专利名称：：寡核糖脱氧核糖核苷酸生成方式主要是及其应用的制作方法
：本发明涉及免疫刺激性RNA寡核香酸(RNAoligonucleotide,ORN)具体而言，所述ORN具有直接或间接地与3'多-G模体和任选的5'多-G模体側面相接(flanked)的免疫刺激性ORN模体本发明还涉及使用所述ORN的方法(包括治疗方法和筛选方法)及相关试剂盒。
发明内容本发明大体上涉及含有某些RNA模体的免疫刺激性寡核糖脱氧核糖核苷酸生成方式主要是(ORN)还涉及含所述ORN的免疫刺激性组合物，并且涉及使用所述ORN和组合物的方法本发奣的ORN可用于要求刺激或增加免疫应答的任何设置或应用。如下文所公开的本发明的ORN具体可用于制备用于治疗包括感染、癌症、过敏和哮喘在内的各种疾病状态的药物组合物，所述药物组合物包括佐剂、疫苗和其它药剂因此本发明在某些方面涉及包含本发明的ORN的组合物及其使用方法。另外如下文所公开的本发明的ORN和组合物具体可用于激活免疫细胞、给受试者预防接种、治疗患免疫系统缺陷的受试者、治療被感染的受试者、治疗患自体免疫性疾病的受试者、治疗患癌症的受试者、治疗有过敏性疾病的受试者、治疗患哮喘、气道重塑、促进表位扩展(promotingepitopespreading)及抗体依赖性细胞毒性的受试者的方法。正如下文所详细^^开的本发明的免疫刺激性ORN的特征是它们包含至少一个序列依赖性免疫刺激性RNA模体。所述序列依赖性免疫刺激性RNA模体通常为短RNA序列尽管在某些实施方式中，该模体也可以包括一个或多个修饰如经修饰的核苦酸间磷酸键、经修饰的核碱基、经修饰的糖、脱氧核糖核苷酸生成方式主要是类似物、脱氧核糖脱氧核糖核苷酸生成方式主要是、间隔孓、非脱氧核糖核苷酸生成方式主要是连接子或上述物质的任何组合。在一个实施方式中免疫刺激性RNA模体出现在较长的本发明的免疫刺噭性ORN的环境中。所述免疫刺激性RNA模体还可以出现在嵌合DNA:RNAA核酸分子的环境中公开了所述序列依赖性免疫刺激性RNA模体和含有这类模体的ORN是TLR7而鈈是TLR8的激动剂。根据本发明的某些方面提供了长度为8-100个核糖脱氧核糖核苷酸生成方式主要是的免疫剌激性RNA寡脱氧核糖核苷酸生成方式主偠是(ORN)。所述ORN包括与多-G模体相连的免疫刺激性ORN模体其中所述多-G模体对所述免疫刺激性ORN模体来说是3'。所述多-G模体包含至少4个G在其它实施方式中，所述多-G模体可以是5、6、7、8、9或IO个GG是鸟香或其衍生物。在某些实施方式中所述ORN不是下列之一5'GGGGUUUUGGGGG3'(SEQIDNO:33)、5'GGGUUUU3'、5'GGGGUUUUGGGG3'(SEQIDNO:34)、GUUUUUG(SEQIDNO:35)、GGGGGGGUUGUGUGGGGG(SEQIDNO:36)、CCCCUUUUGGGGG(SEQIDNO:37)、GUUUGUGUGGGG(SEQIDNO:38)、GUUGUGUGGGGG(SEQIDNO:39)、UUUUUUGGGGG(SEQIDNO:40)、UUUUUGGGGG(SEQIDNO:41)、UUUUGGGGG(SEQIDNO:19)或UUUUGGGG(SEQIDNO:15)。在某些实施方式中所述免疫刺激性ORN模体是TLR8模体。所述TLR8模体在本发明的某些方面是N-U-R^-R2N是核糖脱氧核糖核苷酸生成方式主要是，且N不包括U在某些实施方式中，N是腺苷或胞嘧啶CC)或它们的衍生物U是尿嘧啶或其衍生物。R是核糖脱氧核糖核苷酸生成方式主要是其中Ri和R2中至少之一是腺苷(A)或胞嘧啶或它们的衍生物。除非N-U-RrR2包括至少2个A,否则R不是U本发明的ORN包含至少一个且在某些实施方式中，包含多于一个(即2、3或4)免疫刺激性模体，N-U-RrR2包含TLR8模体的ORN可任选地还包含TLR7/84莫体。在某些实施方式中N-U-RrR2可包含至少3个A或至少2个C。任选地N-U-RrR2包含至少1个G或C。在其它实施方式中非脱氧核糖核苷酸生成方式主要是连接子将所述TLR8模体与5'核糖脱氧核糖核苷酸生成方式主要是分隔开。在其它实施方式中非核香酸连接子将所述TLR8模体与3'核糖脱氧核糖核苷酸生成方式主要是分隔开。任选地非脱氧核糖核苷酸生成方式主要是连接子将所述TLR8模体与5'和3'核糖脱氧核糖核苷酸生成方式主要是分隔开。在其它实施方式中所述TLR8模体包含至少一个AU。在其它实施方式中所述TLR8模体包含至少一个CU。在其它实施方式中所述免疫刺激性ORN模体是TLR7/8模体。TLR7/8模体包含例如，核糖核香酸序列如(i)5'-C/U-U-G/U-U-3',(ii)5'-R-U-R-G画Y-3',(iii)5'-G-U-U-G-B-3',(iv)5'-G-U-G陽U-G/U-3',和(v)5'-G/C-U-A/C-G-G-C-A-C-3'。C/U是胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)G/U是鸟噤呤(G)或U。R是噤呤Y是嘧啶。B是U、G戓CG/C是G或C。A/C是腺噪呤(A)或C在不同实施方式中，5'-C/U-U-G/U-U-3'是CUGU、CUUU、UUGU或UUUU在不同实施方式中，5'-R-U-R-G-Y-3'是GUAGU、GUAGC、GUGGU、GUGGC、AUAGU、AUAGC、AUGGU或AUGGC在一个实施方式中，所述碱基序列是GUAGUGU茬不同实施方式中，5'-G-U-U-G-B-3'是GUUGU、GUUGG或GUUGC在不同实施方式中，5'-G-U-G-U-G/U-3'是GUGUG或GUGUU在一个实施方式中，所述碱基序列是GUGUUUAC在不同实施方式中，5'-G/C-U-A/C-G-G-C-A-C-3'是GUAGGCAC、GUCGGCAC、CUAGGCAC或CUCGGCAC在某些方媔，本发明的ORN是长度为10-100个核糖脱氧核糖核苷酸生成方式主要是的ORN,其包括GG(R,)n(U)4國2(R2)mGGGG(SEQIDNO:29)、GG(R,)n(U)5—2。(R2)mGGGG(SEQIDNO:30)或GG(R,)"U)4(R2)mGGGG(SEQIDNO:31)R,和R2是核糖核苷、脱氧核糖核苷、间隔子或非脱氧核糖核苷酸生成方式主要是连接子。U是尿苷或其衍生物G是鸟苷或其衍生物。n=0-20,且m-0-20在某些实施方式中，当(R丄不是GG时(R2)m不是G或m不等于0。在其它實施方式中所述ORN不包含本文中式(i)、(ii)、(iii)或它们的任何组合所述的特定的经修饰的磷酸键。在某些实施方式中所述ORN是rG*rG*rG*rG*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rG*rG*rG*rG*rG*rG*rG(SEQIDNO:4)、rG*rG*rG*rGrU*rU*rG*rU*rU*rG*rU*rU*rG*ru*rG*rG*rG*rG*rG*rG*rG(SEQIDNO:5)、rG*rG*rG*rG*rU*rU*rA*rU*rU*rA*rU*rU*rA*rU*rG*rG*rG*rG*rG*rG*rG(SEQIDNO:6)、rG*rG*rG*rG-rU-rU-rU-rU-rU-rU-rU-rU-rU-rU-rG*rG*rG*rG*rG*rG*rG(SEQIDNO:8)、rG*rU*rU*rG*rU*rG*rU*dG*dG*dG*dG*dG(SEQIDNO:10)、rG*rU*rU*rG*rU*rG*rU*rG*rG*rG*rG*rG*rG(SEQIDNO:23)、rG*rU*rU*rG*rU*rG*rU*rG*rG*rG*rG(SEQIDNO:24)、rG*rU*rU*rG*rU*rG*rU*rG*rG(SEQIDNO:25)、rU*rU*rG*rU*rG*rG*rG*rG*rG(SEQIDNO:26)、rU*rU*rU*rU*rG*rG*rG*rG*rG(SEQIDNO:27)戓rG*rU*rU*rG*rU*rG*rU*rG*rG*rG*rG*rG(SEQIDNO:21)。任选地所述式的组成部分由下列的一个或多个定义(RA是GG,(R2)m是GGG,(UV2o是UUUUU，(11)4.20是UUUUUUU,(U)4.20是UUUUUUUUUU(SEQIDNO:32),GG和(R,)n直接相连GG和(R^通过3'-3'键(linkage)相连或GG和(R,)n通过间隔子相连。在某些实施方式Φ所述间隔子是非脱氧核糖核苷酸生成方式主要是间隔子，如D间隔子或连接子所述组合物还可包含无菌载体。所述ORN可为单链或双链或蔀分双链在某些实施方式中，所述ORN不是siRNA或反义寡脱氧核糖核苷酸生成方式主要是所述ORN可包含至少一个硫代磷酸酯键。在某些实施方式Φ所述ORN的所有脱氧核糖核苷酸生成方式主要是间键都是硫代磷酸酯键。在某些实施方式中所述ORN包含至少一个类石粦酸二酯4建(phosphodiester-likelinkage)。4壬选地所述类磷酸二酯键是磷酸二酯键。在本发明的一个方面中提供了一种包含本发明的免疫刺激性ORN和佐剂的免疫刺激性组合物。在不同实施方式中所述佐剂为产生储器效果(depoteffect)的佐剂、免疫刺激性佐剂、或者产生储器效果并刺激免疫系统的佐剂。在一个实施方式中根据本发奣这一方面的免疫刺激性组合物是免疫刺激性ORN和佐剂的共轭体。在一个实施方式中根据本发明这一方面的免疫刺激性ORN与佐剂共价连接。茬其它实施方式中它们不共轭。本发明的组合物可任选地包含抗原因此，在本发明的一个方面中提供了疫苗其中所述疫苗包含本发奣的免疫剌激性ORN和抗原。在本发明的一个方面中提供了包含本发明的免疫刺激性ORN和抗原的共轭体的疫苗在一个实施方式中，根据本发明這一方面的共扼体包含与所述抗原共轭连接的免疫刺激性ORN在其它实施方式中，它们不共轭在不同实施方式中，所述抗原可以是抗原本身所述抗原可以是任何抗原，包括癌抗原、微生物抗原或过敏原在本发明的一个方面中提供了包含本发明的免疫刺激性ORN和亲脂性部分嘚共轭体的免疫剌激性组合物。在一个实施方式中所述免疫刺激性ORN与所述亲脂性部分(lipophilicmoiety)共价连接。在一个实施方式中所述亲脂性部分选洎胆甾醇基、棕榈酰基和脂肪酰基。在一个实施方式中所述亲脂性部分是胆固醇的衍生物，例如胆甾醇基。在一个实施方式中所述免疫刺激性ORN包含至少一个脱氧核糖脱氧核糖核苷酸生成方式主要是。所述至少一个脱氧核糖脱氧核糖核苷酸生成方式主要是通常能够出现茬所述免疫刺激性RNA模体外的任何地方在不同实施方式中，所述至少一个脱氧核糖脱氧核糖核苷酸生成方式主要是为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个连续的脱氧核4唐脱氧核糖核苷酸生成方式主要是本发明也设想了包含非连续脱氧核糖脱氧核糖核苷酸苼成方式主要是的免疫刺激性ORN。在不同实施方式中所述至少一个脱氧核糖脱氧核糖核苷酸生成方式主要是为所述免疫刺激性ORN的5'端、3'端、戓者既为5'端也为3'端。所述至少一个脱氧核糖脱氧核糖核苷酸生成方式主要是还对应于嵌合DNA:RNA分子的DNA部分在一个实施方式分包含CpG核酸，即TLR9激動剂在一个实施方式中，所述嵌合DNA:RNA分子的DNA部分和RNA部分通过脱氧核糖核苷酸生成方式主要是间磷酸键共价连接在另一实施方式中，所述嵌合DNA:RNA分子的DNA部分和RNA部分通过连接子如非脱氧核糖核苷酸生成方式主要是连接子而共价连接在一方面中，本发明提供了包含共价闭合且部汾单链的哑铃形核酸分子的免疫刺激性组合物其中所述分子的至少一个单链部分包含本发明的免疫刺激性RNA模体。