24小时热门版块排行榜&&&&
【悬赏金币】回答本帖问题，作者生工小懒虫将赠送您 5 个金币
(初入文坛)
在线: 1.5小时
虫号: 4155583
注册: 专业: 生物化学
提RNA反转成cDNA，RT-PCR一直P不出来目的条带怎么办已有3人参与
各位大神求助，我最近一直在做PT-PCR，一直没有目的条带，或者只有一点点很淡。我跑了我提的RNA条带很亮，有三条。没问题。但为什么P不出来，是反转出了问题么？可是我反转了两次都这样啊！分子小白求大神指点
& 猜你喜欢
已经有3人回复
已经有6人回复
已经有58人回复
已经有0人回复
已经有2人回复
已经有0人回复
已经有9人回复
已经有16人回复
已经有20人回复
& 本主题相关商家推荐:
(正式写手)
在线: 64.4小时
虫号: 3511837
注册: 性别: GG专业: 人类遗传学管辖:
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:: Originally posted by 6_pengfei at
你用你的引物扩增DNA试试，说不定是引物没设好，如果DNA扩增条带亮，那就是你的cDNA有问题，估计是反转录出问题了 这个是正解control
(著名写手)
在线: 572.6小时
虫号: 3046113
注册: 性别: GG专业: 生物大分子结构与功能
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
把CDNA跑个电泳，发图来看下。，或用其他引物P下CDNA.
采菊东篱下，悠然见南山。
(小有名气)
在线: 33.1小时
虫号: 2734415
注册: 性别: GG专业: 植物生理与生化
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
你用你的引物扩增DNA试试，说不定是引物没设好，如果DNA扩增条带亮，那就是你的cDNA有问题，估计是反转录出问题了
(初入文坛)
在线: 1.5小时
虫号: 4155583
注册: 专业: 生物化学
引用回帖:: Originally posted by 6_pengfei at
你用你的引物扩增DNA试试，说不定是引物没设好，如果DNA扩增条带亮，那就是你的cDNA有问题，估计是反转录出问题了 我用另一对引物也试过，还是P不出来
10(金币+2)
小木虫,学术科研互动社区,为中国学术科研免费提供动力
违规贴举报删除请发送邮件至：
广告投放与宣传请联系 李想 QQ：
QQ：&&邮箱：
Copyright &
MuChong.com, All Rights Reserved. 小木虫 版权所有您现在的位置：&&>&&>&&>&正文
作者：生物通
来源：生物通
关键词：核酸检测,PCR
自PCR技术诞生以来已经有三十年了。从经典PCR、实时定量PCR再到现在的数字PCR，这一技术在不断蜕变却从未淡出我们的视野。
英国TwistDx Inc公司开发的重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。以此为基础的TwistAmp& 核酸扩增产品，能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外、兽医、食品安全、生物防御、农业等领域。
RPA技术犀利在何处
常规PCR必须经过变性、退火、延伸三个步骤，而PCR仪本质上就是一个控制温度升降的设备。RPA反应的最适温度在37°C - 42°C之间，无需变性，在常温下即可进行。这无疑能大大加快PCR的速度。此外，由于不需要温控设备，RPA可以真正实现便携式的快速核酸检测。
据介绍，RPA检测的灵敏度很高，能够将痕量的核酸（尤其是DNA）模板扩增到可以检出的水平，从单个模板分子得到大约1012扩增产物。而且RPA还用不着复杂的样品处理，适用于无法提取核酸的实地检测。
RPA既可以扩增DNA也可以扩增RNA，还省去了额外的cDNA合成步骤。你不仅可以对扩增产物进行终点检测，还可以对扩增过程进行实时监控，甚至可以通过试纸条（侧流层析试纸条LFD）读取结果。
目前，TwistAmp& 试剂盒的扩增子长度在500bp以内。不过，经过特别优化的RPA扩增，也可以生成更长的扩增产物，或者减慢扩增速度（便于定量），甚至在更低的温度下进行反应。
RPA技术的基本原理
RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸（寡核苷酸引物）的重组酶、单链DNA结合蛋白（SSB）和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37°C左右。
ViaFect转染试剂
重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。
RPA扩增的基础体系（TwistAmp& Basic）含有DNA扩增所需的所有试剂，我们只要准备好引物和模板就行。扩增结果可以通过凝胶电泳进行终点检测，产物纯化后可用于下游研究。
在这个基础体系中添入不同的酶和探针，就可以实现多样化的RPA应用。举例来说，TwistAmp& Basic RT添加了逆转录酶，可以对RNA模板进行一步法扩增。
TwistAmp& exo结合了专利的exo探针技术和核酸外切酶III，能实现数据的实时读取，就像荧光定量PCR一样。不过反应终点的扩增子总量有所减少，适合获得强荧光信号进行动力学分析，不适合终点检测（比如跑胶）。将exo探针技术、核酸外切酶III和逆转录酶结合起来的TwistAmp& exo RT，可以一步实现RNA模板的实时扩增。
TwistAmp& fpg是一个添加了核酶fpg的实时报告体系。fpg探针技术的荧光累积比较慢，但终点的扩增子产量不会减少，因此也能支持终点分析。TwistAmp& nfo加入了核酶nfo，可以用“三明治法”进行终点检测，比如测流层析试纸条LFD。
除此之外，RPA扩增还可以很简单的实现多重化。只需要增加引物/探针就可以一次性检测多个扩增产物。
RPA分析的关键在于扩增引物和探针的设计。PCR引物多半是不适用的，因为RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-38个碱基。引物过短会降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度。
在设计RPA引物时，变性温度不再是影响扩增引物的关键因素。RPA的引物和探针设计不像传统PCR那样成熟，用户需要自己摸条件进行优化。虽然还没有设计可以使用，不过TwistDx Inc公司在自己的网站上提供了相应的筛选指南。
需要注意的是，目前的TwistAmp& 扩增试剂盒都没提供RNase抑制剂。另外，受目前的生产方法所限，RPA反应不适合用于E. coli标准实验室菌株的扩增。(Bioon.com)
(责任编辑：yangsumin)
小编提示：87%用户都在上阅读，扫描立刻下载!
