为什么设计qpcr的qpcr引物设计要位于5'utr

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-08-20 03:10 标签： qpcr引物长度
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荧光定量PCR引物设计
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你可能喜欢我想克隆表达ORF,是否一定要从+1开始设计引物,还是可以包含一段5‘UTR只要不改变阅读框架就可以.
zuibhouy1754
不一定,但是如果上游处比ORF还要前面的话,一定要3个碱基往前挪引物,不然会导致后面翻译时氨基酸改变.
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可以包含，不改变阅读框就行
扫描下载二维码为何QPCR引物设计在跨外显子的接头区?(外显子,引物设计,引物,基因组) - PCR实验 - 生物秀
标题: 为何QPCR引物设计在跨外显子的接头区?(外显子,引物设计,引物,基因组)
摘要: [为何QPCR引物设计在跨外显子的接头区?(外显子,引物设计,引物,基因组)]
"实时定量PCR物设计原则中引物产物的长度应该在60-300之间，最好是在80-150之间，而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。 "这是搜索后找到的关于QPCR设计的帖子，但一直想不明白，请教一下，为什么引物设计在跨外显子的接头区就可以更有效的不受基因组DNA污染的影响，刚刚做Q 关键词:[外显子 引物设计 引物 基因组 实时定量]……
"实时物设计原则中引物产物的长度应该在60-300之间，最好是在80-150之间，而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组污染的影响。"这是搜索后找到的关于QPCR设计的帖子，但一直想不明白，请教一下，为什么引物设计在跨外显子的接头区就可以更有效的不受基因组DNA污染的影响，刚刚做QPCR，请您指教！多谢！
回复因为内含子只存在于基因组序列中，CDNA序列中没有内含子；所以跨越内含子的引物只能和cDNA结合，不能和基因组DNA结合。另外i，可以用酶处理抽提好的RNA来消除污染。回复谢谢指教！还有一处不明，是不是可以这样理解，举例来说，比如把引物设计在exon2和exon3的接头处，跨越这两个exon，那我在设计时还要先将cDNA和基因组DNA比对一下，先找到exon的位置才能设计阿，而不能直接用cDNA设计了，因为直接用cDNA设计，无法知道哪里是exon阿。多谢了
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【求助】请教一个关于rt-pcr引物设计很初级的问题
各位高手，请教一个问题，我查到的基因CDS序列是不是就是编码这个基因的mRNA序列（去除了3‘5’UTR），我设计rt-pcr引物直接就用这段序列好了。上面写的reverse complement即反向互补是什么意思，我用这段序列设计引物还需要先对它进行转换吗？就是说列出的这段序列是其cds的反向互补序列（即模板链？）比如下面这个基因&YFL039C
reverse complementATGGATTCTGAGGTTGCTGCTTTGGTTATTGATAACGGTTCTGGTATGTGTAAAGCCGGTTTTGCCGGTGACGACGCTCCTCGTGCTGTCTTCCCATCTATCGTCGGTAGACCAAGACACCAAGGTATCATGGTCGGTATGGGTCAAAAAGACTCCTACGTTGGTGATGAAGCTCAATCCAAGAGAGGTATCTTGACTTTACGTTACCCAATTGAACACGGTATTGTCACCAACTGGGACGATATGGAAAAGATCTGGCATCATACCTTCTACAACGAATTGAGAGTTGCCCCAGAAGAACACCCTGTTCTTTTGACTGAAGCTCCAATGAACCCTAAATCAAACAGAGAAAAGATGACTCAAATTATGTTTGAAACTTTCAACGTTCCAGCCTTCTACGTTTCCATCCAAGCCGTTTTGTCCTTGTACTCTTCCGGTAGAACTACTGGTATTGTTTTGGATTCCGGTGATGGTGTTACTCACGTCGTTCCAATTTACGCTGGTTTCTCTCTACCTCACGCCATTTTGAGAATCGATTTGGCCGGTAGAGATTTGACTGACTACTTGATGAAGATCTTGAGTGAACGTGGTTACTCTTTCTCCACCACTGCTGAAAGAGAAATTGTCCGTGACATCAAGGAAAAACTATGTTACGTCGCCTTGGACTTCGAACAAGAAATGCAAACCGCTGCTCAATCTTCTTCAATTGAAAAATCCTACGAACTTCCAGATGGTCAAGTCATCACTATTGGTAACGAAAGATTCAGAGCCCCAGAAGCTTTGTTCCATCCTTCTGTTTTGGGTTTGGAATCTGCCGGTATTGACCAAACTACTTACAACTCCATCATGAAGTGTGATGTCGATGTCCGTAAGGAATTATACGGTAACATCGTTATGTCCGGTGGTACCACCATGTTCCCAGGTATTGCCGAAAGAATGCAAAAGGAAATCACCGCTTTGGCTCCATCTTCCATGAAGGTCAAGATCATTGCTCCTCCAGAAAGAAAGTACTCCGTCTGGATTGGTGGTTCTATCTTGGCTTCTTTGACTACCTTCCAACAAATGTGGATCTCAAAACAAGAATACGACGAAAGTGGTCCATCTATCGTTCACCACAAGTGTTTCT。还有，看到大家推荐设计rt-pcr引物时为了避免rt的效率，推荐靠近3‘端，就是我查到的cds区的3’端吗？my god，这些概念我一不留神就总是弄混了，谢谢指教！没有人能回答吗？我只是想确定一下就开始设计了用BLASTX比对了一下你给出的这个序列，你查到的此基因序列是编码这个基因的与mRNA序列（去除了3‘5’UTR）一致的cDNA序列，而不是其反向互补的序列。因此用这段序列设计引物就可以，不需要对它进行转换。如果你欲采用Oligo(dT）作引物进行RT―PCR则需要了解以下方面的内容：1
Oligo(dT)：是一种对mRNA 特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA 可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA 的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。如果你欲采用特异性引物进行RT―PCR则需要了解以下方面的内容，此时建议设计的引物靠近3’端位置，设计出来的引物应该是和对应的mRNA序列互补。2
特异性引物：用含目标RNA 的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR 反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。缺点是只能用于单一基因的PCR实验。以下是引物设计的3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。具体实现这3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列Tm 值 (melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, 用ΔG 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex ormation and hairpin）的能值，在错配位点（ false priming site ） 的引发效率， 引物及产物的GC 含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。根据有关参考资料[24]，引物设计应注意如下要点：1）引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。2）引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。3）引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。4）引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC 含量不能相差太大。5）引物所对应模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method) 。6）ΔG 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG 值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG 值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。 7）引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。8）对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列。谢谢你的解答，我有数了。
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