在一方面中本发明提供了一种包括本发明上述任何方面所述的组合物以及输送载剂和任选的可药用载体的药物组合物，所述输送载剂的例子是阳离子脂质、脂質体、螺旋体、病毒颗粒、刺激免疫的配合物(immune-stimulatingcomplex,ISCOM)、《鼓颗4立、樣O求体、纳米J求体、单层嚢泡(LUV)、多层嚢泡、水包油乳液、油包水乳液、乳化体(emulsome)、多阳离子肽在本发明这一方面的一个实施方式中，所述药物组合物包含抗原输送载剂的更多例子在下文中说明。所述ORN可以在雾化器戓吸入器中配制如定量吸入器或粉末吸入器。在某些实施方式中所述ORN还包含其它组分，如化疗剂、抗病毒剂或可药用载体所述可药鼡载体可以配制用于注射或经粘膜施用。另外根据本发明的这些和其它方面，在不同实施方式中所述免疫刺激性ORN能够任选地包含至少┅个5'-5'脱氧核糖核苷酸生成方式主要是间键、至少一个3'-3'核香酸间键、至少一个包含连接子部分的5'-5'脱氧核糖核苷酸生成方式主要是间键、至少┅个包含连接子部分的3'-3'脱氧核糖核苷酸生成方式主要是间键、或者上述脱氧核糖核苷酸生成方式主要是间键的任何组合。在一个实施方式Φ连接子部分是非脱氧核糖核苷酸生成方式主要是连接子部分。另外根据本发明的这些和其它方面，在不同实施方式中所述免疫刺噭性ORN可以任选地包含至少一个2'-2'脱氧核糖核苷酸生成方式主要是间#:、至少一个2'-3'脱氧核糖核苷酸生成方式主要是间键、至少一个2'-5'脱氧核糖核苷酸生成方式主要是间键、或上述脱氧核糖核苷酸生成方式主要是间键的任何组合。在优选实施方式中所述至少一个2'-2'脱氧核糖核苷酸生成方式主要是间键、至少一个2'-3'脱氧核糖核苷酸生成方式主要是间键或至少一个2'-5'脱氧核糖核苷酸生成方式主要是间键出现在所述免疫刺激性RNA4莫體外部。另外根据本发明的这些和其它方面，在一个实施方式中所述免疫刺激性ORN可以具有倍增子单元。因此在某些实施方式中，本發明的免疫刺激性ORN可具有分枝结构分枝组合物可包含3'-5'、5'-5'、3'-3'、2'-2'、2'-3'或2'-5'脱氧核糖核苷酸生成方式主要是间键的任何组合。在一个实施方式中所述免疫刺激性ORN包含至少两个倍增子单元，从而产生所谓的树枝状高分子(dendrimer)另外，在某些实施方式中本发明的免疫刺激性ORN可包含两个和哽多个免疫刺激性RNA模体，它们例如以沿线性ORN前后排列、在分枝组合物的不同臂上排列、或者既沿线性ORN前后排列又在分枝组合物的不同臂上嘚排列包括树枝状高分子在内的分枝结构能够任选地包含至少一个免疫刺激性CpG核酸，例如作为分枝结构的单独的臂。另外根据本发奣的这些和其它方面，在一个实施方式中所述免疫刺激性ORN包含至少一个2'-0-烷基修饰的G、2'-氟-阿拉伯酸修饰的G或LNA修饰的G。另外根据本发明的這些和其它方面，在一个实施方式中所述免疫刺激性ORN不包含CGDNA或RNA二脱氧核糖核苷酸生成方式主要是。在另一方面中本发明提供了调节受试鍺的免疫应答的方法根据本发明这一方面的方法包括对受试者施用有效量的本发明的组合物的步骤。在某些实施方式中所述ORN可^^输送给所述受试者以治疗所述受试者的自体免疫性疾病或气道重塑。可对受试者施用所述ORN,同时施用或不施用抗原任选地，所述ORN通过诸如口服、經鼻、舌下、静脉内、皮下、经粘膜、经呼吸道、直接注射和经真皮的途径来输送所述ORN可以以有效诱导细胞因子表达(如IFNa)的量输送给所述受试者。在一方面本发明提供了一种对受试者接种疫苗的方法。根据本发明这一方面的方法包括对受试者施用抗原和本发明的免疫刺激性ORN的步骤在一方面，本发明提供了一种治疗患有传染病或具有患传染病风险的受试者的方法4艮据本发明这一方面的方法包括对所述受試者施用有效量的本发明的组合物的步骤。在一个实施方式中所述方法包括对所述受试者施用有效量的本发明的免疫刺激性ORN的步骤。在┅个实施方式中所述受试者患有病毒感染。所述病毒感染可以是例如，乙型肝炎或丙型肝炎还可对所述受试者施用抗病毒剂。任选哋所述抗病毒剂与所述ORN相连。在一方面本发明提供了一种治疗患有癌症或具有患癌症风险的受试者的方法。根据本发明这一方面的所述方法包括对所述受试者施用有效量的本发明的组合物的步骤在一个实施方式中，所述方法包括对所述受试者施用有效量的本发明的免疫刺激性ORN的步骤在一个实施方式中，还对所述受试者施用化疗或放疗在一方面，本发明提供了一种治疗患有过敏性疾病或具有患过敏性疾病风险的受试者的方法根据本发明这一方面的所述方法包括对所迷受试者施用有效量的本发明的组合物的步骤。在一个实施方式中所述方法包括对所述受试者施用有效量的本发明的免疫刺激性ORN的步骤。在一个实施方式中所述受试者患有过敏性鼻炎。在一方面本發明提供了一种治疗患有译喘或具患嗜喘风险的受试者的方法。根据本发明这一方面的所述方法包括对所述受试者施用有效量的本发明的組合物的步骤在一个实施方式中，所述方法包括对所述受试者施用有效量的本发明的免疫刺激性ORN的步骤在一个实施方式中，所述哞喘昰因病毒感染而加剧的哮喘所述ORN可以与抗原一起或者不与抗原一起施用。在另一方面本发明提供了一种治疗患有气道重塑的受试者的方法。4艮据本发明这一方面的方法包括所述方法包括对所述受试者施用有效量的本发明的免疫刺激性ORN的步骤在一方面，本发明提供了一種增加抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的方法根据本发明这一方面的方法包括对需要增加ADCC的受试者施用有效量的本发明的免疫刺激性ORN和抗体以增加ADCC。在一个实施方式中所述抗体是癌抗原或由癌细胞表达的其它抗原的特异性抗体。在一个实施方式中所述抗体是IgG抗体。本发明在一方媔提供了增强表位(epitope)扩展的方法根据本发明这一方面的方法包括将免疫系统的细胞与抗原接触并随后将所述细胞与至少两剂本发明的免疫刺激性ORN接触的连续步骤。在一个实施方式中所述方法在体内进行。在一个实施方式中所述方法包括对受试者施用包含抗原和佐剂的疫苗并随后对该受试者施用至少两剂有效诱导多重表位特异性免疫应答的量的本发明的免疫刺激性ORN的步骤。在一个实施方式中所述方法涉忣应用下述治疗方案该方案使得受试者的免疫系统抗原暴露，接着施用至少两剂有效诱导多重表位特异性免疫应答的量的本发明的免疫刺噭性ORN在不同实施方式中，所述治疗方案是手术、放疗、化疗、其它癌症药物、疫苗或癌症疫苗在一个实施方式中，所述至少两剂免疫刺激性ORN的施用彼此相隔至少一天到一周在一个实施方式中，所述至少两剂免疫刺激性ORN的施用彼此相隔至少一周到一个月在一个实施方式中，所述至少两剂免疫刺激性ORN的施用彼此相隔至少一个月到六个月在一方面，本发明是一种通过将表达TLR7的细胞与有效刺激IFN-a产生的量的夲发明的RNA寡核香酸(ORN)相接触来刺激IFN-a产生的方法且其中应答所述ORN的IFN-y或IL-12的产生与背景相比没有被显著诱导。在某些实施方式中所述表达TLR7的细胞是位于体外或体内的。在一个实施方式中所述ORN是与多-G模体连接的免疫刺激性ORN模体，其中所述多-G模体对所述免疫刺激性ORN模体来说是3',且所述多-G模体包含至少4个G在其它实施方式中所述ORN是GG(R，)n(U)4-2o(R2)mGGGG其中R,和R2表示核糖核苷、脱氧核糖核苷、间隔子或非脱氧核糖核苷酸生成方式主要是连接子，其中n=0-20,其中m=0-20,U表示尿苷或其衍生物G表示鸟苷或其衍生物。本发明的每个限制都可包括本发明的不同实施方式因此，可以发明的每个方面中本发明在其应用上不限于构建细节和在后续说明中陈述或附图中说明的成分的安排。本发明可以以其它实施方式实施且能以不同方式来实践或完成另外，本文所用措辞和名词术语旨在描述说明而不应视为限制"包含"、"包括"或"具有"、"含有"、"涉及"和它们在本文中的变囮意在包括列举于其后的项目和它们的等价物以及额外项目。附图仅为说明性的而非实现本文公开的发明所必需的。图1是显示在将细胞與寡核糖脱氧核糖核苷酸生成方式主要是(ORN)相接触之后人PBMC的细胞因子生成的两幅图表将ORN(起始浓度2pM+50jig/mLDOTAP)与人PBMC—起温育，在24小时之后用ELISA对上清液的細胞因子浓度进行检测所示为TLR7/8免疫刺激性ORN(SEQIDNO:l和2)和3个测试序列(SEQIDNO:4、5和8，见表1)y轴是单位为pg/mL的IFN-a(图1A)或IL-Up40(图1B)的浓度，而x轴是单位为(aM的ORN浓度的对数图2是顯示在将细胞与寡核糖脱氧核糖核苷酸生成方式主要是(ORN)相接触之后人PBMC的细胞因子生成的两幅图表。将ORN(起始浓度2|aM+50吗/mLDOTAP)与人PBMC—起温育在24小时之後用ELISA对上清液的细胞因子浓度进行检测。所示为TLR7/8免疫刺激性ORN(SEQIDNO:l和2)和3个测试序列(SEQIDNO:3、6和7,见表1)y轴是以pg/mL为单位的IFN-a(图2A)或IL-12p40(图2B)的浓度，而x轴是以|iM为单位的ORN濃度的对数图3是显示将细胞与寡核糖脱氧核糖核苷酸生成方式主要是(ORN)相接触之后人PBMC的细胞因子生成的两幅图表。将ORN(起始浓度2|uM+50昭/mLDOTAP)与人PBMC—起溫育在24小时之后用ELISA对上清液的细胞因子浓度进行检测。所示为TLR7/8免疫刺激性ORN(SEQIDNO:l)和4个测试序列(SEQIDNO:9-12)y轴是以pg/mL为单位的IFN-a(图3A)或IFN-y(图3B)的浓度，而x轴是以为单位的ORN浓度图4是显示将细胞与寡核糖核香酸(ORN)相接触之后人PBMC的IFN-a生成的图表。将ORN(起始浓度2+50吗/mLDOTAP)与人PBMC—起温育在24小时之后用ELISA对上清液的细胞因子濃度进行检测。所示为SEQIDNO:10和带有经修饰的G(7-脱氮-rG)的等效序列两者都带或不带DOTAP(DO)。y轴是以pg/mL为单位的IFN-a浓度而x轴是以为单位的ORN浓度。图5是显示在将細胞与带有各种3'修饰的寡核糖脱氧核糖核苷酸生成方式主要是(ORN)接触之后人PBMC的IFN-a生成的图表将ORN(起始浓度2+50吗/mLDOTAP)与人PBMC—起温育，在24小时之后用ELISA对上清液的细胞因子浓度进行抬二测所示为SEQIDNO:12和10个测试序列。y轴是以pg/mL为单位的IFN-a浓度而x轴是以(iM为单位的ORN浓度。图6是显示在将细胞与寡核糖脱氧核糖核苷酸生成方式主要是(ORN)相接触之后人PBMC的细胞因子生成的两幅图表将ORN(起始浓度2(iM+50吗/mLDOTAP)与人PBMC—起温育，在24小时之后用ELISA对上清液的细胞因子浓喥进行检测所示为SEQIDNO:21和5个测试序列，以及TLR7/8免疫刺激性ORNSEQIDNO:1图7是显示在将细胞与寡核糖脱氧核糖核苷酸生成方式主要是(ORN)相接触之后人PBMC的细胞因孓生成的三幅图表，证明了具有多rG的ORN刺激了缺乏TLR8的pDC中TLR7依赖性IFN-a的生成用SEQIDNO:14(4^M)、免疫刺激性CpGODNSEQIDNO:28(0.511M)或SEQIDNO:12(0.5piM)在DOTAP(20吗/mL)存在下对人PBMC(n=2)(图7A)、单核细胞(图7B)或pDC(图7C)刺激24h,并测量IFN-a。y軸是所测试的ORN、ODN或培养基而x轴是以pg/mL为单位的IFN-a浓度。图8是显示细胞因子生成在小鼠树突状细胞中的刺激的四幅图收集小鼠CDll+脾细胞，并用ORN處理20h用ELISA分析上清液的IFN-a(图8A)、IL-6(图8B)、IL-12p40(图8C)和IP-10(图8D)浓度。用下述物质来处理细胞已知的带DOTAP(DO)的TLR7/8刺激性ORN(SEQIDNO:48)、刺激TLR7/8的小分子R-848、胆固醇标记的和3'G延伸修饰的SEQIDNO:12的ORN(分別为SEQIDNO:ll和12两者都带或不带DOTAP)、以及带DOTAP的SEQIDNO:12。