您还可以这样阅读微信扫一扫，体验新式阅读
打开微信扫描二维码 生物谷微信账号：bioonnews 我们提供多种阅读途径供您选择，随时随地掌握医药生物领域最新资讯。
立足行业，提供求职招聘，中高端人才搜索，人才培训及对接等服务 Ta的文章
欢迎行业评论、发现、小道消息、官方爆料、采访约稿
订阅我们的资讯
关注我们新浪微博
中国的市场的确存在很大的隐患，干细胞行业是个专业性要求较高的行业
个体化医疗是未来医学研究与应用的趋势，而个体化治疗的关键在基于生物分子标志物的诊疗策略
中国疫苗市场的巨大潜力，吸引了世界排名最领先的跨国疫苗制造巨头前来淘金。 上传我的文档
 下载
 收藏
粉丝量：58
六年高端汽车品牌市场销售经验，远与所有同仁共享，欢迎站内信。
 下载此文档
宝生物PCR试剂盒说明书
下载积分：700
内容提示：宝生物PCR试剂盒说明书
文档格式：PDF|
浏览次数：963|
上传日期： 16:28:33|
文档星级：
全文阅读已结束，如果下载本文需要使用
 700 积分
下载此文档
该用户还上传了这些文档
宝生物PCR试剂盒说明书
关注微信公众号温馨提示！由于新浪微博认证机制调整，您的新浪微博帐号绑定已过期，请重新绑定！&&|&&
1. cDNA产量的很低可能的原因：*RNA模板质量低*对mRNA浓度估计过高*反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足*同位素磷32过期*反应体积过大，不应超过50μl2. 扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅*最常见的原因在于您的反应体系是PCR的反应体系而不是RT-PCR的反应体系*与反应起始时RNA的总量及纯度有关*建议在试验中加入对照RNA*第一链的反应产物在进行PCR扩增时，在总的反应体系中的含量不要超过1/10*建议用Oligo(dT)或随机引物代替基因特异性引物（GSP）用于第一链合成。由于RNA模板存在二级结构，如环状结果，有可能导致GSP无法与模板退火；或SSⅡ反转录酶无法从此引物进行有效延伸。*目的mRNA中含有强的转录中止位点，可以试用以下方法解决：a. 将第一链的反应温度提高至50℃。b. 使用随机六聚体代替Oligo(dT)进行第一链反应。3. 产生非特异性条带*用RT阴性对照检测是否被基因组DNA污染。如果RT阴性对照的PCR结果也显示同样条带，则需要用DNase I重新处理样品。*在PCR反应中，非特异的起始扩增将导致产生非特异性结果。在低于引物Tm 2至5℃的温度下进行退火，降低镁离子或是目的DNA的量将减少非特异性结果的产生。*由于mRNA剪切方式的不同，根据选择引物的不同将导致产生不同的RT-PCR结果。4. 产生弥散（smear）条带*在PCR反应体系中第一链产物的含量过高*减少引物的用量*优化PCR反应条件/减少PCR的循环次数*在用DNase处理被DNA污染的RNA样品时，其产生的寡核苷酸片段会产生非特异性扩增，一般会显示为弥散背景。5. 产生大分子量的弥散条带*大多数情况下是由于退火温度过低而导致的非特异性的起始及延伸产生的*对于长片段的PCR，建议将反应体系中cDNA的浓度稀释至1:10（或1:100-1:200）6. 在无反转录酶的情况下，对照RNA获得扩增结果*通常是由于对照RNA中含有痕量DNA而导致的。由于进行体外转录时不可能将所有的DNA模板消除。建议可将第一链cDNA稀释1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影响。*有可能是引物二聚体的条带7. 扩增产物滞留在加样孔中*有可能是由于模板量过高而导致PCR结果产生了高分子量的DNA胶状物。建议将第一链结果至少稀释100倍再进行二次扩增。*另外，在二次PCR时使用的退火温度如果比引物的Tm值低5℃，可以将退火温度适当增高或进行热启动以提高特异性。8. SSⅢ与SSⅡ有何不同？*具有更高的热稳定性（达50℃）*具有更长的半衰期（达220分钟）*对PCR无抑制*干冰运输*Tdt活性更低9. 为什么有人更喜欢用SSⅢ而不是ThermoScript？ThermoScript如果保存不当会引起活性很快降低，SSⅢ则更稳定。10. 为什么使用基因特异性引物（GSP）？GSP在扩增低丰度的转录本时是最好的。OligodT引物建议用于高质量RNA及全长转录本的逆转录；随机引物用于mRNA片段的逆转录。11. 什么情况下需要使用RNase H？在第一轮PCR中RNA/DNA杂合体不能正常变性时12. 根据不同的目的选择不同的系统：目的 建议RT与PCR使用不同的引物或需要灵活选择PCR DNA聚合酶 两步法RT-PCR系统高灵敏度 一步法或两步法RT-PCR系统高特异性 含有适当的DNA聚合酶的两步法RT-PCR系统或具有高保真Platinum Taq酶的一步法RT-PCR系统高保真度 含有Pfx Taq酶的两步法RT-PCR系统长的反转录结果 通常使用两步法RT-PCR系统可达到最佳结果含Elongase酶的一步法RT-PCR系统二、Generacer1. 如何针对Generacer试剂盒设计基因特异性引物（GSP）？