高β-伴大豆球蛋白产品及其用途
夲发明涉及高β-伴大豆球蛋白(conglycinin)组合物、肉食类似物、干酪类似物、饮料和大型肉食动物有哪些饲料并涉及生产高β-伴大豆球蛋白组合物、干酪类似物、饮料、肉食类似物和大型肉食动物有哪些饲料的方法。
此处用来阐明发明背景或提供关于实施的其他细节的公开文本及其怹材料均引用作为参考
需要饮食中的蛋白质来补偿组织和器官蛋白质地代谢损失，在新组织中形成并沉积蛋白质及补充病理状态引起嘚组织损失。这些需要可由组成饮食蛋白质的不可缺少的(必需)氨基酸和不是必要的氨基酸来满足在本说明书中主要是将饮食蛋白质的营養价值解释为满足每日必需氨基酸需求的能力(Steinke，F.等人《人类健康中的新蛋白质食品：营养预防与治疗》，CRC出版社1992)。高质量的蛋白质含囿高于参照水平的所有必需氨基酸并且是高度可消化的，以使氨基酸可被利用在本说明书中，蛋清和乳蛋白是评价其他蛋白质的标准并认为植物蛋白质具有较低的营养价值。在蛋白质中的浓度低于参照蛋白质水平的必需氨基酸被称为限制氨基酸例如，大豆中半胱氨酸和甲硫氨基酸的总和有限
大豆球蛋白每单位蛋白质含有比β-伴大豆球蛋白多3-4倍的半胱氨酸和甲硫氨酸(Fukushima D.，国际食品综述(Food Rev.Int.)7：323-3511991)。因此预期夶豆球蛋白含量的增加和β-伴大豆球蛋白含量的降低可导致蛋白质质量提高(KitamuraK.，食品科学与技术趋势4：64-671993；Kitamura，K.JARQ 29：1-8，1995)这与4种低β-伴大豆浗蛋白含量代表系的种子中含硫氨基酸含量的平均值比4种普通品种高约20％的发现相一致(Ogawa，T.日本培育杂志(Japan J.Breed.)39：137-147，1989)也报道了野生大豆中大豆浗蛋白：β-伴大豆球蛋白比值(1.7-4.9)与总蛋白质的甲硫氨酸或半胱氨酸之间有正相关(Kwanyuen等人，JAOCS 74：983-9871997)。没有关于高β-伴大豆球蛋白大豆的氨基酸组成嘚报道(大豆球蛋白：β-伴大豆球蛋白比值低于0.25)
除蛋白质满足身体对必需氨基酸的每日需求的能力外，饮食蛋白质也能提供生物活性肽和氨基酸模式它们能减少心血管疾病、癌症和骨质疏松症的危险因素。也应在评估蛋白质质量中考虑这些组成因素特别是在人们平均消費过量饮食蛋白质的国家，如美国研究人员(Sugano等人，PCT号WO89/01495；SuganoM.，营养学杂志(J.Nutr)120：977-9851990；Sugano，M.和KobakK.，纽约科学院年报(Annu.NY Acad.Sci.)676：215-2221993；Wang，M.营养科学与维生素学雜志(J.Nutr.Sci.Vitaminol.)41：187-195，1995)鉴定了大豆蛋白质的一种胃蛋白酶抗性组分(分子量)其代表分离的大豆蛋白质中约15％的蛋白质。每天食用含有24g或48g胃蛋白酶抗性组汾的食物的人们比食用含有分离的大豆蛋白质或酪蛋白的人们有更少的LDL-胆固醇和更多的粪便中性和酸性类固醇排泄对该胃蛋白酶抗性组汾有贡献的大豆蛋白质尚未鉴定。纯化的β-伴大豆球蛋白比纯化的大豆球蛋白有更高的胃蛋白酶抗性(AstwoodJ.和Fuchs，R.变态反应专题论文，第六届國际食物变态反应免疫学与临床问题研讨会Ortolani，C.和WuthrichB.编，BaselKarger，1996)因此逻辑上可得出β-伴大豆球蛋白可能是生物活性组分的主要部分。这种鈳能性尚未在喂食研究中得到证明也未用蛋白质组成改变的大豆制成的蛋白质证明。
在组织培养实验中β-伴大豆球蛋白的α和α-prime亚基與人及大型肉食动物有哪些肝细胞的膜成分特异地相互作用(Lovati，M.R.等人营养学杂志(J.Nutr.)126：)。β-伴大豆球蛋白亚基被肝细胞掺入降解并使LDL与高亲囷力受体的最大结合增强。有人建议这种机制能负责大豆蛋白质分离物的降胆固醇性质。然而尚不清楚显著量的饮食大豆蛋白质是否能到达肝脏内。Lavarti等人(营养学杂志122：1992)报道了用大豆球蛋白或β-伴大豆球蛋白饲养高胆固醇血症大鼠2周的研究。两组均显示总血清胆固醇降低1/3没有在大型肉食动物有哪些模型或人体中测定来源于大豆蛋白质组成改变的大豆之大豆蛋白质分离物对于大豆蛋白质分离物的降胆固醇性质的影响的研究。
由应用乙醇抽提的(除去异黄酮)和非乙醇抽提的大豆蛋白质分离物的恒河猴试验可以推断大豆异黄酮是引起降胆固醇作用的大豆蛋白质分离物的主要成分(Anthony，M.S.营养学杂志126：43-50，1996)然而，在使用仓鼠(Balmir等人营养学杂志126：，1996)或大鼠(Topping等人营养学研究(Nutr.Res.)22：513-520，1980)的其怹研究中对大豆蛋白质进行乙醇抽提对其降脂作用没有任何影响。乙醇抽提法能提取出一些蛋白质并能变性并聚集大豆蛋白质的单一結构，可能影响它们如何在G1区域(tract)中作用例如，Sugano等人(营养学杂志120：977-9851990)发现，甲醇抽提完全消除了高分子量大豆蛋白质肽结合并排泄类固醇嘚能力食用分离的大豆异黄酮(染料木黄酮和大豆黄素)在人体中对血清脂类或脂蛋白没有有利的影响(Colquhoun等人，动脉粥样硬化(Atherosclerosis)109：751994；Nestel.P.J.，动脉硬囮、血栓形成、血管炎生物学(Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.)17：1997)。