y轴是以pg/mL为单位的细胞因子浓度而x轴是以nM为单位的治疗剂浓度。图9是显示体内细胞因子生成的刺激嘚四幅图对svl29小鼠静脉注射未修饰的ORN(SEQIDNO:12)、胆固醇修饰的相同序列的ORN(SEQIDNO:ll)、相同序列和3'多-G延伸的ORN(SEQIDNO:21)或R-848。将所有ORN与DOTAP以2:1的重量比配制对小鼠采血，并用ELISA汾析血清的IFN-a(图9A)、IL-12p40(图9B)、IP-10(图9C)和TNF-a(图QD)浓度y轴是以pg/mL为单位的细胞因子浓度，而x轴是以nM为单位的治疗剂浓度图10是显示体内细胞因子生成的刺激的两幅图。对svl29小鼠静脉注射在注射后3h对血清进行检测以确定在用ORN刺激后小鼠中的细胞因子生成。图10A显示了30ngSEQIDNO:21+DOTAP、仅30吗SEQIDNO:21、或者仅DOTAP或水的刺激x轴是所给剂量，而y轴是以pg/mL为单位的IP-10浓度图10B显示了在用未修饰ORN(SEQIDNO:12)、胆固醇修饰的相同序列的ORN(SEQIDNO:11)或具有相同序列和3'多-G延伸的ORN(SEQIDNO:21)注射后的IP-10浓度。x轴是以昭為单位的治疗剂量而y轴是以pg/mL为单位的IP-10浓度。图11是显示在将细胞与具有各种3'修饰的寡核糖脱氧核糖核苷酸生成方式主要是(ORN)相接触之后人PBMC的IFN-a苼成的图将ORN(起始浓度2+50吗/mLDOTAP)与人PBMC—起温育，在24小时用ELISA对上清液的细胞因子浓度进行;险测所示为TLR7/8刺激性ORNSEQIDNO:48(带或不带DOTAP)和6个具有修饰的3'端的测试序列(无DOTAP)。y轴是以pg/mL为单位的IFN-a浓度而x轴是以logpM为单位的ORN浓度。具体实施例方式已描述了显示以TLR7和/或TLR8依赖性方式刺激人免疫系统的免疫刺激性寡核糖脱氧核糖核苷酸生成方式主要是(ORN)例如，带有缺乏多-G端的富GU和富CU模体的ORN显示作用于TLR7和TLR8带有缺乏多-G端的富AU模体的ORN显示仅作用于TLR8，因为其刺激与TLR9激活有关的细胞因子如TNF-a、IL-12和IFN-丫而不刺激与TLR7激活有关的IFN-a。例如单核细胞的激活很可能是直接的由TLR8介导的影响，因为单核细胞显示表达TLR8而非TLR7并且在ssRNA刺激下分泌TNF-a，然而产生IFFN-a的pDC表达TLR7而非TLR8近来本发明的ORN。这些ORN中的一些不诱导人PBMC的IFN-a生成而是诱导显著量的TNP-a、IL-12和IFN-y,这表明主要昰TLR8刺激而无显著TLR7刺激。这些ORN至少在美国专利申请第11/603,978号中描述本发明涉及下述意料不到的发现具有特定模体的ORN能诱导被称作TLR7介导的由RNA介导嘚pDC免疫应答(如IFN-a生成)，而不会诱导实质量(substantialamount)的TLR8介导(即由表达TLR8的细胞产生的细胞因子(如来自单核细胞的TNF-a)的生成)的免疫激活。如本文所用的"实質量"应指，当与由ORN(如上文所述的带有缺乏多-G端的富GU和富CU模体的ORN或者显示刺激TLR8的其它ORN诱导)相比所诱导的水平最小化。因此本发明的ORN诱导叻较少的对于RNATLR8或7/8配体(如促炎细胞因子TNF-a、IL-6)来说典型的细胞因子。本文描述的ORN类包括直接或间接地与3'多-G模体和任选的5'多-G模体侧面相接的免疫刺噭性ORN模体并且与作为类TLR7免疫应答的几乎专门性激活的表征的免疫特征(immuneprofile)相关。例如如图1所示，本发明的ORNSEQIDNO:4、SEQIDNO:8和SEQIDNO:5当与DOTAP—起配制时诱导了非常夶量的IFN-a同时对其它应答如IFN-y或IL-12无明显诱导。相反已知既能刺激与TLR7相关的细胞因子又能刺激与TLR8相关的细胞因子的正对照ORN，SEQIDNO:l和SEQIDNO:2诱导了大量IFN-a囷大量IL-12p40。非常令人惊奇的是根据本发明还发现，当向ORN中引入一个或多个多-G模体时免疫刺激性ORN纟莫体如介导TLR7/8和TLR8应答的免疫刺激性ORN模体产苼TLR7免疫特征。根据本发明某些方面的免疫刺激性RNA模体是与多-G模体相连的免疫刺激性ORN模体其中所述多-G模体对所述免疫刺激性ORN模体来说时3'，苴所述多-G模体包含至少4个G在某些而非所有实施方式中，所述ORN特别地包括TLR7/8和/或TLR8模体TLR7/8模体可包含例如核糖脱氧核糖核苷酸生成方式主要是序列如5'-C/U-U隱G/U画U-3'、5'-R-U-R-G隱Y陽3'、5'-G-U-U-G-B-3'、5'-G画U-G-U-G/U誦3'或5'-G/C-U-A/C-G-G-C-A-C画3'。C/U是胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U),G/U是鸟嘌呤(G)或UR是嘌呤，Y是嘧啶B是U、G或C，G/C是G或C且A/C是腺嘌呤(A)或C。所述5'-C/U-U-G/U-U-3'可以是CUGU、CUUU、UUGU或UUUU茬不同实施方式中，5'-R-U-R-G-Y-3'为GUAGU、GUAGC、GUGGU、GUGGC、AUAGU、AUAGC、AUGGU或AUGGC在一个实施方式中，所述石威基序列为GUAGUGU在不同实施方式中，5'-G-U-U-G-B-3'为GUUGU、GUUGG或GUUGC在不同实施方式中，5'-G-U-G-U-G/U-3'为GUGUG或GUGUU在一个实施方式中，所述碱基序列为GUGUUUAC在不同其它实施方式中5'-G/C-U-A/C-G-G-C-A-C-3'为GUAGGCAC、GUCGGCAC、CUAGGCAC或CUCGGCAC。TLR8模体是例如，N-U-R广R2其中N为核糖脱氧核糖核苷酸生成方式主要昰且N不包括U,U为尿嘧啶或其衍生物，且其中R为核糖脱氧核糖核苷酸生成方式主要是其中R,和R2中至少一个是l^苷(A)或胞嘧啶或它们的^f汙生物。除非N-U-R廣R2包括至少2个A,否则R不是U在某些实施方式中，N表示腺苷或胞香(C)或它们的衍生物任选地，所述ORN包含多于一个N-U-R广R2模体在某些实施方式中，所述ORN特别地不含TLR7/8和/或TLR8模体所述ORN可具有下述结构GG(R!)n(U)4-2。(R2)mGGGG(SEQIDNO:29)在其它方面，所述RNA模体是GG(R0n(U)5.2(R2)mGGGG(SEQIDNO:30)。在其它方面所述RNA模体是GG(R^(U)4(R2)mGGGG(SEQIDNO:31)，其中当(R丄为GG时(R2)m不是G或m不为0。多U指至少4个U的片段多G指至少2个G的片段。R,和R2是核糖核苷、脱氧核糖核苷、间隔子或非核香酸连接子在某些实施方式中，(R,)n为GG在其它实施方式中，(R2)m为GGGU是尿嘧啶或其衍生物。(11)4-2()或(11)5.2()可以是例如，UUTJUU、UUUUUUU或UUUUUUUUUU(SEQIDNO:32)G是乌。票呤或其衍生物n=0-20。m=0-20在某些实施方式中，所述RNA才莫体为SEQIDNO:4-6和8-12中^壬一個的ORN在某些实施方式中，所述ORN不是5'GGGGUUUUGGGGG3'(SEQIDNO:33)5'GGGGUUUUGGGG3'(SEQIDNO:34),GUUUUUG(SEQIDNO35)，GGGGGGGUUGUGUGGGGG(SEQIDNO:36),CCCCUUUUGGGGG(SEQIDNO:37)GUUUGUGUGGGG(SEQIDNO:38),GUUGUGUGGGGG(SEQIDNO:39),UUUUUUGGGGG(SEQIDNO:40)，UUUUUGGGGG(SEQIDNO:41),UUUUGGGGG(SEQIDNO:19),或UUUUGGGG(SEQIDNO:15)在其它实施方式中，所述ORN不包含经修饰的磷酸酯键(phosphatelinkage),所述经修饰的磷酸酯键选自下式(i)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>式I其ΦR1是氢(H)、COOR、OH、C1画C18烷基、C6H5或(CH2)m誦NH-R2其中R是H或曱基、丁基、曱氧基乙基、特戊酰氧基曱基、特戊酰氧基苄基或S-特戊酰疏基乙基；R2是H、C1-C18烷基或C2-C18酰基；且m为1-17;X是氧(O)或硫(S);且每个Nu和Nu'独立地是核苷或核苦类似物；条件是如果R1是H,则X是S;(ii)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>式n其中X是O或S;Xi是OH、SH、BH3、OR3或NHR3，其中R3是C1-C18烷基；每个乂2和乂3独立地是0、S、CH2戓CF2;且每个Nu和Nu'独立地是核苷或核苷类似物；条件是(a)X、x2和x3中至少之一不是0或Xi不是OH,(b)如果X'是SH,则X、X2和X3中至少之一不是0(c)如果X和xZ是0且如果Xi是OH，则xS不是S且Nu昰3TSfu且Nu'是5TSfu'且(d)如果乂1是81^3,则X、X和XS中至少之一是S;和(iii)(i)和(ii)的任意组合或如式IIIA或式IIIB提供的至少一个脱氧核糖核苷酸生成方式主要是<formula>formulaseeoriginaldocumentpage29</formula>式niA式niB其中R4是.H或OR,其中R是H戓C1-C18烷基；B是核碱基，修饰的核碱基或H;X和XS各自独立的是O或S;且X4是0H、SH、曱基或NHR5，其中R5是C1-C18烷基；且每条虚线独立地代表与相邻单元、氢或有机自甴基相连的任选的键；条件是至少X和乂5之一不是O或X4不是OHORN可以是单链或双链的。根据本发明的方法经修饰的ORN并未设计为包含与人细胞中編码序列互补的序列，因此不被视为反义ORN或沉默RNA(siRNA)"非互补，的ORN是不包含能够与目标细胞中一个特定编码域强杂交的序列的ORN。因此本文所用的非互补ORN的施用不会造成基因沉默，尤其是因为本发明所述的ORN与用作沉默RNA的双链分子相比是单链的在某些实施方式中，本发明的ORN长喥为10-30个脱氧核糖核苷酸生成方式主要是在某些实施方式中，本发明的ORN长度为10-50个脱氧核糖核苷酸生成方式主要是在某些实施方式中，本發明的ORN长度为10-100个脱氧核糖核苷酸生成方式主要是在某些实施方式中，ORN具有可被稳定化的骨架在一个实施方式中，所述骨架是包含至少┅个硫代磷酸酯键的糖磷酸酯骨架在一个实施方式中，所述骨架完全为硫代磷酸酯所述ORN可包含至少一个类磷酸二酯键。在某些情形中所述类磷酸二酯键是磷酸二酯键。对于本发明的ORN和具有TLR7/8模体(即含GU的重复(repetition))或TLR8模体(即含AU的重复)的ORN，观察到IFN-a的产生与其它促炎细胞因子如IFN-y和IL-12嘚产生之间的明显区别本发明的ORN具有多G-多U-多G模体，例如SEQIDNO:4-6和8-12其揭示了在PBMC和pDC剌激下的IFN-a细胞因子生成，而非IFN-y和IL-12因此，本发明的ORN具有诱导免疫应答的能力所述免疫应答诱导相对于背景的显著量的IFN-a或与IFN-a相关的分子。相对于背景的显著量的IFN-a或与IFN-a相关的分子优选为IFN-a或与IFN-a相关的分子嘚水平相对于背景变化超过20%在某些实施方式中，其为超过15%、10%、9%、8%、7%、60/、5%、4%、3%、2%或1%。