使用5’或3’RACE试剂都需要至少一条基因特异性引物，您在设计引物时需要注意以下几点要求：*50-70％的GC含量，以提高引物熔点（Tm）*23-28个碱基长度，以提高引物特异性*降低3’端GC含量，将引物非特异性结合的可能性降至最低2. 为什么得不到RACE产物？*加入Hela对照*低质量的RNA模板*逆转录失败，SSII和SSIII非常适用于长模板cDNA的合成*目的基因丰度太低，可以通过提高PCR的循环次数来解决，建议使用巢式PCR*目的基因没有表达，可以通过使用两条GSPs来分析cDNA中是否含有目的基因*目的基因太长而不适合进行反转录，建议使用GeneRacer试剂盒中的Oligo dT来得到全长cDNA，使用随机引物或与模板的5’端尽可能近的GSP进行PCR。*cDNA模板属于困难模板，可以通过以下方法解决：优化PCR反应参数及反应体系；降低退火温度；使用5-10％的DMSO帮助通过高GC含量区；使用高保真度和高延伸能力的酶进行PCR反应。3. RACE的PCR结果有杂带RACE PCR杂带或非特异性PCR条带可能是由于以下原因：*GSP与其他cDNA的非特异性结合会导致在扩增目的产物时得到无关产物。*GeneRacer引物和cDNA的非特异性结合会导致产生一端带有GeneRacer引物序列的PCR产物。*RNA降解。*PCR管或试剂污染。注意：杂带一般是因为没有优化PCR条件，可以加入阴性对照来确定。4. 得不到全长的5’RACE PCR产物*CIP反应后的RNA降解产生了新的带有5’磷酸的断裂模板，可以同GeneRacer RNA Oligo连接。一定要小心操作，保证RNA无降解。*CIP脱磷酸不完全，可以增加反应中CIP的量或减少RNA的量。*PCR产生了杂带，并不是真正的连接产物，可以使用上述建议优化PCR。二、Generacer1. 如何针对Generacer试剂盒设计基因特异性引物（GSP）？使用5’或3’RACE试剂都需要至少一条基因特异性引物，您在设计引物时需要注意以下几点要求：*50-70％的GC含量，以提高引物熔点（Tm）*23-28个碱基长度，以提高引物特异性*降低3’端GC含量，将引物非特异性结合的可能性降至最低2. 为什么得不到RACE产物？*加入Hela对照*低质量的RNA模板*逆转录失败，SSII和SSIII非常适用于长模板cDNA的合成*目的基因丰度太低，可以通过提高PCR的循环次数来解决，建议使用巢式PCR*目的基因没有表达，可以通过使用两条GSPs来分析cDNA中是否含有目的基因*目的基因太长而不适合进行反转录，建议使用GeneRacer试剂盒中的Oligo dT来得到全长cDNA，使用随机引物或与模板的5’端尽可能近的GSP进行PCR。*cDNA模板属于困难模板，可以通过以下方法解决：优化PCR反应参数及反应体系；降低退火温度；使用5-10％的DMSO帮助通过高GC含量区；使用高保真度和高延伸能力的酶进行PCR反应。3. RACE的PCR结果有杂带RACE PCR杂带或非特异性PCR条带可能是由于以下原因：*GSP与其他cDNA的非特异性结合会导致在扩增目的产物时得到无关产物。*GeneRacer引物和cDNA的非特异性结合会导致产生一端带有GeneRacer引物序列的PCR产物。*RNA降解。*PCR管或试剂污染。注意：杂带一般是因为没有优化PCR条件，可以加入阴性对照来确定。4. 得不到全长的5’RACE PCR产物*CIP反应后的RNA降解产生了新的带有5’磷酸的断裂模板，可以同GeneRacer RNA Oligo连接。一定要小心操作，保证RNA无降解。*CIP脱磷酸不完全，可以增加反应中CIP的量或减少RNA的量。*PCR产生了杂带，并不是真正的连接产物，可以使用上述建议优化PCR。三、PCR在进行PCR时：*请确保您没有使用过量的起始DNA或者过高浓度的引物，也没有加入过量的Mg++*请确保您使用了恰当的退火温度*请确保您没有使用过量的DNA聚合酶四、引物1. 应该选择哪种纯化方法？取决于实验目的和引物的长度2. 为什么我订购了50nmol，但是收到却只有40nmol？50nmol是起始量3. 怎样制备100μM的储液？体积（μl）=质检报告上的nmol数目×104. 怎样设计引物？*一般长度20-30bp；*至少50%的GC含量；*避免引物二聚体和二级结构；*引物对的Tm值应该接近。5. 引物序列有插入或缺失？*使用上游和下游引物多测几个克隆。*请选择正确的纯化方法。6. PCR无结果？*请检查引物设计是否正确；*请检测OD读数是否正确；*做一个阳性对照和一个阴性对照
