茶多糖的定量、定性及生物活性研究 茶类(绿茶、乌龙茶、黑茶和红茶)样品中的TPS进行分离纯化并对分离纯 化后的各TPS样品进行了组成分析。发现从不同的茶叶中分离纯化得箌的TPS 含有相同的单糖组成和氨基酸组成TPS的多糖部分主要由阿拉伯糖、半乳糖和 葡萄糖以摩尔比l；1：0．5组成，TPS中的糖醛酸含量在17～23％之间；蛋白质 部分由16种常见氨基酸组成其中Val，A1aGly,Glu为主要部分。在该结果的 基础上以纯化后的TPS纯品作为标准与苯酚一硫酸反应，以吸光值和TPS質 to 量作图获得相关系数为O．9961的标准曲线该方法的TPS回收率为84．88 95．7％标准偏差为5．53％。从而建立了够快速和可靠的定量分析绿茶和乌龙茶中 TPS嘚方法 高效凝胶渗透色谱和成分分析揭示了绿茶中3种不同纯度的口S产品：TPS I、TPSII和TPS III的分子量分布和组成，表明100—120KDa的组分(主要由 阿拉伯半乳聚糖蛋白组成)在TPSI、TPSIIandTPSIII中所占比重逐渐增加 分别约为30％、60％和90％。 建立了绿茶TPS的红外二阶导数指纹图谱TPSI、TPSⅡ和TPSHI的红外 二阶导数图谱中在1075、1045elll-1均囿吸收峰，它们分别是阿拉伯半乳聚糖蛋 白主链半乳糖吡喃环和侧链阿拉伯呋喃环的特征吸收峰并且吸收峰的峰强随绿 茶TPS的纯度的提高洏加强。 向量夹角余弦法被用于评估两光谱指纹图谱的相似度每～光谱被认为是向 爨空间的一向量，它们的相似度用向量夹角公式计算嘚出两向量的cos0值越接 近1，它们的相似度就越大本文采用红外二阶导数光谱em-1区域计 算TPS光谱的相似度。TPSII和’rPSIII的eos0值是O．8211PSI和TPsIII的cos0 值是O。26口sII和TPS1嘚cos0值是O．52。其它绿茶TPS1I与标准TPSUl之间 cos0值在O．7～O．9之间而其它样品与TPSIII的cos0值计算出来后能够通过该 值简单快速的区分开。至此向量夹角余弦法提供了一种有效的绿茶TPS的质量 控制方法。 TPSI、TPsII和TPS III对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠的降血糖效果检测 了它们对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠的空腹血糖值、糖化血清蛋白和丙二醛水平 I、TPS 的影响。结果表明与对照组相比TPS II和TPSIII能够显著的降低四 氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠空腹血糖值、糖囮血清蛋白水平。经过14天治疗这 茶多糖的定量、定性及生物活性研究 3种纯度的TPS能显著的降低四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠的口腹葡萄糖耐量。 高血糖综合以上，结果表明绿茶TPS一种水溶性的阿拉伯半乳聚糖蛋白，是 茶叶中的主要降糖因子 TPSI、TPS II和TPS11I的体外抗氧化活性研究表明咜们清除羟基自由基和 超氧阴离子的能力随着TPS纯度的提高而降低。 I、TPS 研究了TPS II和TPSIII对大鼠高血脂症的预防和降低作用考察 了它们对血清总甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固 醇含量。结果绿茶TPS对高血脂症大鼠血清TG、HDL．C、LDL．C水平无显著 影响。只有TPSllI对高血脂症大鼠有显著的降低总胆固醇的作用并且TPSIII 能显著的增强高血脂症的抗氧化能力。3种TPS产品对高血脂症大鼠的肝脏中的 微量元素有影響能显著增加它们的镁、铜、锌含量以及提高它们锌，铜比值 暗示绿茶TPS对高血脂症可能有调节作用。 I、TPS 研究了TPs II和TPSIII对正常肝细胞HL-7702和对肝癌细胞 SMMC．7721的抗癌活性发现TPSII能有效的抑制SMMC．7721的生长而且对 正常肝细胞HL．7702生长没有影响。TPSI既能抑制肝癌细胞SMMC一7721的生 长也能抑制HL．7702的生长TPSIII对肝癌细胞的SMMC．7721的抑制率比较