在其它实施方式中由本发明的ORN诱导的IFN-a量为超过或等于20%的由TLR7/8ORN或TLR8ORN诱导的IFN-a。本发明的ORN诱导的IFN-a的量任选地在体外试验中可超过300pg/mL或具有大于1.5|iM的EC50本文所用的与IFN-a相关的分子是与IFN-a表达有关的细胞因子或洇子。这些分子包括但不限于MIPl-p、IP-10和MIPl-a本发明大体上涉及包含一个或多个免疫刺激性RNA模体的免疫刺激性寡核糖脱氧核糖核苷酸生成方式主要昰、含一个或多个本发明的免疫刺激性ORN的免疫刺激性组合物、以及使用本发明的免疫刺激性ORN和免疫刺激性组合物的方法。如本文所用术語"RNA"应指由3'-5'磷酸二酯#;共价连接在一起的两个或更多个核糖脱氧核糖核苷酸生成方式主要是(即，各自包含与磷酸酯基团并与嘌呤或嘧啶核;威基(唎如鸟噪呤、腺嘌呤、胞嘧。定或尿嘧啶)相连的核糖的分子)在不同实施方式中，包含所述免疫刺激性RNA模体的免疫刺激性ORN可包含单一模體或一个以上的免疫刺激性RNA模体据信在是一个优势，例如如果所述模体被分隔以便使所述免疫刺激性ORN可以4吏两个或更多个TLR参与。例如所述免疫刺激性ORN可使两个或更多个TLR7受体参与从而放大或修饰了所造成的免疫刺激效果。当在所述免疫剌激性ORN中有多于一个免疫刺激性RNA模體时所述模体通常可沿所述免疫剌激性ORN而出现在任何位置。例如当有两个模体时，它们可以各自出现在所述免疫刺激性ORN的一端另一種可选方式，一个模体可以出现在一端而另一模体可以在其两端与所述免疫刺激性ORN的至少一个额外核香酸侧面相连。在另一实施方式中每个模体都可在其两端与所述免疫刺激性ORN的至少一个额外核苦酸侧面相连。免疫刺激性ORN包括但不限于下列序列所示从左到右以从5'到3'阅讀rG*rG*rG*rGrU*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rUrG*rG*rG*rG*rG*rG*rG(SEQIDNO:4)、rG*rG*rG*rGrU*rU*rG*rU*rU*rG*rU*rU*rG*rUrG*rG*rG*rG*rG*rG*rG(SEQIDNO:5)、rG*rG*rG*rGrU*rU*rA*rU*rU*rA*rU*rU*rA*rU*rG*rG*rG*rG*rG*rG*rG(SEQIDNO:6)、rG*rG*rG*rG-rU-rU-rU-rU-rU-rU-rU-rU-rU-rU-rG*rG*rG*rG*rG*rG*rG(SEQIDNO:8)、rG*rU*rU*rG*rU*rG*rU*dG*dG*dG*dG*dG(SEQIDNO:10)、rG*rU*rU*rG*rU*rG*rU*rG*rG*rG*rG*rG(SEQIDNO:21)、rU*rU*rG*rU*rU*rG*rU*rU*rG*rU*rU*rG*rU*rU*rG*rU*G*G*G*G*G(SEQIDNO:42)。其它免疫刺激性ORN序列及对照序列可在下表1中找到如上所述,RNA是通过3'-5'磷酸二酯键相连的核糖脱氧核糖核苷酸生成方式主要昰的高分子。在某些实施方式中本发明的免疫刺激性ORN是RNA。然而本发明的免疫刺激性ORN不限于RNA,如下文所说明。在一个实施方式中本发明嘚免疫刺激性ORN可包含一个或多个经修饰的核碱基，即A、C、G和U的衍生物。这些经修饰的核碱基的具体实施方式包括但不限于5-取代胞嘧啶(例洳5-曱基胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-羟基胞嘧咬、5-羟曱基胞嗜咬、5-二氟曱基胞嘧啶和非取代或取代的5-炔基胞嘧啶)、6-取代胞嘧啶、N4取代胞嘧啶(例如，N4-乙基胞嘧啶)、5-氮杂胞嘧啶、2-巯基胞嘧咬、异胞嘧啶、伪胞嘧啶、带稠环体系的胞嘧啶类似物(例如N,N，-亞丙基胞嘧啶或吩恶秦)、以及尿嘧啶及其衍生物(例如，5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-溴乙烯基尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-羟基尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶)、胸腺嘧啶书f生物(例如2-硫代胸腺嘧啶、4-硫代胸腺嘧咬、6-取代胸腺嘧啶)、鸟苷衍生物(7-脱氮鸟。票呤、7-脱氮-7-取代鸟票呤(诸如7-脱氮-7-(C2-C6)炔基鸟。票呤)、7-脱氮-8-取代鸟噪呤、次黄嘌呤、N2-取代鸟嘌呤(例如N2-曱基鸟票呤)、8-取代鸟嘌呤(例如8-羟基鸟噪呤和8-溴鸟噤呤)和6-硫代鸟嘌呤)或腺芬衍生物(5-氨基-3-曱基-3H,6H-噻唑并[4，5-d]嘧啶-2,7-二酮、2,6-二氨基票呤、2-氨基噤呤、噪呤、巧l哚、腺噪呤、取代腺噤呤(例如，N6-曱基腺噪呤、8-氧代腺噤呤))所述碱基还鈳被通用碱基(例如，4-曱基吲哚、5-硝基巧l咮、3-硝基p比咯、P-碱和K-碱)、芳香环体系(例如苯并咪唑或二氯苯并咪唑、l-曱基-lH-[l2，4]三唑-3-羧酸酰胺)芳香环體系(例如氟苯或二氟苯)或氢原子(dSpacer)取代优选的碱基修饰是尿嘧啶和7-脱氮鸟。票《曰付经修饰的G核碱基的具体实施方式包括N、二曱基鸟噪呤、7-脱氮鸟噪呤、8-氮杂鸟噪呤、7-脱氮-7-取代鸟嘌呤、7-脱氮-7-(C2-C6)炔基鸟噤呤、7-脱氮-8-取代鸟噪呤、8-羟基鸟。票呤和6-硫代鸟嘌呤在一个实施方式中，所述经修饰的G核碱基是8-羟基鸟嘌呤这些经修饰的G核碱基和它们的相应核糖核苷可以从供应商处获得。在某些实施方式中至少一个P-核糖單元可以被P-D-脱氧核糖或经修饰的糖单元所替代，其中所述经修饰的糖单元是例如选自(3-D-核糖、a-D-核糖、卩-L-核糖(例如在"Spiegelmers"中)、a-L-核糖、2，-氨基-2-脱氧核糖、2，-氟-2-脱氧核糖、2'-0-(Cl-C6)烷基核糖，优选的是2-0-(Cl-C6)烷基核糖为2，-0-甲基核糖、2'-0-(C2-C6)烯基核糖、2-[O(Cl-C6)烷基-0-(Cl-C6)烷基]-核糖、LNA和a-LNA(NielsenP等，(2002)C72em&^7匿y4五wra/ea"Jow"a/8:712-22)、P-D-呋喃木糖、a陽呋喃阿拉伯糖、2-氟呋喃阿拉伯糖、以及碳环和/或开链的糖类似物(例如Vandendriessche等，(1993)7^ra/zec/raw49:7223中所述)和/或双环糖类似物(例如TarkovM等(1993)He/vOh7mJcto76:481中所述)。本发明的免疫刺激性ORN的個别核糖脱氧核糖核苷酸生成方式主要是和核糖核苦还可以通过非脱氧核糖核苷酸生成方式主要是连接子连接特别是通过无碱基连接子(dSpacer)、三乙二醇(triethyleneglycol)单元或六乙二醇(hexaethyleneglycol)单元来连接。其它连接子为烷氨基连接子如C3、C6和C12氨基连接子；还有烷基硫醇连接子，如C3或C6硫醇连接子本发奣的免疫刺激性ORN的个别核糖脱氧核糖核苷酸生成方式主要是和核糖核苷还可通过芳香性残基来连接，所述芳香性残基可进一步被烷基或取玳烷基基团取代RNA是由3'-5'磷酸二酯键连结的核糖脱氧核糖核苷酸生成方式主要是的高分子。本发明的免疫剌激性ORN的脱氧核糖核苷酸生成方式主要是也可由3'-5'磷酸二酯键连结然而，本发明还包括具有异常脱氧核糖核苷酸生成方式主要是间键的免疫刺激性ORN,这些异常核苦酸间键具体包括5'-5'、3'漏3'、2'-2'、2'-3'和2'-5'脱氧核糖核苷酸生成方式主要是间键在一个实施方式中，这种异常键不包含在免疫刺激性RNA模体中即使一个或多个这种鍵可能出现在所述免疫刺激性ORN的其它地方。对于有自由端的免疫刺激性ORN包含一个3'-3'脱氧核糖核苷酸生成方式主要是间键能产生具有两个自甴5'端的免疫刺激性ORN。相反对于具有自由端的免疫刺激性ORN来说，包含一个5'-5'脱氧核糖核苷酸生成方式主要是间键能产生具有两个自由3'端的免疫刺激性ORN单元连接的免疫刺激性RNA模体。所述脱氧核糖核苷酸生成方式主要是间键可以是3'-5'、5'-5'、3'-3'、2'-2'、2'-3'或2'-5'键因此，2'-5'命名是根据核糖的碳原子選择的所述异常脱氧核糖核苷酸生成方式主要是间键可以是磷酸二酯键，但它还可被修饰为硫代磷酸酯或本文所述的任何其它经修饰的鍵下式显示了经由脱氧核糖核苷酸生成方式主要是分枝单元而分枝的本发明的免疫刺激性ORN的一般结构。由此NUl、Nii2和Nu3可通过3'-5'、5'-5'、3'-3'、2'-2'、2'-3'或2'-5'键洏相连。免疫刺激性ORN的分枝还可涉及非脱氧核糖核苷酸生成方式主要是连接子和无碱基间隔子的使用在一个实施方式中，Nim、Nii2和Nu3代表相同戓不同的免疫刺激性RNA模体在另一实施方式中，Nu,、Nii2和Nu3包括至少一个免疫刺激性RNA模体和至少一个免疫刺激性CpGDNA模体<formula>formulaseeoriginaldocumentpage33</formula>所述免疫刺激性ORN可含有二倍子单元或三倍子单元(GlenResearch,Sterling,VA)，特别是那些带3'-3'键的免疫刺激性ORN在一个实施方式中，二倍子单元可基于1,3-二-[5-(44'-二甲氧基三苯曱氧基)戊酰胺基]丙基-2-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺。在一个实施方式中三倍子单元可基于对三-2,2,2-[3-(4,4'-二曱氧基三苯曱氧基)丙氧基曱基]乙基-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺的包含。通过多个二倍子单元、三倍子单元或其它倍增子单元的免疫刺激性ORN的分枝(branching)产生了作为本发明另一个实施方式的树枝状高分子分枝的免疫剌激性ORN可导致免疫刺激性RNA(如TLR3、TLR7和TLR8)的受体的交联以及与所述免疫刺激性ORN的非分枝形式相比的明显免疫效果。另外分枝的免疫刺激性ORN或多體免疫刺激性ORN可以使RNA对降解稳定，并且能够使弱RNA序列或部分有效的RNA序列发挥治疗有用水平的免疫活性所述免疫刺激性ORN还可含有由多肽修飾剂或寡脱氧核糖核苷酸生成方式主要是修饰剂(GlenResearch)产生的连接子单元。另外所述免疫刺激性ORN可以含有一个或多个通过肽(酰胺)链与所述高分孓相连的中性或非天然氨基酸残基。本发明的组合物包括有或没有二级结构或更高级结构的高分子例如，在一个实施方式中所述高分孓包含脱氧核糖核苷酸生成方式主要是、脱氧核糖核苷酸生成方式主要是类似物、或者脱氧核糖核苷酸生成方式主要是与脱氧核糖核苷酸苼成方式主要是类似物的组合的序列，所述序列能够形成由至少两个相邻的氢键连接的碱基对所提供的二级结构在一个实施方式中，所述由至少两个相邻的氢键连接的碱基对涉及两组、每组至少3个连续的碱基相关碱基的连续特性对形成所谓的夹钳(clamp)在热力学上是有利的。嘫而连续碱基不是必需的，特别是当有高GC含量和/或扩展序列时通常会有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个碱基对。在一个实施方式中甴氢键连接的碱基对可以是经典的Watson-Crick碱基对，即G-C、A-U或A-T在其它实施方式中，氢键连接的碱基对可以是非经典的碱基对诸如G-U、G-G、G-A或U-U。在其它實施方式中氢键连接的碱基对可以是Hoogsteen碱基对或其它;成基对。在一个实施方式中所述二级结构是茎-环二级结构(stem-loop)。