、操作程序： &&& 1. 将样品等量放置在试管内，并将其对称放入转头； &&& 2. 拧紧转轴螺母，盖好盖门，将仪器接上电源后，实测速度指示灯亮，数码管显示“00000”，表示该仪器已接通电源； &&& 3. 按运转键启动仪器，仪器按出厂所设定的参数工作，数码管显示实际转速和温度；如需制冷，按制冷开关键，温度数码管显示腔内实际温度。 &&& 4.如需调整仪器的运行参数： &&& 1）设定运转时间和运转速度：可按功能键，使相应的指示灯点亮，数码管即显示该参数值，数码管中有一位数字在闪烁，此时可用“ ” 、“ ”及“ ”键相结合调整该参数至需要的值，并按记忆键确认贮存。 &&& 2）设定温度：按制冷功能键，使相应的（上限或下限）指示灯亮，数码管即显示该参数值，数码管中有一位数字在闪烁，此时可用“ ” 、“ ”及“ ”键相结合调整该参数至需要的值，再按一次制冷功能键，退出设定程序。 &&& 5.仪器运行过程中数码管显示转速，当需要查看其他参数时，可按功能键，使该参数的指示灯点亮，数码管即显示该数值。当仪器到达设定的时间或中途停机，停机过程中数码管显示转速，属正常现象。 二、注意事项： &&& 1. 为确保安全和离心效果，仪器必须放置在坚固水平的台面上，工程塑料盖门上不得放置任何物品；样品必须对称放置并在开机前确保已拧紧螺母； &&& 2. 应经常检查转头及实验用离心管是否有裂纹、老化等现象，如有应及时更换； &&& 3. 实验完毕后，需将仪器擦拭干净，以防腐蚀； &&& 4. 如样品比重超过1.2g/cm3，最高转速n=nMax×SQRT（1.2/样品比重）； &&& 5. 机刷长度小于6mm时，必须及时更换； &&& 6.在离心机未停稳的情况下不得打开盖门； &&& 7.仪器必须有可靠接地； &&& 8.该仪器如在电压不稳定地区使用，应增设稳压器，以保证仪器发挥最佳性能。 &&& 9. 插上电源，打开电源开关，仪器控制系统的数码管显示，请按停止键，速度数码管显示OPEN，电子门锁动作，盖门自动微抬，这时可用手打开盖门，如盖门不能自动微抬，3秒钟内必须用手把盖门打开，超过3秒钟电子门锁又自动锁门。若开启盖门，必须按面板上的停止键速度数码管显示OPEN，才能打开盖门。 &&& 10. 如果用户对出厂设定的参数不做任何改动，请将装有等量试液样品的试管对称放入转子孔内，盖好盖门。然后按运转键直接运转。如需改变设定参数，请按面板上的键进行设定并记忆，完毕后按运转键仪器运转。运转结束显示0到OPEN，这时可以打开盖门，如3秒钟内未把门打开，OPEN 变成0，则需按停止键出现OPEN，3秒钟内把门打开。
1、&服务热线:电话010-），提供技术咨询和故障诊断，实时响应； 2、邮件回复& ，对客户提出的问题24小时内进行答复；
日志分类列表加载中...
this.p={b:2};
{if defined('c')&&c.length>0} {list c as x}{/list} {else} 没有日志分类 {/if}
我要留言 & &
& 留言列表加载中...
this.p={b:2,nv:false,cn:5,ct:5};
列表加载中...
this.p={b:2,cn:15};
模块内容加载中...
模块内容加载中...
& & & & & &
网易公司版权所有&&
{list x.l as y}
{/list} {/list}
{if defined('wl')} {list wl as x}{/list} {/if}医学百科提醒您不要相信网上药品邮购信息！
这是一个重定向条目，共享了的内容。为方便阅读，下文中的聚合酶链式反应已经自动替换为PCR，可点此恢复原貌，或使用备注方式展现目录1 拼音聚合酶链式反应 2 英文参考abbr. 聚合酶链反应(=polymerase chain reaction)3 PCR的定义（polymerase chain reaction，聚合酶链式反应）是指由引物选择性体外扩增或片段的。该方法在领域可用于各种分型、配型、输血疾病检测等。是体外酶促合成特异DNA片段的一种，主要由高温、低温和适温延伸三个步骤反复的热构成：即模板DNA先经高温变性为单链，在DNA聚合酶和适宜的温度下，两条引物分别与两条模板DNA链上的一段互补序列退火，接着在DNA聚合酶的催化下以四种脱氧三（dNTPs）为底物，使退火引物得以延伸。如此反复，使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增。
4 聚合酶链反应的历史回顾4.1 核酸体外扩增最早的设想由Khorana及其同事于1971年提出：“经过DNA变 性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重视该过程便可基 因”。但由于当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物，且当时（1970年）Smith等发现了 DNA限制性内切酶，使体外克隆成为可能，所以，使Khorana等的早期设想被人们。4.2 聚合酶链反应的发明直到1985年，美国PE-Cetus公司的人类研究室 Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, 聚合酶链式反应）, 使人们梦寐以求的体外无限扩增片段的愿望成为现实。其原理类似于DNA的体内 ，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适条件。开始是使用 DNA聚合酶Klenow片段来扩增人基因组中的特异片段。由于该酶不耐热，因此，每次 加热变性DNA后都要重新补加Klenow酶。