求助双酶切质粒酶切切开了，目的片段切不开

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2018-04-25 19:53 标签： 质粒dna的酶切鉴定
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【求助】表达质粒和目的片段双酶切后，一直连不上，为什么？
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这个帖子发布于7年零50天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
大家好，我最近一直在做表达载体、目的片段的双酶切和酶连、转化。但是转化后的平班上长出来的菌落全部是假阳性的，一个板子能长10-30个菌落，但是做菌液PCR后全部是假阳性。做了好长时间了，一直是这样，不知道什么原因了！还望大家给予指点，小妹在此不胜感激！！！！！！
内切酶和T4连接酶都是购买的TaKaRa的产品。
我用的两个内切酶是EcoRI和XhoI，内切酶是没有问题的，我已经做了单酶切试验了，都能把pET-28a和pGEX-4T-1这两个表达载体切开（由于不知道那种载体能将蛋白表达，所以同时用了2个表达载体）。
我加抗生素的时候都是在LB培养基的温度为50读左右的时候加的。Amp的终浓度是50ng/ul，Kan的终浓度是50ug/ml。
我的酶切体系20ul：EcoRI
1ul，XhoI 1ul，10*H Buffer 2ul，质粒DNA/目的片段
16ul；37度酶切4h。双酶切产物进行柱式胶回收纯化，然后进行连接。
酶连体系10ul：T4连接Buffer 1ul，DNA 3ul，载体DNA 5ul，T4连接酶 1ul；我是按照p摩尔比（DNA：载体DNA=10:1进行的连接）；连接条件是4杜连接过夜（20h左右）。纯化后的载体DNA浓度为5ng/ul，DNA浓度为40ng/ul。
将以上的连接产物进行转化实验，转化到大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）中，最后平板上长出来的菌落全部是假阳性的！
我的目的片段是1.9kp，目的片段直接用PCR纯化产物进行双酶切，表达载体提取质粒后进行双酶切，然后进行的酶连以及后续试验。
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酶切后的载体做个自连的对照吧，看看载体有没有完全切开！另外不知道你酶切前的载体跟片段的浓度，你少切点儿试试，保证你的酶切量在500ng以下，我觉得是你的载体没有切开。
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我觉得这其中存在一个问题，你构建载体时感受态细菌用的是BL21，这个菌一般用来做表达用，但是不适合用于做克隆，转化效率太低，不如在构建载体时换用DH5或者JM109之类的感受态细菌，而且连接反应也没必要在四度进行，直接16度过夜就可以。还有，如果假阳性太高，可以考虑采用磷酸酶如CIP之类的处理一下载体，可以防止载体自连。
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我是菜 酶切后的载体做个自连的对照吧，看看载体有没有完全切开！另外不知道你酶切前的载体跟片段的浓度，你少切点儿试试，保证你的酶切量在500ng以下，我觉得是你的载体没有切开。酶切前载体的浓度是5ng/ul，目的片段的浓度是40ng/ul。我再试试看吧。谢谢您了！
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关于丁香园质粒双酶切的后目的片段怎么变大了_百度知道
质粒双酶切的后目的片段怎么变大了
我有更好的答案
首先从基因序列着手检查酶切位点是否正确；检查酶切实验，确认反应条件、缓冲溶液使用正确，不存在非特异性切割。前提是确定双酶切后载体骨架片段大小正确，条带亮度基本符合比例。分析载体与基因片段上的某处是否有共同酶切位点，再通过载体上的通用引物对重组质粒进行PCR验证。可以用两种酶对重组质粒和空载体分别做两组单酶切，哪一组结果与理论不一致，哪一组的酶就有问题，如果都没有问题那么很有可能是双酶切反应体系存在问题。最后不排除琼脂糖凝胶电泳存在分子量大小的误差，视琼脂糖凝胶电泳结果图片而定。有问题可以追问，欢迎交流。
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【求助】求解：构建质粒时加了两个酶切位点，测序结果也显示存在，双酶切鉴定却未见切出条带
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这个帖子发布于2年零137天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
求解：构建质粒时加了两个酶切位点，测序结果也显示存在，双酶切鉴定却未见切出条带，重复实验仍然未切出，求解是什么原因？构建了两种不同目的片段的质粒，添加了酶切位点相同，其中一个切开了，一个未切开，测序结果显示都是添加成功了。求解？求解？求解？左图是酶切3小时，右图是酶切过夜
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How big is the insert? What are the two enzyme sites? Do you have single enzyme digestion results?
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mpark How big is the insert? What are the two enzyme sites? Do you have single enzyme digestion results?首先谢谢您的回复！我用的是pGEMT载体3000bp插入片段1300bp左右，片段两边添加的是PmeⅠ 和XbaⅠ 这两个酶切位点，我是用来做突变后再连入其他载体上的。前几天也看见其他帖子里有说用单酶切，不过没鉴定过，打算再尝试一下。另外想请教下我会不会是碰到了甲基化的原因切不出来？
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Try to use any enzyme that can cut cloned construct ( 3.0 kb vector plus 1.3 kb insert) only once and run gel long with the linearized 3.0 kb pGEMT.
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