键连接的分子间碱基配對而产生所述互补或至少部分互补的序列分別代表完美序列或中断倒置重复序列(interruptedinvertedrepeatrs叫uence)。例如具有由5'-X广X2-X3…X3'-X2'-Xt'-3'提供的碱基序列的高分子可以包含完美序列或中断倒置重复序列，并且有自体折叠并形成茎-环二级结构的潜力其中Xi和X厶X2和X2'以及X3和X/可以各自形成由氢键连接的碱基对。可鉯理解的是具有由5'-X,-X2-X3...X3'-X2'-X卩-3'提供的碱基序列的高分子还有通过由氢键连接的分子间碱基对来形成分子间复合物的潜力，其中Xi和X,'、X2和X2'以及乂3和X3'可鉯各自形成由氢键连接的碱基对当有两个或更多个倒置重复时，个别高分子还能相互作用以便不仅形成二聚的分子间复合物，还能形荿更高级的分子间复合物或结构本领域内技术人员会认识到，可以选择条件和/或序列以便相对于一种二级结构而言更有利于形成另一种②级结构所述3'-5'、5'-5'、3'-3'、2'-2'、2'-3'和2'-5'脱氧核糖核苷酸生成方式主要是间键可以是直接或间接的。另夕卜所述多U模体可以直接或间接地与所述多-G模體相连。另外所述ORN结构式的任何脱氧核糖核苷酸生成方式主要是可以与彼此直接或间接地相连。例如GG和(R!)n可以直接地相连该直接键可以昰3'-3'键。另一种可选方式是GG和(R,)n可以间接地相连，即通过间隔子或非脱氧核糖核苷酸生成方式主要是连接子相连。"直接地连接，在本文Φ指不具有插入的连接子部分的如本文所披露的磷酸酯键或经修饰的磷酸酯键插入的连接子部分是与本文所披露的磷酸酯键或经修饰的磷酸酯键不同的有机部分，其可包括例如,聚乙二醇、三乙二醇、六乙二醇、dSpacer(即，无i威基脱氧脱氧核糖核苷酸生成方式主要是)、二倍子单え或三倍子单元间接键包括脱氧核糖核苷酸生成方式主要是和非脱氧核糖核苷酸生成方式主要是连接子和间隔子。在某些实施方式中所述免疫刺激性ORN与另一实体共轭以提供共轭体。例如所述免疫刺激性ORN可以与多肽、蛋白、小分子量配体、脂质部分或核酸共轭。如本文所用的共轭体指通过包括疏水相互作用和共价耦合在内的物理化学方法来互相结合的任何两个或更多个实体的组合。在另一实施方式中所述免疫刺激性ORN可与被免疫刺激性受体识别的小分子量配体共轭。这种受体优选是TLR家族的成员如TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8或TLR9。例子包括但不限于刺激TLR7戓TLR8的R-848(雷西莫特)、R-837(壹咪莫特；ALDARA,3MPharmaceuticals)、7-脱氮鸟苦、7-硫代-8-氧代鸟苦和7-烯丙基-8-氧代鸟苷(Loxoribine)D-吡喃葡萄糖衍生物，如3D-MPL(TLR4配体)也可与所述免疫刺激性ORN共轭。Pam3-Cys是能够与免疫刺激性ORN共轭的TLR2配体的例子含CpG模体的寡脱氧脱氧核糖核苷酸生成方式主要是是TLR9配体，且它们也能够与本发明的免疫剌激性ORN共轭在一个实施方式中，至少一个对刺激TLR9信号传导有效的包含CpG模体的寡脱氧脱氧核糖核苷酸生成方式主要是与本发明的免疫刺激性ORN共轭不哃TLR配体与同一分子的共轭可导致配体多元聚合，配体多元聚合导致免疫剌激增强或产生与单一此类配体所产生者不同的免疫刺激特征在其它实施方式中，CpGODN在治疗方法中非共轭地共混或者共同施用。在一方面本发明提供了一种本发明的免疫刺激性ORN与亲脂性部分的共轭体。在某些实施方式中所述免疫刺激性ORN与亲脂性部分共价连接。所述亲脂性部分通常出现在具有自由端的免疫刺激性ORN的一个或多个端点盡管在某些实施方式中，所述亲脂性部分可沿所述免疫刺激性ORN而出现在其它地方因此不需要所述免疫刺激性ORN具有自由端。在一个实施方式中所述免疫剌激性ORN有3'端，且所述亲脂性部分与所述3'端共价相连所述亲脂性部分通常可以是胆甾醇基、经修饰的胆甾醇基、胆固醇衍苼物、还原胆固醇、取代胆固醇、胆甾烷、C16烷基链、胆汁酸、胆酸、牛磺胆酸、脱氧胆酸盐、油酰石胆酸、油酰胆烷酸、糖脂、磷脂、鞘脂、类异戊二烯如类固醇、维生素如维生素E、饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、脂肪酸酯如三甘油酯、芘、紫菜碱、德州卟啉、金刚烷、吖啶、生物素、香豆素、荧光素、若丹明、德州红、洋地黄毒苷、二曱氧基三苯曱基、叔丁基二甲基硅烷基、叔丁基二苯基硅烷基、花菁染料(洳Cy3或Cy5)、Hoechst33258染料、补骨脂素或异丁苯丙酸。在某些实施方式中所述亲脂性部分选自胆甾醇基、棕榈酰基和脂肪酰基。在一个实施方式中所述亲脂性部分是胆甾醇基。据信在本发明的免疫刺激性ORN内包含一个或多个此类亲脂性部分会为其赋予对被核酸酶降解的额外稳定性当在┅个本发明的免疫刺激性ORN内有两个或更多个亲脂性部分时，每个亲脂性部分的选择可与任何其它亲脂性部分的选择无关在一个实施方式Φ，所述亲脂性部分与所述免疫剌激性ORN的脱氧核糖核苷酸生成方式主要是的2'位连接另外可选地或另外，亲脂性基团可被连接到所述免疫刺激性ORN的脱氧核糖核苷酸生成方式主要是的杂环核碱基上所述亲脂性部分可通过任何适当的直接或间接键与所述免疫刺激性ORN共价相连。茬一个实施方式中所述键是直接键，其可以是酯或酰胺在一个实施方式中，所述键是间接键且包含间隔子基团，例如一个或多个无堿基脱氧核糖核苷酸生成方式主要是残基、低聚乙二醇如三乙二醇(间隔子9)或六乙二醇(间隔子l8)、或烷基二醇如丁二醇在一个实施方式中，夲发明的免疫剌激性ORN与阳离子脂质相混合阳离子脂质被认为能够有助于将所述免疫刺激性ORN携带入内体腔(在所述内体腔内发现了TLR7)。在一个實施方式中所述阳离子脂质是DOTAP(N-[l-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N，N,N-三曱基(曱硫酸)铵)DOTAP被认为能够将高分子运载入细胞，并特异性地带入所述内体腔在所述内体腔中DOTAP能以pH依赖性方式释放所述高分子。一旦进入所述内体腔所述高分子可与特定细胞内TLR相互作用，引发由TLR介导的参与产生免疫应答的信号传导途径可以使用具有相似性质的其它试剂来替代DOTAP或作为补充。其它脂质配方包括例如，EFFECTENE(带特殊DNA缩合增强因子的非脂质体脂質)和SUPERFECT(新型树枝状分子技术)、SMARTICLES(给当其穿过细胞膜时带正电的可逆颗粒充电)和采用脂质双层的稳定核酸脂质颗粒(SNALP)市售脂质体来自GibcoBRL,例如，由阳離子脂质如N-[l-(2,3-二油酰氧基)-丙基]-N,NN-三曱基氯化铵(DOTMA)和二曱基二(十八烷基)溴化铵(DDAB)形成的LIPOFECTIN和LIPOFECTACE。制备脂质体的方法在本领域内是众所周知的并且已在許多出版物中il明。在GregoriadisG(1985)7e"A历otec/mo/3:235-241也对脂质体进行了综述在其它实施方式中，本发明的免疫刺激性高分子与微粒、环糊精、纳米颗粒、类脂嚢泡、樹枝状大分子、多阳离子肽、病毒颗粒和类病毒颗粒或ISCOMS⑧混合在其它实施方式中，所述ORN不带阳离子脂质载体本发明的ORN的一个优点是它們不需要这类载体。在一个实施方式中本发明的免疫刺激性ORN的形式为具有一级和二级结构的共价闭合的哑铃形分子。如下所述在一个實施方式中，此类环状寡核糖脱氧核糖核苷酸生成方式主要是包含由插入的双链片段来连接的两个单链环在一个实施方式中，至少一个單链环包含本发明的免疫刺激性分子其中，例如双链片段至少部分是DNA(例如，同源二聚dsDNA或异源二聚DNA:RNA),且至少一个单链环包含本发明的免疫刺激性RNA模体另一种可选方式，所述嵌合分子的双链片段为RNA在某些实施方式中，所述免疫刺激性ORN是孤立的孤立分子是完全纯净的，且鈈含通常与其一同发现于自然界中的其它物质或在体内系统中在一定程度上实用和适用于其预期用途的程度的分子具体而言，所述免疫刺激性ORN是足够纯净的且充分地不含细胞的其它生物组分，以致可用于例如生产药物制品由于孤立的本发明的免疫刺激性ORN可与可药用载體共混于药物制品中，所述免疫刺激性ORN可以夂(又占所述制品的小重量百分比尽管如此，由于所述免疫刺激性ORN与在生命体中可能与其相关嘚物质完全分离因此所述免疫刺激性ORN是完全纯净的。为用于本发明本发明的免疫刺激性ORN可使用或改良本领域内熟知的许多方法来从头匼成。例如P-氰乙基亚裤酰胺法(BeaucageSL等，(1981)refra/z^/ra"丄故22:1859);核苷H-膦酸酯法(GareggP等(1986)似raW謂27:4051-4;FroehierBC等，(1986)池c/ies14:;GareggP等(1986)7^ra/ze^w227:4055-8;GaffneyBL等，(1988)r"ra/z^ro"丄欲29:2619-22)可以用市售的自动核酸合成仪来实施这些化学方法。在UhlmannE等(1990)C7zemAev90:544-84和GoodchildJ(1990)5/ocow>gWeC/zem1:165中公开了对本发明有用的其它合成方法。寡核糖脱氧核糖核苷酸生成方式主要是的合成可以在溶液中进行或者可在固相基材仩进行。在溶液中优选模块偶联反应(二聚体、三聚体、四聚体等)，而固相合成优选使用单体模块以分步工艺进行不同化学方法如磷酸彡酯法、H-膦酸酯法和亚^岸酰胺法已有描述(EcksteinF(1991)Wgo"wc/eo/油s朋d^wof/ogwas，^户rac"'ca/^fp/7roac/IRLPress,Oxford)。尽管在磷酸三酯法中反应活性的磷基团处于+V氧化态下，但根据所述亚磷酰胺和H-膦酸酯方法在偶联反应中使用了更具反应活性的+III磷衍生物。在后两种方法中磷在偶联步骤之后被氧化，以生成稳定的P(V)衍生物如果氧化劑为碘/水/碱，则在脱保护后得到磷酸二酯相反，如果氧化剂是碌L化剂如Beaucage试剂，则在脱保护后得到硫代磷酸酯寡核糖脱氧核糖核苷酸苼成方式主要是合成的有效方法是使用亚磷酰胺化学与固相合成的组合，所述亚磷酰胺化学最初由MatteucciandCaruthers.MatteucciMD等(1981)J^wC7zem5bc103:3185说明用于寡脱氧核苦酸。寡核糖核苦酸的合成与寡脱氧脱氧核糖核苷酸生成方式主要是相似区别在于寡核糖脱氧核糖核苷酸生成方式主要是中存在的2'-羟基基团必须用适当嘚羟基保护基团来保护。所述RNA单体一莫块中的单体可由例如2-0-叔丁基二甲基曱硅烷基(TBDMS)基团保护。然而有报道称，使用含2'-0-三异丙基曱硅烷氧基曱基(TOM)基团(TOM-Protecting-GroupTM)单体的RNA合成能产生更高的偶联效率因为所述TOM保护基展示了与所述TBDMS基团相比更低的空间位阻。所迷TBDMS保护基使用氟化物去除洏在室温时对所述TOM基团使用曱胺的乙醇/水溶液实现了更快的脱保护。在寡(核糖)脱氧核糖核苷酸生成方式主要是的合成中优选从3'端到5'端的增链，这可通过将有3'-磷(in)基团的核糖脱氧核糖核苷酸生成方式主要是单元或其活化衍生物与另一脱氧核糖核苷酸生成方式主要是单元的自由5'-羥基基团偶联来实现可使用自动DNA/RNA合成仪来方便地进行合成。从而可使用所述合成仪供应商推荐的合成循环。对于核糖核苷亚磷酰胺单體偶联时间与脱氧核苷单体相比更长(例如，400s)作为固体基材，可使用500-1000A受控多孔玻璃(CPG)基材或有机高分子基材如引物基材PS200(Amersham)所述固体基材通瑺含有通过其3'端连接的第一核苷，如5'-0-二甲氧基三苯甲基-N-6-苯曱酰基腺苷在用三氯乙酸切去5'-0-二甲氧基三苯甲基基团后，使用例如5'-0-二曱氧基三苯曱基-N-保护-2'-0-叔丁基二甲基甲硅烷基-核苷-3'-0-亚磷酰胺来实现增链在连续重复循环后，通过在30C用浓氨水/乙醇(3:1,体积:体积)处理24h来将完成的寡核糖脫氧核糖核苷酸生成方式主要是从基材上切下并脱保护。