在操作多份时，这一过程耗时，费力， 且易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得聚合酶链式反应更易于自动化，继而PE-Cetus公司推 出了第一台聚合酶链式反应热循环仪，使该技术的自动化成为现实。Mullis等因此项技术于1993年 获得金。5 聚合酶链反应相关技术的发展聚合酶链式反应及其技术的发展速度是惊人的。国际上分别于1988年和1990年在美国和 英国召开了第一届和第二届聚合酶链式反应技术专题研讨会。第一届会议主要讨论了聚合酶链式反应的应用 与技术本身的优化问题；第二届会议的主要议题是与聚合酶链式反应的最新进 展。这充分体现了家对聚合酶链式反应的重视。（表）聚合酶链反应的相关技术名　　　称主要用途简并引物扩增法扩增未知基因片段巢居聚合酶链式反应提高聚合酶链式反应性、，复合聚合酶链式反应同时检测多个突变或病原反向聚合酶链式反应扩增已知序列两侧的未知序列，致产物突变单一特异引物聚合酶链式反应扩增未知基因组DNA单侧引物聚合酶链式反应通过已知序列扩增未知锚定聚合酶链式反应分析具备不同末端的序列增效聚合酶链式反应减少引物二聚体，提高聚合酶链式反应特异性固着聚合酶链式反应有利于产物的膜结合聚合酶链式反应去的杂质或聚合酶链式反应产物残留表达盒聚合酶链式反应产生合成或突变的DNA片段连接介导聚合酶链式反应分析、突变和克隆等RACE-聚合酶链式反应扩增cDNA末端定量聚合酶链式反应定量或基因原位聚合酶链式反应研究表达基因的比例等臆断聚合酶链式反应或遗传通用引物聚合酶链式反应扩增相关基因或检测相关病原信使扩增表型分型（mapping）同时分析少量细胞的mRNA
6 其它扩增技术与聚合酶链式反应及其相关技术发展的同时，新的扩增技术也不断诞生。这些技术各有利 弊，与聚合酶链式反应互为补充，有的可结合应用，共同构成了核酸体外扩增技术的大家族。我 们相信，随着分子生物学技术的发展，这一家族一定会再涌现出新成员。其它体外核酸扩增技术（表）技术应用依赖的扩增（TAS）检测HIV连接酶链反应（LCR）检测点突变自主序列复制（3SR）系统研究RNA，临床应用、等链替代扩增（）检测、鉴定基因Qβ复制酶系统增加探针检测敏感性循环探针反应增加探针检测敏感性6.1 连接酶链反应 （A）连接酶链反应（Ligase　chain　reaction，LCR）,是一种新的DNA体外扩增和检测 技术,主要用于点突变的研究及靶基因的扩增。是Backman　1997年为检出靶基因序列 中的点突变而设计发明，并申报了专利。LCR的基本原理为利用DNA连接酶。特异地将双链DNA片段连接,经变性-退火-连 接三步骤反复循环,从而使靶基因序列大量扩增。LCR的扩增效率与聚合酶链式反应相当，用耐热连接酶做LCR只用两个温度循环，94℃min变性 和65℃复性并连接，循环30次左右。其产物的检测也较方便灵敏。目前该方法主要用 点突变的研究与检测、病原体的检测及定向诱变等，还可用于单遗传病多 态性及单碱基遗传病的产物诊断，微生物的种型鉴定，的点突变研究等。6.2 依赖核酸序列的扩增 （A）依赖核酸序列的扩增（Nucleic　acid　sequence-based　amplification,NASBA） ，又称自主序列复制系统（self-sustained　sequence　replication，3SR）或长 序列复制技术。1990年Guatelli等首先报道了这一技术。NASBA主要用于RNA的扩增、检测及测序。其基本方法为：将引物,标本加入扩增反应液，65℃1min使RNA二级打 开,降温至37℃加入,T7RNA聚合酶和RNase　H,并在37℃反应1～1.5小时,其 产物经糖，溴乙锭染色即可在紫外仪下看到条带。NASBA的特点为操作简便，不需特殊仪器，不需温度循环。整个反应过程由三种 酶，循环次数少，忠实性高,其扩增效率高于聚合酶链式反应，特异性好。
6.3 转录依赖的扩增系统 （A）转录依赖的扩增系统（Tran-based　amplification　sytem，TAS），是 Kwen等人于1989年研究报道的，主要用于扩增RNA。TAS的主要特点是扩增效率高，因为其RNA拷贝数呈10的指数方式增加，只需6个 循环靶序列的拷贝数就能达到2×106。它的另一个特点是特异性高，由于TAS只能进行 6次温度循环，错掺率低，加之用珠夹心杂交，因而特异性也高。虽然本法有较高的特异性和敏感性，但其循环过程复杂，需重复加入逆转录酶和 T7RNA多聚酶，有待进一步研究。6.4 Qβ复制酶反应 （A）Kacian等于1972年首次报报Qβ复制酶（Q-beta　replicase）催化RNA模板的 复制，它能在常温30min，将其天然模板MDV-1RNA扩增至109。1986年Chu等报道 用生物标记的靶序列特异性探针，可与亲和素联接的MDV-1RNA杂交，经未被结合 的MDV-1后，再加入Qβ复制酶，扩增复制MDV-1拷贝，用溴乙锭染色检测或用同 源性的第二探针杂交。Qβ复制酶是一种RNA指导的RNA聚合酶，它有3个特点：①不需寡核苷酸引物的引 导就可启动RNA的合成。②能特异地识别RNA基因中由于分子内而形成的特有 的RNA折叠结构。③在Q　β复制酶的天然模板MDV-1　RNA的非折叠结构区插入一短的 核酸序列不影响该酶的复制。　因而，如在此区插入核酸探针，则其序列照样可能被 Qβ复制酶扩增。1988年Lizardi等，将靶基因序列插进MDV-1里，用T7　RNA聚合酶催化转录 出MDV-1　RNA探针，这种RNA探针可与靶序列杂交，然后洗去非杂交的探针,加入Qβ 复制酶来扩增探针，被扩增的探针又可作为模板进行扩增，并呈指数递增。其产物 按上述两种方法进行检测。现在该技术又发展了夹心杂交法，分子开关和靶依赖的复 制等技术。
