纸片扩散法空白药敏纸片试验平板叠放不超过几个

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批准文号:渝食药监械(准)字1号
规格:5个平板/包(?90mm)、10个平板/包(?90mm)、5个平板/包(?100mm)、10个平板/包(?100mm)、5个平板/包(?120mm)、10个平板/包(?120mm)、5个平板/包(?150mm)、10个平板/包(?150mm)
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成&&分该产品主要组成成分:牛肉膏2g/L、酪蛋白酸性水解物17.5g/L、淀粉1.5g/L、琼脂17g/L、纯化水1000mL、辅酶Ⅰ3mL/L。
适用于嗜血杆菌的纸片扩散法药物敏感试验。
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历史上的今天
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云南省第一人民医院&& 检验科
(副主任医师)
纸片扩散法(K-B法)药物敏感试验是在涂有细菌的琼脂平板培养基上按照一定要求贴浸有抗菌药的纸片,培养一段时间后测量抑菌圈大小,并根据相关解释标准进行结果分析,从而得出受试菌株药物敏感性的结论。
纸片扩散药敏试验的原理:将含有定量的抗菌药物的纸片贴在接种有待测菌的固体培养基上,通过抗菌药物在培养基上的扩散,观察是否出现抑菌环,推断是否抑制细菌的生长。药物扩散的距离越远,药物浓度越低抑菌能力越强,因此可根据抑菌环的大小,判定药物对细菌的抑制作用强弱。
1. 待测菌株接种物制备(1)通用情况:从过夜孵育的平板,优先选择哥伦比亚血琼脂平板上的菌落上挑取数个单个菌落,直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液,使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位,使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌(1-2)*1012CFU/mL浓度。(2)特殊情况:嗜血杆菌属(本程序中所指的嗜血杆菌仅包括流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌):从过夜孵育的HTM平板,直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液,使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位,使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌(1-2)*1012CFU/mL浓度。2.接种平板(1)调整好悬液的浊度后,用无菌棉签浸入悬液内,紧贴试管内壁在液体上方旋转拭子数次,除去棉签上多余的液体,但也应适度。(2)用拭子划线整个琼脂表面,从平板顶部到底部,均匀涂布,重复两次此过程(一共三次)每次旋转平板约60度,确保每次接种菌液均匀分布,最后在琼脂平板的边缘涂抹一圈,防止有流动的菌悬液,并使菌液涂布于整块平板的每个角落。(3)涂布菌液完成的平板,可在室温放置一会(3-5分钟),以便在放置含有药物的纸片前使琼脂吸收表面多余的水分,但放置时间不应超过15分钟。3.放置测试药敏纸片根据测试菌的不同,按照预先设定的分组,将抗菌药物纸片贴于已接种细菌的琼脂表面,每个纸片必须压下以确保与琼脂表面完全接触无论是单独放置的纸片或有纸片分配设备纸片必须分布均匀,两纸片之间圆心的距离不少于24mm,纸片边缘距离琼脂边缘不少于15mm。我室使用的MH平板直径为90mm,放置不超过5块纸片。由于一些药物几乎是瞬间扩散的,因此,一旦纸片与琼脂表面接触就不能再移动位置,若位置不佳可在琼脂的另一个位置重新放置一个纸片。4.孵育(1)通用情况:在放置好纸片后,15分钟内,将MH琼脂倒置于号孵箱(35℃)中,孵育16~18小时(除外下面列出的需要延长孵育时间的情况)。嗜血杆菌属、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌和链球菌KB纸片法测试平板应放置于含有5% CO2的环境进行孵育。