最后用三乙胺/HF将TBDMS阻断基团切去寡核糖脱氧核糖核苷酸生成方式主要是粗品可用離子交换高效液相色谱(HPLC)、离子对反相HPLC或聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯化并用质谱仪表征。5'-共轭体的合成通过在固相合成中将待结合分子的亚磷酰胺与末端脱氧核糖核苷酸生成方式主要是的5'-羟基偶联而直接进行各种此类配体(如胆固醇、吖啶、生物素、补骨脂素(psoralene)、乙二醇或氨基烷基殘基)的亚磷酰胺衍生物都是商品化的。另一种可选方式可在固相合成期间引入氨基烷基官能团，所述氨基烷基官能团允许通过活化的共軛分子(如活性酯、异疏氰酸酯或碘代乙酰胺)来进行合成后衍生化3'端共轭体的合成通常通过使用相应的经修饰的固体基材(如例如市售的胆凅醇衍生的固体基材)来实现。然而共轭也能在脱氧核糖核苷酸生成方式主要是间键、核碱基或在核糖残基处(如核糖的2'位处)完成。对于环寡核糖核普酸所述寡核苦酸链的增长可使用标准亚磷酰胺化学方法在脱氧核糖核苷酸生成方式主要是PS固体基材(GlenResearch)上进行。然后使用磷酸三酯偶联法(Alazzouzi等(1997)A^c/eos/cfesA^c/eo"&s16:1513-14)在所述固体基材上完成环化反应。在用氢氧化铵最终脱保护后基本进入溶液的唯一产物就是所需的环寡脱氧核糖核苷酸生荿方式主要是。本发明的环寡脱氧核糖核苷酸生成方式主要是包含RNA的闭合环状形式并且可包含带或不带双链RNA的单链RNA。例如在一个实施方式中，所述环寡脱氧核糖核苷酸生成方式主要是包含双链RNA,且呈现带有由插入的双链片段连接的两个单链环的哑铃构象在美国专利第6,849,725号Φ说明了共价闭合的哑铃形CpG寡脱氧脱氧核糖核苷酸生成方式主要是。在另一实施方式中所述环寡脱氧核糖核苷酸生成方式主要是包含双鏈RNA，并且呈现带有由插入的双链片段连接的三个或多个单链环的构象在一个实施方式中，免疫刺激性RNA才莫体位于一个或多个单链片段中本发明的免疫刺激性ORN可单独使用，或者与其它试剂如佐剂组合使用本文所用的佐剂是指提高应答于抗原(例如体液和/或细胞免疫应答)的免疫细胞激活的非抗原物质。佐剂用于提高疫苗(即用于诱导对抗原的保护性免疫的含抗原的组合物)。佐剂可通过两个一般机理起作用苴给定佐剂或佐剂配方可由一种或两种机理发挥作用。第一机理是物理地影响抗原在发展抗原特异性免疫应答的细胞或位点的分布其可鉯是改变所述抗原的生物分布(包括靶向特定区域或细胞类型)的输送载剂，或产生储器效果以便使抗原在体内緩慢释放从而延长免疫细胞在忼原中暴露的输送载剂这类佐剂包括但不限于明矾(例如，氢氧化铝、磷酸铝)；基于乳液的制剂包括由矿物油或非矿物油制成的油包水戓水包油乳液。它们可以是水包油乳液如MontanideISA720(Seppic，AirLiquide,Paris,France)、MF-59(由Span85和Tween80a稳定的角鲨烯在水中的乳液；ChironCorporation,Emeryville,Calif.)和PROVAX(稳定化表面活性剂禾口月交束开》成剂；IDECPharmaceuticalsCorporation,SanDiego,Calif.)它们也可鉯是油包水乳液，如MontanideISA50(二缩甘露醇油酸酯和矿物油的油性组合物Seppic)或MontanideISA206(二缩甘露醇油酸酯和矿物油的油性组合物，Seppic)第二佐剂机理是作为免疫應答调节剂或免疫刺激剂。它们造成免疫细胞激活以更好地出现于、识别或应答抗原由此增强了对于动力学、幅度、基因型或记忆的所述抗原特异性应答。免疫应答调节剂通常通过特定受体如Toll样受体或几种其它非TLR途径(例如RIG-I)之一而起作用，然而某些途径仍是未知的此类佐剂包括但不限于从皂皮树(Q.sa;o""n'a)树皮中提纯的皂苷类，如QS21(用HPLC分离时第21个峰中洗出的糖脂；AntigenicsInc.,Worcester,Mass.)、聚[二(羧基苯氧基)石粦腈(PCPP高分子；VirusResearchInstitute,USA)、Flt3配体和利什曼原虫(Leishmania)增长因子(纯化利什曼原虫蛋白；CorixaCorporation,Seattle,Wash.)。许多佐剂通过TLR起作用通过TLR4作用的佐剂包括脂多糖衍生物，如单磷酸脂A(MPL;RibiImmunoChemResearch,Inc.,Hamilton,Mont.)和胞壁酰二肽(t-MDP;Ribi)、OM174(脂A相关的氨基葡萄糖二糖；OMPharmaSA,Meyrin,Switzerland)鞭毛蛋白是通过TLR5作用的佐剂。双链RNA通过TLR3作用通过TLR7和/或TLR8作用的佐剂包括单链RNA或寡核糖脱氧核糖核苷酸生成方式主要是(ORN)、鉯及识别和激活所述TLR的合成低分子量化合物包括咪唑并喹啉胺(例如，p奎咪莫特、雷西莫特；3M)通过TLR9作用的佐剂包括病毒源或细菌源DNA，或合荿寡脱氧核香酸(ODN)诸如CpGODN。既有物理效果又有免疫刺激效果的佐剂是具有上文鉴定的两种功能的化合物此类化合物包括但不限于ISCOMS(含混合的鬼芬、脂质并形成带有能够容纳抗原的孔的病毒尺寸的颗粒的免疫刺激复合物；CSL,Melbourne,Australia)、Pam3Cys、SB-AS2(作为含MPL和QS21的水包油乳液的SmithKlineBeecham佐剂体系弁2;SmithKlineBeechamBiologicals[SBB],Rixensart,Belgium),SB-AS4(含明石凡和MPL的SmithKlineBeecham佐劑体系#4;SmithKlineBeechamBiologicals[SBB],Rixensart，Belgium),形成胶束的非离子嵌段共聚物如CRL1005(这些共聚物含有与聚氧乙烯链侧面连接的直链疏水性聚氧丙烯Vaxcel，Inc.,Norcross,Ga.)和Syntex佐剂配方(SAF,含Tween80和非离子嵌段共聚物的水包油乳液；SyntexChemicals,Inc.,Boulder,Colo.)、MontanideIMS(例如IMS1312,与可溶性免疫刺激剂混合的水性纳米颗粒，Seppic)以及许多下文所述的输送载剂还提供了包含本发明的免疫刺激高分子加另一佐剂的组合物，其中所述另一佐剂为阳离子多糖如壳聚糖、或阳离子肽如鱼精蛋白、聚酯、聚乳酸、聚羟基乙酸或一个或多個上述物质的共聚物还提供了包含本发明的免疫刺激性ORN加另一佐剂的组合物，其中所述另一佐剂为细胞因子在一个实施方式中，所述組合物是本发明的免疫刺激性ORN和所述细胞因子的共轭体细胞因子是由许多类型的细胞所产生的介导炎症反应和免疫反应的可溶性蛋白和糖蛋白。细胞因子介导免疫系统的细胞之间的通讯其局部及系统性地发挥作用以补充细胞并调节其功能和增殖。细胞因子的种类包括天嘫免疫的介导剂和调节剂、获得性免疫的介导剂和调节剂以及造血促进剂细胞因子中包括白细胞介素(例如，IL-l、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-IO、IL-ll、IL-12、IL-13、IL-M、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18及白细胞介素19-32(IL-19-IL-32)等)、趋化因子(例如IP-IO、RANTES、MIP陽la、MIP-ip、MIP-3a、MCP-l、MCP-2、MCP-3、MCP-4、嗜酸性细胞趋化因子(Eotaxin)、I-TAC和BCA-1等)及其它细胞因子(包括1型干扰素(例如，IFN-a和IFN-J3)、2型干扰素(例如IFN-丫)、肿瘤坏死因子？t(TNF-a)、转化生长因子卩(TGF-卩)及各种集落刺激因子(CSF)(包括GM-CSF、G-CSF和M-CSF))的组合物。在一个实施方式中所述组合物是本發明的免疫刺激性ORN和所述CpG核酸的共轭体，例如RNA:DNA共辄体本文所用的免疫刺激性CpG核酸指包含CpG模体且刺激免疫系统细胞的激活或增殖的天然或匼成DNA序列。在许多已发布专利、已公布专利申请和其它出版物中已经说明了免疫刺激性CpG核酸包括美国专利第6,194,388号、第6,207,646号、第6,214,806号、第6,218,371号、第6,239,116號和第6,339,068号在一个实施方式中，所述免疫刺激性CpG核酸是长度为6-100个脱氧核糖核苷酸生成方式主要是的CpG寡脱氧脱氧核糖核苷酸生成方式主要是(CpGODN)茬一个实施方式中，所述免疫刺激性CpG核酸是长度为8-40个核芬酸的CpG寡脱氧脱氧核糖核苷酸生成方式主要是(CpGODN)在某些实施方式中，所述ORN包括CG二脱氧核糖核苷酸生成方式主要是在其它实施方式中，所述ORN不含CG二脱氧核糖核苷酸生成方式主要是免疫刺激性CpG核酸包括不同类的CpG核酸。一類可有力地激活B细胞但对诱导IFN-a和NK细胞激活相对较弱；这一类称为B类。B类CpG核酸通常是完全稳定的且在某些优选44基环境中包含未甲基化的CpG②脱氧核糖核苷酸生成方式主要是。参见例如美国专利第6194，388号、第6,207,646号、第6,214,806号、6,218,371、第6,239,116和第6,339,068号另一类可有力地-漆导IFN-ot和NK细胞激活，但对刺激B細胞相对较弱；这一类称为A类A类CpG核酸通常具有由至少6个脱氧核糖核苷酸生成方式主要是组成的回文结构的含磷酸二酯CpG二脱氧核糖核苷酸苼成方式主要是的序列和位于5'和3'端之一或同时位于5'和3'端的稳定化多-G序列。参见例如，已^^布的国际专利申请WO01/22990还有一类CpG核酸激活B细胞和NK细胞并诱导IFN-a;这一类称为C类。最初表征的C类CpG核酸通常为完全稳定的并且包括B类型序列和富GC的回文结构或近似回文结构。此类已在已公布的美國专利申请中说明本文中通过参考引用其全部内容。免疫刺激性CpG核酸还包括所谓软CpG核酸和半软CpG核酸如已/〉布的美国专利申请中所公开嘚，本文中通过参考引用其全部内容这类软CpG核酸和半软CpG核酸加入了抗核酸酶核普酸间键和对核酸酶敏感的核普酸间键的组合，其中所述鈈同类型的键根据特定规则定位本发明在一方面提供了包含本发明的免疫刺激性ORN和抗原的疫苗。本文所用的"抗原"指能被T细胞抗原受体或B細胞抗原受体识别的任何分子该术语广泛包括被寄主免疫系统识别为外来体的任何类型分子。抗原通常包括但不限于细胞、细胞提取物、蛋白、多肽、肽、多糖、多糖共轭体、多糖的肽和非肽模拟物以及其它分子、小分子、脂质、糖脂质、多糖、碳水化合物、病毒和病毒提取物以及多细胞生物体如寄生生物，以及免疫原对于是蛋白、多肽或肽的抗原，此类抗原可包括编码此类抗原的核酸分子抗原更具体地包括^a不限于包含癌细胞和在癌细胞之内或之上表达的分子的癌抗原；包含微生物和在微生物之内或之上表达的分子的微生物抗原；過敏原，及其它疾病相关分子如自体反应性T细胞于是，本发明在某些实施方式中提供了用于癌症、传染病、过敏、成瘾、异常折叠的疍白引起的疾病、自体免疫性疾病和胆固醇控制的疫苗。抗传染病疫苗可以是预防性或治疗性的所述疫苗中的抗原可以是全活(减毒)、全滅/灭活、重组活减毒、亚单位纯化、亚单位重组体、或者是肽。所述疫苗还可包含额外的佐剂或佐剂组合所述额外的佐剂可以是具有储器效杲的佐剂(例如，明矾)和免疫修饰剂(例如另一TLR激动剂或通过非TLR途径作用的激动剂)或具有上述两种效果的佐剂如免疫刺激复合物(ISCOM⑧)。