7 聚合酶链式反应技术的应用举例：研究：；DNA测序；分析突变；与融合；鉴定与调控蛋白质结 合DNA序列；插入的绘图；检测基因的修饰；合成基因的构建；构建克隆 或表达；检测某基因的内切酶多态性诊断：细菌（、支原体、、分支、、、致 肠杆菌、杆菌、嗜单胞菌和艰难梭菌等）；（HTLV、HIV、、 HPVS、EV、CMV、、HSV，、轮状病毒、B19）；（ 等）；人遗传病（Lesh-Nyhan、地贫、、、DMD、等）：分裂；或多样化的；基因作图；定量人类基因组工程：用散布产生DNA标志；的构建（检测DNA、 多态性或绘图）；的构建；测序，表达图谱法医：犯罪现场标本分析；HLA-：、、、、、和生物学：遗传聚类研究；动物保护研究；；；实验遗 传学。古生物学：考古与博物馆标本分析动物学：动物的诊断等植物学：检测植物病原等8 聚合酶链式反应的基本原理和概念8.1 基本原理DNA在细胞中的复制是—个复杂的过程。参与复制的基本因素有：DNA聚合酶、DNA连接酶、DNA模板、由引发酶合成的RNA引物、核苷酸原料、无机、合适的pH、以及解开DNA的超螺旋及双螺旋等结构的若干酶与蛋白质因子等。聚合酶链式反应是在试管中进行反应，基本原理与体内，不同之处是耐热的Taq酶取代DNA聚合酶，用合成的DNA引物替代RNA引物，用加热（变性）、冷却（退火、保温（延伸）等改变温度的办法使DNA得以复制，反复进行变性、退火、延伸循环，就可使DNA无限扩增。聚合酶链式反应的具体过程如下：将聚合酶链式反应反应体系升温至95℃左右，双链的DNA模板就解开成两条单链，此过程为变性。然后将温度降至引物的Km值以下，3'端与5'端的引物各自与两条模板的互补区域结合，此过程称为退火。当将反应体系的温度升至70℃左右时，耐热的催化四种按照模板DNA的核苷酸序列的互补方式依次加至引物的3'端，形成新生的DNA链。每一次循环使反应体系中的DNA分子数增加约一倍。理论上循环几次，就增加为2^n倍。当经30次循环后，DNA产量达2^30拷贝，约为10^9个拷贝。聚合酶链式反应扩增过程见图8-1。由于实际上扩增效率达不到2倍，因而应为（1+R）^n，R为扩增效率。
8.2 参与聚合酶链式反应反应体系的因素及其作用参与聚合酶链式反应反应的因素主要包括模板核酸、引物、TaqDNA聚合酶、、Mg2+、三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）、反应温度与循环次数、聚合酶链式反应仪等。现对它们的作用介绍如下：（一）模板核酸用于聚合酶链式反应的模板核酸可以是DNA，也可以是RNA。当用RNA作模板时，首先要进行反转录生成cDNA，然后再进行正常的聚合酶链式反应循环。核酸模板来源广泛，可以从培养细胞、细菌、病毒、组织、病理标本、考古标本等中提取。聚合酶链式反应加入的DNA模板量一般为100-100000拷贝，现在的技术水平已能从单个细胞制备出相应的cDNA文库。DNA模板含量合适，可以减少聚合酶链式反应多次循环带来的碱基错配。通板DNA用DNA分子，若为环状质粒，最好先用酶将其切开成线状分子，因为环状太快。（二）引物引物决定聚合酶链式反应扩增产物的特异性与长度。因此，引物设计决定聚合酶链式反应反应的成败。聚合酶链式反应反应中有两种引物，即5'端引物与3'端引物。5'端引物是指与模板5'端序列相同的寡核苷酸，3'端引物是指与模板3'端序列互补的寡核苷酸。对引物的基本要求有：①引物的长度过短会影响聚合酶链式反应的特异性，要求有16-30bp，因为4^16=4.29x10^9，已大于哺乳动物基因组3x10^9bp，保证了特异性结合；引物过长使延伸温度超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74度），亦会影响产物的特异性。②G+C的含量一般为40％-60％。③四种碱基应，不要有连续3个以上的相同嘌吟或嘧啶存在。尤其是引物3'端，不应有连续3个G或c，否则会使引物与核酸的G或c富集区错误互补，而影响聚合酶链式反应的特异性。④引物自身不应存在互补序列而引起自身折叠，起码引物自身连续互补碱基不能大于3bp。⑤两引物之间不应互补，尤其是它们的3'端不应互补。一对引物之间不应多于4个连续碱基有，以免产生引物二聚体。④引物与非特异靶区之间的性不要超过70％或有连续8个互补碱基同源，否则导致非特异性扩增。①引物3'端是引发延伸的点。因此不应错配。由于ATCG引起错配有一定规律，以引物3'端A影响最大，因此，尽量避免在引物3'端第一位碱基是A。引物3'端也不要是密码子的第三个碱基，以免因为密码子第3位简并性而影响扩增特异性。⑧引物5'端可以修饰，包括加酶切位点，用、物质、等标记，引入突变位点，引入序列，引入蛋白质结合DNA序列等，引物的设计最好以电脑进行指导。