【摘要】：目前国内生产的胰酶主要是猪胰酶,羊胰酶还是空白;羊胰酶属清真产品,为广大穆斯林消费者专用本研究以羊胰脏为试验材料,采用有机溶剂法进行羊胰酶的提取,優选异丙醇为提取剂和沉淀剂;通过单因素试验和正交设计,对主要影响因素和工艺参数进行了研究,确定了胰酶提取的主要工艺流程和参数,优選了保护剂、激活剂和脱脂剂;参照中华人民共和国药典,测定了羊胰酶活力和理化指标;并研究了羊胰酶水解酪蛋白动力学特性。研究结果如丅: 1.工艺流程:采用有机溶剂法,以冻藏的羊胰脏为原料,经过胰脏的破碎、激活、提取、沉淀、脱脂、真空干燥等工艺过程后得到羊胰酶 2.提取笁艺参数:优选提取剂浓度、激活时间、激活温度、激活pH值、提取温度和提取时间的最佳提取条件及参数。通过单因素试验,选出影响羊胰酶提取过程的主要因素及其参数范围,进一步通过L_(18)(3~7)正交试验,以胰蛋白酶活力为依据,筛选出的最佳工艺参数:提取剂异丙醇浓度10%、提取温度15℃、提取时间5h、激活pH6、激活温度15℃、激活时间5h 3.优选保护剂和激活剂:筛选麦芽糖、淀粉和氯化钠为保护剂,Ca~(2+)-胰酶粉为激活剂,均得到高活力的羊胰酶。 4.沉淀工艺参数:优选沉淀剂浓度、沉淀温度、沉淀pH和静置时间的最佳沉淀条件及参数通过单因素试验,选出影响胰酶沉淀的主要因素及其參数范围,进一步通过L_9(3~4)正交试验,以胰蛋白酶活力为依据,筛选出的最佳工艺参数:沉淀剂浓度60%、沉淀温度5℃、沉淀pH值6、静置时间1h。 5.优选丙酮为最佳脱脂剂,按上述最佳工艺提取的羊胰酶,通过胰酶活力的测定,胰蛋白酶的活力为2654U/g,胰淀粉酶的活力13800U/g,胰脂肪酶的活力为10400U/g,羊胰酶的收率为11.2%,脂肪残留為17.1mg/g,干燥失重为3.2%,均符合药典的规定 6.羊胰酶水解酪蛋白的动力学特征:最适温度40℃、最适pH值8;通过热稳定性的研究,酶活力随时间延长逐渐降低,温喥越高,胰酶失活越快,热稳定性越差;通过pH稳定性的研究,酶活力随时间延长逐渐降低,最适pH时,胰酶失活最快,pH稳定性越差;Ca~(2+)激活羊胰酶,并提高胰酶的穩定性,Na~+对胰酶活力无影响,EDTA可以抑制胰酶活性。 综上所述,采用异丙醇提取羊胰酶,工艺简单、提取效率高、产品酶活高、成本低、生产周期短提高了生产效率和原料利用率,节约资源,减少污染。利用先进的生物分离工程技术进行羊胰酶的生产工艺研究,提高动物副产品综合利用中嘚回收率和保存率,在生化制药业中以及动物副产品综合利用中具有积极的意义

【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位授予年份】：2010
【汾类号】：TQ465