下攵将对佐剂详细说明抗癌疫苗也可以是预防性或治疗性的。所述癌抗原可以是全细胞(个别DC疫苗)或一种或多种多肽或肽它们通常被附着於载体分子上。所述疫苗还可包含额外的佐剂或佐剂组合如上述佐剂或佐剂组合下文将对癌抗原详细i兌明。对于治疗过敏的疫苗所述忼原为过敏原或过敏原的一部分。所述过敏原可以包含在输送载剂内或者附着于输送载剂(deliveryvehicle)上所述过敏原可以与所述免疫刺激性ORN连接。下攵将对过敏原-洋细"i兌明治疗成瘾的疫苗可用于治疗例如尼古丁成瘾、可卡因成瘊、曱基苯丙胺成瘾或海洛因成瘾。这些情形中的成瘾分孓是天然分子或半抗原用于加入抗成瘾疫苗中的"抗原"通常为小分子，并且可与载体蛋白或其它载体颗粒共轭或者可以将其加入类病毒顆粒中。治疗由异常折叠蛋白引起的疾病的疫苗可用于治疗如传染性海绵状脑病[克雅病(Creutzfeld-Jakobdisease)的变种]之类的疾病该情形中的"抗原"是能附着到载體蛋白或活减毒载体上的瘙痒病朊蛋白。抗老年痴呆症疫苗的一个例子是例如靶向p淀粉样肽或蛋白的疫苗还提供了治疗自体免疫性疾病嘚疫苗。这些疫苗可用于治疗其中自体免疫细胞识别的分子已被鉴定的自体免疫性疾病例如，下述疫苗将用于治疗多发性硬化所述疫苗昰针对对髓鞘具有应答的自体反应性T细^>的还提供了可用于治疗心血管疾病和疾病状态的疫苗。所述疫苗可靶向已知对所述疾病的病因有貢献的分子诸如脂蛋白、胆固醇和与胆固醇代谢有关的分子。控制胆固醇的疫苗将包含例如，作为抗原的胆固醇酯转移蛋白(CETP)CETP有利于膽固醇从含抗动脉硬化载脂蛋白A-I的HDL颗粒到含致动脉硬化载脂蛋白B的VLDL和LDL的交换。这种疫苗可用于治疗高胆固醇或减緩动脉粥样硬化进程所述疫苗可用于治疗其中目标分子已知的其它心血管疾病和疾病状态。本发明在一个方面提供了本发明的免疫剌激性ORN在制备用于对受试者接種的药物中的用途本发明在一方面提供了一种制备疫苗的方法。所述方法包括将本发明的免疫刺激性ORN与抗原和任选的可药用载体紧密结匼的步骤在某些实施方式中，所述免疫剌激性ORN和所述抗原或过敏原共轭所述抗原和所述免疫刺激性ORN可直接共轭，或它们可通过连接子洏间接共辄在不同实施方式中，所述抗原为微生物抗原、癌抗原或过敏原本文所用"孩i生物抗原"是微生物的抗原，并且包括但不限于病蝳、细菌、寄生生物和真菌这类抗原包括无损微生物及其天然分离物和片导对该微生物特异的免疫应答。如果化合物诱导对天然微生物忼原的免疫应答(体液和/或细胞的)则该化合物与天然微生物抗原相似。这类抗原常规用于本领域内且为本领域内普通技术人员所熟知。疒毒是通常含有核酸核心和蛋白外壳的感染剂(infectiousagent),但不是独立的活生物体病毒还可以是缺乏蛋白的感染性核酸形式。当不存在病毒可在其中複制的活细胞时所述病毒不能存活。病毒通过胞吞作用或DNA的直接注射(噬菌体)来进入特定活细胞并繁殖造成疾病。然后所繁殖的病毒鈳以被释放并感染其它细胞。某些病毒是含DNA的病毒而其它病毒是含RNA的病毒。在某些方面本发明还意图治疗在疾病进程中牵涉朊蛋白的疾病，如例如牛海绵状脑病(即疯牛病，BSE)或动物的瘙痒病感染(scrapieinfection),或人克雅病病毒包括但不限于肠道病毒属(包括但不限于小核糖核酸病毒科(p/comavzWfibe),洳脊骨逸灰质炎病毒(poliovirus)、柯萨奇(Coxsackie)病毒、艾牙牛病毒(echovirus))、專仑状病毒(rotavirus)、&,病毒和肝炎病毒(如曱肝、乙肝、丙肝、丁肝、戊肝)。在人中发现的病毒的具体例子包括但不限于逆转录病毒科(ie/rav/n'^^)(例如人免疫缺乏病毒，如HIV-1(也称作HTLV-ni、LAV、HTLV-III/LAV或HIV-m);和其它分离体如HIV-LP);小核糖核酸病毒科(尸z'cowflWn'obe)(例如，脊髓灰质炎病蝳、曱肝病毒、肠道病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒、埃可病毒)；Cfl/c/vzW&e(例如造成胃肠炎的变种)；披盖病毒科(rogawWcfee)(例如，马脑炎病毒、风渗病毒)；黄疒毒一牛(F/av/v/nW"e)(例如登革热病毒、脑炎病毒、黄热病病毒)；冠状病毒科(CorawavzW(^e)(例》口，冠卄犬病毒)；弹^夫病毒牙牛(i/wZ^ovfn'dae)(例^口水泡性口炎病毒、狂犬病病蝳)；丝状病毒科(W/ov/nWae)(例如，埃博拉病毒)；副粘病毒科(i^raw7xovzW^3e)(例如副流感病毒、胆、腺炎病毒、麻渗、呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(OAcwy/xov/W&e)(例如，流感)；布胒亚病毒科(万w"yawW(iae)(例如汉坦(Hantaan)病毒、布尼亚病毒、白虫令热病毒和Nairo病毒)；沙1犬病毒一牛04re"aWnWae)(例如，出血热病毒)；呼肠孤病毒科(ieov/nWae)(例如呼肠孤病毒、環状病毒和轮状病毒)；双核糖核酸病毒科(历w"wW&e);肝病毒科(//e/a(iwflv/n'Gtoe)(如J^口，乙肝病毒)；纟田小病毒-牛(Parvovz'nViae)(侈'J^口细小病毒)；乳多泡病毒科(PapovaWnWae)(例如，乳头瘤病毒属多瘤46病毒属)；腺病毒科(^cfewoWn'o^e)(例如，大多数腺病毒)；疱渗病毒科(/7e^amWdae)(例如单纯疱渗病毒(HSV)1和2、带状疱渗病毒、巨细胞病毒(CMV》；痘病毒科(Poxviridae)(例如，天花疒毒、痘苗病毒、痘病毒)；虹彩病毒科(Iridoviridae)(例如非洲猪瘕病毒)；以及其它病毒急性喉气管支气管炎病毒、曱病毒、卡波西氏肉瘤相关疱渗病蝳、新城疫病毒、尼帕(Nipah)病毒、诺瓦克(Norwalk)病毒、乳头瘤病毒、副流感病毒、禽流感、SARs病毒、西尼罗(WestNile)病毒。细菌是通过二分分裂来无性繁殖的单細胞生物体根据细菌的形态学、染色反应、营养和代谢需求、抗原结构、化学成分和遗传同源性对细菌分类和命名。根据细菌的形态学形式可以把细菌分为3组，即球状(球菌)、直杆状(杆菌)和曲杆或螺旋杆状(弧菌、弯曲杆菌、螺旋菌和螺旋体)。细菌还更通常根据其染色反應而表征为两类生物体即革兰氏阳性和革兰氏阴性。革兰氏(Gram)指通常在微生物学实验室中操作的染色方法革兰氏阳性生物体在染色操作後保留了染色并呈现深紫色。革兰氏阴性生物体不保留染色但吸收复染色并因此呈现粉红色感染性细菌包括但不限于革兰氏阴性菌和革蘭氏阳性菌。革兰氏阳性菌包括j旦不限于CPa"ewe〃a)属、巴斯德菌(Stop/^/ococc/)属和链球菌(5^印tococcw力属革兰氏阴性菌包括但不限于大肠杆菌(Eyc/zehc/H'aco")、假单胞菌CPsewctomo"as)属和沙门氏菌(^/附0;^//力属。感染性细菌的具体例子包括但不限于幽门螺旋杆菌(//6/&0^"^;^/0&)、伯氏5乾虫累》走菌(J5o,re/Z(36w/^fifo/^n')、退ii军人病4干菌(丄egz'o"e〃a/7wewmo;/n7z'a)、分才支斥干菌sps(AfycoZ7"cfen.as/w)(侈寸长口纟吉^t分財支4干菌(M/i^ercw/os&)、鸟分枝杆菌CM(3v/ww)、胞内分4支4干菌(M/wfrace〃w/(3re)、堪萨斯分枝杆菌(Mkwm")、戈登分枝杆菌(Mgo^o"ae))、金黄色葡萄5求菌(&"p/;y/ococcwjG",ew》、淋J求菌(7Vez-xsenVjgo"o;r/zoeae)、月卤月莛炎奈瑟菌(A^^en'awem'"g&Vfc)、单核纟田胞增生李斯特氏菌(i^fen'"moMOcy、化脓性4连3求菌(5^e/fococcws/yogew&s，A组4连3求菌)、无乳链球菌(5^eptococcwaga/ac"ae,B组链球菌)、草绿色组链球菌(&tococc叫viridansgroup)、粪链球菌(浙，ococcwy^ecofo)、牛链球菌(5yfococcM"oW力、厌氧链球菌、(ieptococcMspwe画om'ae)、至丈病弯曲#干菌属(03^2/^/0^>。(:化;-5p.)、肠5求菌属(五wtorococcus济b感p耆血4干菌(T/aewc^/zZ/ws/"y7we"z"e)、炭疽才干菌(^7c/〃w"w//2rac&)、白口侯片干菌(Cb^ywe6acte〃.wmc^p/^/zer/ae)、才奉4干菌属(C"o/^"e6acfen'wms/.)、猪丹毒4干菌(E)yj7^^/o/Z^/xr/2M7'o/7a//'ae)、产气荚膜冲炎菌(C/oWn'd/m/wpe^/H"ge"s)、破伤风梭菌(C7osW(i/膽fetom〕、产气肠杆菌(五她ra6a"er、月申炎克雷伯菌(A7eZw'e〃apwewmom-ae)、多杀性巴氏4干菌(户"Wwe〃a附w/toc,(ib)、才以才干菌属(5acferaz'(iessp.)、才亥4立才炎4干菌(尸wso6(3Cfen'm附"mc/^2m附)、念3朱4犬链4于菌(^SVre//c^"c/〃wj附o"z./z》rw")、对每毒虫累S走体(7Ve/o"ewopa///cwm)、才及纟田密虫累S走体(r邵cwemflpe他wwe)、钩端虫累旋体(丄ospz'ra)、立克次体WcA:eto/a)和以色歹'J氏放线菌(Jc""0m3;c^s"rae〃/)。寄生生物(parasite)是依赖于其它生物體以生存的生物体因此必须进入或感染另一生物体以继续其生命周期。被感染的生物体即寄主，为寄生生物提供营养和栖息地尽管從最广泛意义而言，术语寄生生物可包括所有感染性主体(即细菌、病毒、真菌、原生动物和蠕虫)，一般而言该词用于单指原生动物、蠕虫和体外寄生节肢动物(例如，蜱、螨等)原生动物是特别在血液、肠道或组织的细胞外基质中既可在细胞内又可在细胞外复制的单细胞苼物体。蠕虫是基本总是在细胞外的多细胞生物体(旋毛虫属(7Hc/n'"e〃asp.)例外)蠕虫一般需要离开第一寄主并传播到第二寄主以便复制。与上述类型楿反体外寄生节肢动物与寄主身体的外表面形成寄生关系。寄生生物包括细胞内寄生生物和专性细胞内寄生生物寄生生物的例子包括泹不限于恶性疰原虫CP/wmoAwm/a/c^flrww)、卵形疟原虫(尸/osmcxiz'wmova/e)、三日痴原虫(户/asmo(^z'wm附a/an'ae)、间日痴原虫(/Vasmodz'wmv/vax)、i若氏疾原虫(尸/aswod/wwA77cw/es/)、孩么小巴贝虫(Sfl^ey/"、分4支巴贝虫CSa6ew'aAVerge"s)、克氏锥虫(7>y/awwcwacrwz7')、弓形虫(7ba:cip/as7nago"d")、^赱毛虫(7Wc/2/we〃(3s戸'rafe)、硕大利什曼原虫(Le^/zwam'a、杜氏利什曼原虫(丄e/s/2Wflm'a(iowovam')、巴西利fl"曼原虫(丄e^/zwam'a6razz7z.e"w》、热带利"f十曼原、虫(Xe/s/wzam'afrap/ca)、冈比亚4,虫(7)j/a"ayom"gaw&e似e)、罗德西亚4,虫(7)j/"wc^cw"r/zO(ies7'erae)和曼氏血吸虫(/Sb/z/stoso"7a48在脊嶊哺乳动物内造成感染。由于真菌是真核细胞生物体它们与原核细胞细菌在尺寸、结构组织、生命周期和繁殖机理上有显著差异。通常根据形态特征、生殖模式和培养特性将真菌分类尽管真菌可在受试者内造成不同类型的疾病，例如吸入真菌抗原后的呼吸道过壽l、由於4聂取有毒物质[如有毒蘑菇产生的毒伞毒素p/w〃o/。festoxin)和毒蕈肽以及曲霉菌属产生的黄曲霉毒素]引起的真菌中毒，并非所有真菌都造成感染性疾病感染性真菌能造成系统性或浅表性感染。原发性系统性感染可出现在正常健康受试者中而机会性感染大多频繁发现于免疫低下的受试者中。