反应体系中，引物浓度一般要求在O.1-0.5μmol之间。浓度太高，容易生成引物二聚体，或非特异性产物。引物Tm值与退火温度有关，计算公式为：Tm=4（G+C）+2（A+T）。引物Tm值最好在55-80℃范围，以接近72℃为最好。（三）耐热的TaqDNA聚合酶1976年Chien分离出热聚合酶，1986年Erlich分离并纯化了适于聚合酶链式反应的Tq热稳定性聚合酶，为聚合酶链式反应成为实用技术奠定了基础，现已用基因重组生产。日前可用于聚合酶链式反应的聚合酶有多种：有从水生栖热菌中提取的Taq酶、从嗜热栖热苗中获得的Taq酶、从Litoralis栖热中分离的VENT酶、及从酸热浴硫化苗中分离的Sac酶，而以Taq酶用得最广泛。Taq DNA聚合酶分子量为94kD，75℃时酶比活性为150bs/酶分子，反应温度过高或过低均影响其延伸率，Taq蕾有很高的耐热稳定性。实验表明，在92.5℃、95℃、97.5℃时，其分别为40min、30min和5min。纯化的Taq酶在体外无3'-5'外切，因而无校正阅读功能，在扩增过程可引起错配。错配碱基的数量受温度、Mg2+浓度和循环次数的影响。通常，30次循环Taq酶的错配率约为0.25％，高于Klenow酶的错配率。Taq酶在每一次循环中产生的移码为1/30000，碱基替换率为1/8000。应用低浓度的dNTP（各20μmol／L）、1.5mmol/L的Mg2+浓度、高于55℃的复性温度，可提高Taq酶的忠实性，此时的平均错配率仅为5x10^-6次/（核苷酸*循环）。Taq酶具有类似于末端的TdT的活性，可在新生成的双链产物的3'端加上—个碱基，尤其是dATP最容易加上。因此，欲将聚合酶链式反应产物克隆到载体上，可以用两种处理办法：一是构建dT-载体；二是用Klenow酶将3'端的A去掉，即在聚合酶链式反应反应后，先在99℃加热10minTaq酶，调整Mg2+浓度至5-10mmol/L，加入1-2U Klenow片段，室作用15-20min，3'端的A即被切去，Taq酶还具有反转录活性。在2-3mmol/L Mg2+浓度下68℃时出现类似的活性。若有Mg2+存在，则反转录活性更佳，利用这一活性，可直接用于RNA-聚合酶链式反应，尤其是短片段的扩增。以往用Taq酶进行聚合酶链式反应扩增，一般只能扩增小于400bp的DNA片段，经过对酶的结构与功能的改造，以及聚合酶链式反应方法学的改进，现已能扩增20kb以上的DNA分于。Taq酶在聚合酶链式反应反应中加入的量也很重要，太少当然不好，太多一方面浪费，同时也导致非特异性扩增，通常每lOOμl反应液中含1-2.5U Taq酶为好。最好在0.5-5U范围内确定最佳酶浓度。另一个问题是，虽然Taq酶是热稳定性较好的，也应在-20℃贮存。（四）缓冲液缓冲液提供聚合酶链式反应反应合适的酸碱度与某些离子，常用10-50mmol/L。Tris-HCI（pH8.3-8.8）缓冲液。缓冲液中含有50mmol/L KCl有利于引物的退火。有人并加入小清（100μg/L）或（0.0％）或Twen20（0.05％-0.1％）或二硫基苏（，5mmol/L）等，认为这些物质可以保护Taq酶。（五）Mg2+Taq酶的活性Mg2+。Mg2+浓度过低，Taq显暑降低；Mg2+浓度过高，又使酶催化非特异性扩增。Mg2+浓度还影响引物的退火、模板与聚合酶链式反应产物的解链温度、引物二聚体的生成等。Taq酶的活性只与游离的Mg2+浓度有关，而聚合酶链式反应反应体系中，dNTP、引物、DNA模板等中的所有磷酸基团均可与Mg2+结合而降低Mg2+的游离浓度。因此，Mg2+的总量应比dNTP的浓度高0.2-0.25mmol/L。如果反应体系中含有EDTA等螯，也可结合掉一部分Mg2+。为了获得Mg2+的最佳浓度，可用下面的优化法。首先在聚合酶链式反应缓冲液小不加入Mg2+，从配置的10mmol/L的Mg2+储存液中取一定量加入到各反应管中，开始以0.5mmol/L的浓度梯度递增（0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,……5.0mmol/L），由聚合酶链式反应反应后的电泳结果可确定Mg2+大概浓度范围，再在该浓度的上下以0.2mmol/L递增与递减几个浓度来精确确定Mg2+最适浓度。（六）dNTPdNTP为聚合酶链式反应反应的合成原料。每种dNTP浓度应相等，通常的浓度范围为20-200gmol/L，在此范围内，聚合酶链式反应产物的量、反应的特异性与忠实性之间的最佳。例如，当每种dNTP为20μmol/L时，理论上可以产生2.6μg的400bp的DNA。使四种dNTP的浓度在其Km值（10-15μmol/L）以上，可保持碱基掺入的忠实性；若dNTP的浓度大于50mmol/L，则可Taq酶的活性。（七）反应温度和循环次数1．变性温度与时间聚合酶链式反应反应中变性这一步很重要，若不能使模板DNA和聚合酶链式反应产物完全变性，聚合酶链式反应反应就不能成功，DNA分子中G+C含量愈多，要求的变性温度愈高。太高的变性温度和时间又会影响Taq酶的活性，通常的变性温度和时间分别为95℃、30s，有时用97℃、15s。虽然DNA链在变性温度时两链分离只需几秒钟，但反应管内部达到所需温度还需要一定的时间，团此要适当延长时间。