蒸馏水至全量，搅勾，过滤， 滤液分装于 10 ml棕色瓶中， 于 100°C流通蒸汽灭菌 30min即得。成人推荐口服 用量 10 ml/次， 2次 /日
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