造成原发性系统性感染的最普通的真菌体包括芽生菌属(S/as/cwycej)、5求孑包菌属(CoccW/oz'cfes)和纟且织月包浆菌属(///Wc;p/as附a)在免疫低下或免疫抑制的受试者Φ造成机会性感染的普通真菌包括但不卩艮于白色念玉朱菌(Cawd/daa/6/c(3w)、新生隐J求菌(Oy/tococcw恥0/0WWra)和各种曲霉菌(Aj!7Wg/〃W)属。系统性真菌感染是对内部器官的侵袭性感染所述生物体通常经肺、消化道或静脉内导管进入体内。这些类型的感染可由原发性致病真菌或机会性真菌造成浅表性真菌感染涉及嫃菌在外表面的生长而不侵入内部组织。典型浅表性真菌感染包括涉及皮肤、头发或指曱的皮肤真菌感染与真菌感染有关的疾病包括曲黴菌病、芽生菌病、念珠菌病、着色芽生菌病、球孢子菌病、隐球菌病、眼真菌感染、头发、指甲和皮肤真菌感染、组织胞浆菌病、链状芽生菌病、足菌肿、耳真菌病、类球孢子菌病、播散性马尔尼菲青霉菌病、暗色丝孢霉病、鼻孢子菌病、孢子丝菌病、和接合菌病。其它醫学相关微生物已在文献中详细说明例如，参见C.G.AThomas,ikfoiZca/Af/c/xh.o/ogy,BailHereTindall,GreatBritain1983,本文通过参考引用其全部内容上述各列表均为说明性的，而非意图为限制性的如本攵所用的，术语"癌抗原"和"肿瘤抗原"可互换地用于指代诸如肽、蛋白或糖蛋白等与肿瘤或癌细胞有关的化合物所述化合物当在主要组织相嫆性复合物(MHC)分子环境中在抗原呈递细胞表面表达时能引发免疫应答。由癌细胞差异性表达的癌抗原可因此被利用来輩巴向癌细胞癌抗原昰能够潜在地刺激显性肺瘤特异性免疫应答的抗原。某些此类抗原由正常细胞编码尽管不一定由正常细胞表达。此类抗原可以描述为通瑺在正常细胞中沉默(即不表达)的抗原、仅在细胞分化的特定时期表达的抗原和暂时性表达的抗原如胚胎抗原和胎儿抗原。其它癌抗原由諸如癌基因(例如活化ras癌基因)、抑制剂基因(例如，突变体p53)、因内删除或染色体易位形成的融合蛋白的突变细胞基因编码还有其它癌抗原能被病毒基因诸如RNA和DNA肿瘤病毒携带的病毒基因编码。癌抗原可通过制备癌细胞的粗提物如CohenPA等(1994)Owceri^s54:1055-8中所说明、将所述抗原部分提纯、重组技术戓者对已知抗原的从头合成从癌细胞制备。癌抗原包括但不限于重组表达抗原、抗原的免疫原部分或其全肿瘤或癌或细胞这类抗原可经偅组或本领域内任何其它已知方法来分离或制备。肿瘤抗原的例子包括MAGE、MART-1/Melan-A、gp100、二肽肽水解酶IV(DPPIV)、腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)、亲环蛋白b、大肠相关忼原(CRC)-C017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)及其免疫原表位CAP-l和CAP-2、etv6、amll、前列腺特异性抗原(PSA)及其免疫原表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、T细胞受体/CD3-;链、肿瘤抗原MAGE族(例如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE陽A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-AIO、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE隱Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)、肿瘤抗原GAGE族(例如，GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE画6、GAGE-7、GAGE画8、GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM画1、CDK4、酪氨酸酶、p53、而C族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、a-曱胎蛋白、E-钙粘蛋白、a-连接蛋白、卩-连接蛋白和Y-连接蛋白、pl20ctn、gpl00Pmdll7、PRAME、NY-ESO-l、cdc27、腺瘤性息肉蛋白(APC)、胞衬蛋白、间隙连接蛋白37、Ig-独特型、p15、gp75、GM2和GD2神經节苷脂、病毒产品诸如人乳头瘤病毒蛋白、肿瘤细胞Smad族、lmp-l、P1A、EBV编码核抗原(EBNA)-1、脑糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(HOM誦MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-l和CT-7以及c-erbB-2。该列表并非限制性的本文所用"过敏原"是能引发以产生IgE为特征的免疫应答的分子。过敏原还是能在易感对象中诱导过敏反应或孝喘反应的物质因此，在夲发明上下文中词语过敏原是指能引发由IgE抗体介导的过敏反应的特定类型抗原。过敏原的列表庞大并可包括花粉、昆虫毒液、动物毛皮屑、真菌孢子和药物(例如，青霉素)天然动物和植物过敏原的实力包括对下列种类特异的蛋白犬属(家犬)、尘螨属(例如，粉尘螨)、猫属(家貓)、豚草属(美洲豚草)、黑麦草属(例如多年生黑麦草和一年生黑麦草)、柳杉属(日本柳杉)、链格孢属(链格孢菌)、桤木属、赤杨属(赤杨)、桦木屬(白桦)、栎木属(白栎)、洋橄榄属(油橄榄)、蒿属(艾草)、车前属(例如，长叶车前草)、墙草属(例如药用墙草和欧蓍草)、姬蠊属(例如，德国小蠊)、蜜蜂属(例如^^w"/^/7wmw)、柏木属(例如，丝柏、绿干柏和金冠柏)桧属(例如/w"^emssa6/"oz'(i^、铅笔柏、欧洲刺柏和Jwm;pen^os/ze/)、金4中柏属(例^口，7Tw少aon'e"to/、扁柏属(例^口曰本扁柏)、夶蠊属(例如，美洲大蠊)、冰草属(例如匍旬水草)、黑麦属(例如，黑麦)、小麦属(例如小麦)、鸭茅属(例如，鸭茅)、羊茅属(例如牛尾草)、早熟禾属(例如，草地早熟禾和加拿大早熟禾)、燕麦属(例如燕麦)、绒毛草属(例如，绒毛草)、黄花茅属(例如黄花茅)、燕麦草属(例如，花叶燕麥草)、剪股颖属(例如小糠草)、梯牧草潙(^6^，梯牧草)、篛草^(^"/如鶄草)、雀稗属(例如，百喜草)、高粱属(例如假高粱)和雀麦属(例如，无芒雀麦)本发明在一方面提供了本发明的免疫刺激性ORN和抗原的共轭体。在一个实施方式中本发明的免疫刺激性ORN与所述抗原共价连接。所述免疫刺激性ORN和所述抗原之间的共价键可以是任何适当类型的共价键条件是所述免疫刺激性ORN和所述抗原在如此连接时保持了各单独成分的可测功能活性。在一个实施方式中所述共价键是直接的。在另一实施方式中所述共价键是间接的，即通过连接子基团所述共价连接的免疫刺激姓ORN和抗原可在细胞内处理51以便将一者从另一者释放。与如果作为单一制剂或单一成分施用时的输送相比以这种方式进行的任一成汾到细胞的输送将得到提高。在一个实施方式中所述抗原是抗原本身，即它是预制抗原物组合物。在不同实施方式中所述输送载剂鈳以选自阳离子脂质、脂质体、螺旋体、病毒颗粒、免疫刺激复合物(ISCOM㊣)、微粒、微球、纳米球、单层嚢泡(LUV)、多层嚢泡、乳化粒(emulsome)、多阳离子肽、脂复合物、多聚复合物、脂多聚复合物、油包水(w/o)乳液、水包油(o/w)乳液、水包油包水(W/0/W)多重乳液、二徵乳液、纳米乳液、胶束、树枝状大分孓、病毒颗粒、类病毒颗粒、高分子纳米颗粒(诸如纳米球或纳米胶嚢)、高分子微粒(诸如微球或微胶囊)、壳聚糖、环糊精、类脂嚢泡、或ISCOM⑧鉯及任选的可药用载体。下面讨论可药用载体本发明的药物组合物还可包含抗原。使用进行物理结合免疫刺激组合物可以包含在输送載剂内部，或存在于输送载剂的溶剂接触表面上或与该表面结合在一个实施方式中，免疫剌激性ORN存在于输送载剂的溶剂接触表面上或与該表面结合且抗原当存在时包含在输送载剂的内部。在另一实施方式中免疫刺激性ORN和抗原均存在于输送载剂的溶剂接触表面上或与该表面结合。在另一实施方式中抗原存在于输送载剂的溶剂接触表面上或与该表面结合，而免疫刺激性ORN包含于输送载剂内部在另一实施方式中，免疫刺激性ORN和当包含抗原时的抗原都包含于输送载剂内部面本发明提供了激活免疫细胞的方法。根据本发明这一方面的方法包括将体外或体内的免疫细胞与有效量的本发明的组合物接触以激活所述免疫细胞的步骤本发明的组合物可任选地包含抗原。本文所用"免疫细胞，指能参与天然免疫应答或获得性免疫应答的任何骨髓衍生细胞免疫系统的细胞包括但不限于树突状细胞(DC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、B淋巴细月包、浆细胞、T淋巴细胞和它们的前体细胞。在某些实施方式中所述免疫细胞是表达TLR7的细月包。如夲文所用术语"有效量，指带来所需生物学效果所必需或足够的物质的量。有效量可以是但不限于单一用药所施用的量如本文所用，術语"激活免疫细胞，指诱导免疫细胞进入与免疫应答有关的激活状态术语"激活免疫细胞"既指诱导也指提高免疫应答。如本文所用术語"免疫应答"指能将免疫细胞的激活反射为增殖、执行效应因子免疫功能或产生参与免疫应答的基因产物的天然或获得性免疫应答的任何方媔。参与免疫应答的基因产物可包括分泌产物(例如抗体、细胞因子和趋化因子)以及免疫功能的特征性细胞内和细胞表面分子(例如，某些汾化群(CD)抗原、转录因子和基因转录本)术语"免疫应答"可应用于单个细胞或细胞群体。细胞因子的生成可由本领域内熟知的几种方法之一进荇评价所述方法包括生物应答片企测、酶联免疫吸附测定(ELISA)、细胞内焚光激活细胞分类(FACS)分析和反转录酶/聚合酶链式反应(RT-PCR)。在一个实施方式Φ所述免疫应答涉及IFN-a的生成。在一个实施方式中所述免疫应答涉及免疫细胞激活的细胞表面标记诸如CD25、CD80、CD86和CD154的上调。测量此类标记的細胞表面表达的方法熟知于本领域内且包括FACS分析对于在细胞的细胞或细胞群中免疫应答的测量，在一个实施方式中所述细胞或细胞群表达TLR7。所述细胞能天然地表达TLR,或可通过在该细胞内引入TLR的适当表达载体来才喿控该细胞以表达所述TLR在一个实施方式中，细胞的细胞或细胞群作为表达TLR的细胞系获取在一个实施方式中，细胞的细胞或细胞群作为表达所述TLR的过渡转染子获取在一个实施方式中，细胞的细胞戓细胞群作为表达所述TLR的稳定转染子获取另外对于在测量细胞的细胞或细胞群中免疫应答的使用，方便的是向所述细胞的细胞或细胞群內引入通过TLR对细胞内信号传导产生应答的报道子构建体在一个实施方式中，该报道子是在NF-KB启动子控制下的基因在一个实施方式中，在所述启动子的控制下的基因是荧光素酶在适当激活条件下，荧光素酶报道子构建体被表达并且释放能够用光度计来定量测量的可检测咣信号。这类报道子构建体和其它适合的报道子构建体是商品化的本发明还设想了使用无细胞方法来检测TLR激活。本发明在某些方面涉及鼡于治疗的组合物和方法本发明的免疫刺激性组合物可以单独使用或与其它治疗剂联合使用。所述免疫刺激性组合物和其它治疗剂可同時施用或相继施用当本发明的免疫刺激性组合物和其它治疗剂同时施用时，它们可在相同或不同配方中施用但它们在同一时间施用。叧外当本发明的免疫刺激性组合物和其它治疗剂同时施用时，它们可通过相同或不同施用途径施用但它们在同一时间施用。当本发明嘚免疫刺激性组合物的使用与其它治疗剂的施用暂时分开时本发明的免疫刺激性组合物和另一治疗剂相继施用。这些化合物的施用之间嘚分隔