为了保证模板DNA能彻底变性．最好为7-10min，然后在以后的循环中，将变性步骤设为95℃/min。扩增100-300bp短片段时，还呵以用快速的两步聚合酶链式反应法，即变性（94-97℃）、退火及延长（55-75℃）。为防止在变性温度时反应液的，可在反应管内加入1-2滴。2．复性温度和时间复性温度决定聚合酶链式反应的特异性，合适的复性温度应低于引物Tm值的5℃。退火温度过低，引起非特异性扩增；增高退火温度，可提高扩增的特异性，因此要严格退火温度。退火一般为1min。在聚合酶链式反应开始的头一次循环时，反应从远低于Tm值的温度开温，由于Taq酶在低温时仍具有活性，这时就可能因引物与模板非特异性配对面出现非特异性产物或出现引物二聚体 然后在以后整个聚合酶链式反应反应中，非特异性产物反复扩增，而使聚合酶链式反应严重失败。为了尽量消除这种非特异性扩增，可以使用热起动的方式，热起动方法有几种：一种方法是在聚合酶链式反应系统中加入抗Taq酶抗体。抗体与Taq酶结合，使Taq酶活性受抑制。因此在开始时，虽然温度低，引物可与与模板错配，但因Taq酶没有活性，不会引起非特异性扩增；当进行热变性时，抗体在高温时失活，Taq酶被释放，就可发挥作用，在以后的延伸步骤进行特异的DNA。另一种热起是用将Taq酶与聚合酶链式反应反应系统分隔，因此一开始在室温条件下也没有非特异性扩增。当升温到热变性温度下，石蜡熔化，Taq酶与聚合酶链式反应反面系统混合，从而在以后的步骤中发挥作用。使用热起动可以提高聚合酶链式反应扩增的特异性。3．延伸温度与时间延伸温度一般为72℃左右，此时Taq酶活性为每秒钟掺入核苷酸35-100个，2kb的片段用1min已足够，若DNA片段较长，扩增时间可适当延长。延伸时间过长又可引起非特异性扩增。4．循环次数循环次数主要取决于最初靶分子的浓度，例如在初始靶分子为3x10^5、1.5x10^4、1x10^3和50拷贝数时，循环数可分别为25-30、30-35、35-40从40-45。过多的循环次数会增加非特异性产物量及碱基错配数。聚合酶链式反应反应，扩增产物的增加并不成为指数方式，称为平台。平台效应可能与下列因素有关：dNTP与引物浓度降低，酶对模板的比例相对降低，多次循环后酶活力降低，产物浓度增高后变性不完全而影响引物延伸。（八）聚合酶链式反应仪有多种进口与国产聚合酶链式反应仪。仪器的升降温方式可有加温、水加温及电热块加温等。温度、循环次数及时间等参数现多用电脑控制。可根据需要选择仪器。由于聚合酶链式反应方法高度灵敏，少量的靶分子即可扩增至无限数。因此要防止聚合酶链式反应扩增产物环境而引起以后的聚合酶链式反应。为此，应将聚合酶链式反应仪及聚合酶链式反应产物检测等过程与标本制备及聚合酶链式反应反应管的制备尽量在空间分开，最好在不同的房间进行。通常可将实验空间分为标本处理区、反应混合制备和聚合酶链式反应扩增区、产物分析区等。
9 PCR检查PCR是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。聚合酶链式反应技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。9.1 PCR正常值体内菌群的种类和比例正常，处于动态平衡健康状态。9.2 PCR临床意义聚合酶链式反应能快速特异扩增任何已知或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，聚合酶链式反应技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。异常结果： 各种疾病所致的异常，例如。①。即硬 ，2～4周，部位发生暗红色硬 、浅 ，有软骨样，周围肿大。②。在一期梅毒 1～2 个月之后，全身、粘膜发生对称泛发皮疹、、、疹等。粘膜可发生粘膜斑、扁平湿疣，性强。③。发生在后2～3年乃至10年，皮肤为样肿，还可涉及骨、、心、，表现为主、和等，侵及为痨 ，全身 （
）等等。需要的人群：疑似某种特定的疾病病人，进行分子特异性检查。10 参考资料 [1] 中华人民共和国卫生部.WS/T 203—2001 输血医学常用术语[Z].. [2] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.WS/T 455—2014 卫生监测与评价名词术语[Z]..相关文献浏览本页的人还关注了以下词条:
参与评价： ()
欢迎您对PCR进行讨论。您发表的观点可以包括咨询、探讨、质疑、材料补充等学术性的内容。我们不欢迎的内容包括政治话题、广告、垃圾链接等。请您参与讨论时遵守中国相关法律法规。 抱歉，功能升级中，暂停讨论
特别提示：本文内容为开放式编辑模式，仅供初步参考，难免存在疏漏、错误等情况，请您核实后再引用。对于用药、诊疗等医学专业内容，建议您直接咨询医生，以免错误用药或延误病情，本站内容不构成对您的任何建议、指导。
本页最后修订于 日 星期五 20:28:47 (GMT+08:00)
关于医学百科 | 隐私政策 | 免责声明
链接及网站事务请与Email:联系
编辑QQ群：8511895 （不接受疾病咨询）