(2)延长时间培养:①测试苯唑西林、头孢西丁对葡萄球菌的敏感性时,孵育时间必须达到24h,才能满足对结果判断的要求。②测试万古霉素对金黄色葡萄球菌及肠球菌属的敏感性,孵育时间必须达到24小时。5.抑菌环直径测量(1)通用情况:35℃,经过16~18小时的孵育后,将贴有纸片的MH平板置于黑色不反光的背景上,采用游标卡尺,来测量抑菌环的直径(完全抑制区的直径),可以从平板的背面,利用反射光,用肉眼观测,读取最接近的毫米数(读取一个整数)。没有肉眼可见的明显的生长的部位即是抑菌环的边缘。一般情况下,在抑菌环边缘出现只能在放大镜下观察到的微小菌落,可以忽略不计。MH平板上的抑菌环呈均匀的圆形,测试菌株在平板上呈现融合生长菌苔,若出现单个菌落稀疏生长的情况,则说明接种时调制的菌液浓度过稀,需要寻找可能的原因,并重新再一次进行测试。(2)特殊情况:①苯唑西林对葡萄球菌的抑菌环:抬起平皿,对向光源,利用透射光观察苯唑西林纸片周围的抑菌环中是否有任何细微的菌落生长,若是出现任何可以辨别的生长,均应判定苯唑西林耐药。②利奈唑胺对葡萄球菌的抑菌环:利用透射光,用游标卡尺读取抑菌环的数值。③复方新诺明的抑菌环:MH平板中存在一定量叶酸抑制剂的拮抗剂,会导致测试菌轻微的生长,因此,在测量复方新诺明的抑菌环直径时应当忽略细微的生长情况(约20%),而将明显出现生长的地方作为抑菌环的边界进行测量。
兼性厌氧菌的抑菌环大小的判读请参照CLSI M100-S27及M45-A3,根据抑菌环的直径的数值报告测试的细菌对测试药物敏感、中介、耐药及SDD(剂量依赖性敏感)。有些药物只能报告为敏感或不敏感,这是由于没有或极少出现明确的耐药菌株,因而只给出了敏感的折点。
药物选择应由临床医师、药师及微生物实验室共同根据CLSI文件进行选择。青岛海博生物为您提供种类齐全的微生物培养基产品及相关技术服务!
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纸片扩散法(K-B法)--药敏试验
录入时间: 10:31:51
来源:海博生物
基本原理:
&将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种待检菌的琼脂平板上,纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后会不断地向纸片周围区域扩散,形成递减的浓度梯度,在纸片周围抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制,从而产生透明的抑菌圈。
&抑菌圈的大小反映检测菌对测定药物的敏感程度,并与该药对待检菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关,即抑菌圈俞大,MIC俞小。
1. 从琼脂平板挑取形态相似的纯培养菌落接种肉汤培养基,并于35度培养至浊度达到或超过0.5麦氏单位,取出用盐水或肉汤调节菌液浓度至0.5麦氏单位,含菌量约(1-2)×108cfu/ml。也可将菌落直接悬浮于无菌盐水或肉汤内,调至0.5麦氏单位,这称为直接菌悬液法。
2. 用无菌棉拭子浸入调好的菌悬液中,将多于菌悬液在管壁挤出,在M-H琼脂平皿上划线,划满整个琼脂表面,旋转平皿60°重复划线共三次,最后一次用拭子涂抹琼脂边缘。置室温3-5分钟。
3.用纸片分配器或无菌镊子取药敏纸片,贴于平板表面,并用镊尖轻压一下纸片,使其贴平。每张纸片的间距不小于24mm,纸片的中心距平板的边缘不小于15mm,90mm直径的平板适宜贴6张药敏纸片。
4. 将贴好纸片的平板置35度孵育18-24h后,用游标卡尺量取抑菌圈直径。
根据抑菌圈的大小(不同抗生素其抑菌圈大小的标准不一致),判断为敏感(S),耐药(R)或中介度(I)。
某些细菌可蔓延生长至某种抗生素的抑菌圈内,如磺胺药抑菌圈内可能有微量的细菌生长,可忽略不计,应以外圈为准。
M-H琼脂培养基
根据商品无水M-H琼脂干粉要求制备,高压后平衡温度至45-50度时倾注平皿,使表面呈水平,琼脂厚度为4mm,pH值应在7.2-7.4间,表面应保持湿润,但不能有水滴。
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