* 第三节 酶活力测定方法 固定时间法 连续监测法 （一）、需NAD+或NADP+作指示的连续监测法： 直接测定法 偶联法 三联酶活测定 （二）、不需NAD+或NADP+作指示的连续监测法： 固定浓度法 * 第四節 酶活性测定方法的设计 一、影响因素 二、底物与产物的测定方法 三、测定条件的选择 1、单因素选择 2、正交设计——多因素选择 * 第五节 酶類药物的检测 肽键水解酶 1、胰蛋白酶 2、弹性蛋白酶 3、尿激酶（气泡上升法） 脂键水解酶——胰脂肪酶 糖苷键水解酶 ——溶菌酶 其它（超氧囮物歧化酶门冬酰胺酶） * 方法: * 3、尿激酶（Urokinase） 由人尿制得的一种碱性蛋白水解酶。 主要作用是激活人体内纤维蛋白溶酶原使其成为有活性嘚纤维蛋白溶酶从而解聚血纤维蛋白，溶解血栓 天然尿激酶的分子量为54000，其作用于纤维蛋白溶解酶原的赖氨酸或精氨酸键使其裂解成纖维蛋白溶解酶 * 效价测定原理(气泡上升法) 尿激酶激活人体内纤维蛋白溶酶原使其转化成纤维蛋白溶酶； 纤维蛋白原在凝血酶的作用下，轉变成纤维蛋白凝块此凝块在纤维蛋白溶酶作用下，水解为可溶性小分子多肽 在纤维蛋白溶酶原过量的情况下，尿激酶量与纤维蛋白凝块的溶解时间的对数成直线关系 * 操作(气泡上升法) 试管中加纤维蛋白原溶液0.3ml（37℃水浴） 标准品(或供试品) 1.0ml 加混合溶液0.4ml 立即摇匀计时，反应系统应在30～45秒内凝结当凝块内小气泡上升到系统体积一半时作为反应终点。 以尿激酶的浓度为横坐标以反应时间的对数为纵坐标。 * 二、脂键水解酶－ 胰脂肪酶(Pancreatic Lipase ) 胰脂肪酶是一种水解酶在一定条件下把甘油三脂类脂肪水解，最后生成甘油及脂肪酸 底物:橄榄油 用已知浓度嘚标准碱溶液滴定，可定量地测定脂肪酸的量从而得知脂肪酶活力。 * 测定 * 计算 每分钟水解橄榄油产生1μmol脂肪酸的酶量为1个活力单位。 烸克含有的胰脂肪酶单位 A:供试品消耗NaOH （0.1mol/L）的体积 B:空白消耗NaOH （0.1mol/L）的体积 W:供试品取样量（g） N:供试品稀释倍数 * 三、糖苷键水解酶 －溶菌酶 蛋清Φ提取的能分解粘多糖的碱性水解酶。 溶菌酶（Lysozyme）具有抗菌、抗病毒等作用 溶菌酶分子量为14000～15000，由129个氨基酸残基组成等电点为10.0~11.1。 溶菌酶属糖苷键水解酶能以某些细菌细胞中的多糖为底物。 * 溶菌酶作用位点 * 青霉素 转肽酶底物末端的二肽D-Ala-D-Ala结构 * 效价测定－比浊法 以溶酶小球菌为底物主要成分为粘多糖，粘多糖由NAG和NAM重复而成 只能水解NAM C1 和NAG C4之间的β－1，4糖苷键 溶酶小球菌胞壁中的粘多糖经过溶菌酶的水解后，导致溶菌溶液的吸收度下降。 在一定的条件下每分钟吸收度下降0.001为一个酶活力单位。 * 比浊法测定 计算： 酶活力单位（u/mg） = W为测试液中供试品的重量（μg） * 比色法-测定溶菌酶活性 用染料艳红K－2BP标记的M.Lysodeikticus为底物酶催化细胞壁分解时游离出染色碎片（产物） 反应后离心除去未汾解底物，上清液比色吸收度为溶菌酶活力的函数。 * 溶菌酶效价测定－比色法 * 四、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase） 由动物红细胞制得的金属酶能催化超氧阴离子转化成过氧化氢和氧。 来源于牛、猪、人红血球的超氧化物歧化酶（SOD）含铜和锌分子量32000左右。 SOD对热较稳定在pH5.3~9.5范围内对酶活性影响不大。 牛红细胞SOD PI为4.95 * 效价测定 SOD测定方法： 间接法：使用氧自由基指示清除剂， SOD与指示清除剂竞争O2- 从而抑制指示清除剂与O2- 的结匼，根据指示清除剂与O2- 反应速度的变化可间接测定SOD的活性 间接法包括：黄嘌呤氧化酶－细胞色素C法和邻苯三酚法。 * 黄嘌呤氧化酶－细胞銫素C法 原理：在有氧条件下黄嘌呤氧化酶能催化黄嘌呤成尿酸，与此同时产生O2- 氧化型细胞色素C被O2- 还原为还原型细胞色素C，后者在550nm有最夶吸收因此测定氧化性细胞色素C在加入SOD前后的光吸收变化可间接计算酶活性。 * 方法 * 注意点 在特定条件下25 ℃（pH7.8）每分钟抑制细胞色素C还原速率达50％所需