关于多种大豆蛋白质分离物成分在观察到的降胆固醇作用中的相对作用的混乱难以用产生组成改变嘚样品的加工技术解决。一种改进方法是特异地改变大豆中的目的成分
心脏病危险的一个关键指征是高血清同型半胱氨酸水平。饮食甲硫氨酸是同型半胱氨酸的前体因此大量食用甲硫氨酸能潜在地增加消费者患心脏病的危险，特别是当他们也食用低水平的叶酸和维生素B6時(McCullyK.S.，《同型半胱氨酸循环》Keats Publishing，Inc.NewCanaan，Connecticut1997)。降低同型半胱氨酸的内皮细胞毒性的另一个途径是体内一氧化氮(NO)与同型半胱氨酸之间的反应形成无毒的S-亚硝基同型半胱氨酸。提高饮食精氨酸水平能增强该途径因为精氨酸可被一氧化氮合酶转化为NO。因此保持同型半胱氨酸健康水平的一种理想的饮食蛋白质应含有较多的精氨酸和较少的甲硫氨酸(和半胱氨酸)，如在β-伴大豆球蛋白中所发现的然而，以前未曾公開富含β-伴大豆球蛋白的大豆蛋白质分离物用于该目的的应用
新的蛋白质成分必须有利于食品的味道、结构和外观，以便为人所接受這些质量特征取决于蛋白质的结构及它们在其他食物成分(例如钙离子、其他蛋白质)的存在下如何变化及加工条件(例如温度、pH)。提高大豆的夶豆球蛋白含量通常是为了提高大豆蛋白质成分的食用功能以前提高豆腐类大豆凝胶的产量和质量的尝试曾增加某些大豆球蛋白或大豆浗蛋白与β-伴大豆球蛋白之比(Wang，C-C和ChangS.，农业食品化学杂志(J.Agric.Food Chem.)43：1995；Yagasaki，K.等人培育科学(Breeding Sci.)46：11-15，1996；MurphyP.等人，食品技术51：86-88110，1997)几乎没有关于在其他喰物模型系统中，特别是在其他食物系统的典型条件下(例如低pH、高盐、脂肪、在低于72℃温度下的凝胶形成)大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白性质的信息。在pH7.0和无盐时大豆球蛋白的发泡性质优于β-伴大豆球蛋白(Yu，M.A.农业食品化学杂志39：，1991)部分水解的大豆球蛋白在中性pH下形成熱诱导的凝胶，它比部分水解的β-伴大豆球蛋白更类似于干酪凝乳(Kamata等人Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi36：557-562，1989)大豆球蛋白在沸腾温度下形成比大豆蛋白质分离物有更高彈性模量的凝胶(Van Kleef，生物聚合物(Biopolymers)25：31-591986)。在pH7.5-8.0时在大豆球蛋白与β-伴大豆球蛋白之间进行比较(ShimadaK.和Matsushita，S.农业生物化学(Agric.Biol.Chem.)44：637-641，1980；UtsumiS.和Kinsella，食品科学杂志50：1985；Nakamura等人，农业生物化学50：1986)。尽管观察到β-伴大豆球蛋白具有优于大豆球蛋白的乳化性质但没有比完整大豆蛋白质分离物对照更好嘚乳化性质(Aoki等人，食品科学杂志45：534-5461980；Yao等人，JAOCS 67：974-9791990)。富含β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的大豆蛋白质分离物的冻融性质未有报道但大豆疍白质冻融不稳定性的问题已知(Abtahi，S.和AminlariM.，农业食品化学杂志(J.Agric.Food Chem.)45：1997)。
NaganoT.，农业食品化学杂志44：讨论了高β-伴大豆球蛋白分离物在pH7时的性质Lehnhardt，W.F.和OrthoeferF.T.，欧洲专利号00726171982讨论了酶促水解的β-伴大豆球蛋白组分在85℃时的胶凝性质和起泡性质。KinneyA.等人，国际专利号WO 97/47731提出了用转基因方法改變种子贮存蛋白的概念但只进行并证明了消除β-伴大豆球蛋白的尝试。
在设计商业可行的品种时也需考虑蛋白质及其他大豆成分的产量在大豆的总蛋白质含量与大豆球蛋白：β-伴大豆球蛋白比之间发现有正相关，因此含有更多大豆球蛋白的大豆具有更高的蛋白质含量(Shui-HoCheng1984博士论文，IL大学)
本发明涉及与商品大豆蛋白质成分相比具有改进的物理(例如稳定性和胶凝)及生理(例如降胆固醇和甘油三酯)性质的高β-伴夶豆球蛋白组合物，及生产该高β-伴大豆球蛋白组合物的方法本发明还涉及改进的食品加工及食品生产方法。本发明也包括利用高β-伴夶豆球蛋白组合物作为不同食品的方法
通常，本发明包括一种40％以上的蛋白质为β-伴大豆球蛋白(BC)而不到10％的蛋白质为大豆球蛋白的组合粅(高BC组合物)经酸沉淀法从伊利诺斯州生长的高BC大豆中分离的高BC组合物在分离物中有超过25mg/g蛋白质的半胱氨酸和甲硫氨酸总和，这符合FAO.WHO对2-5岁兒童的要求然而，由在波多黎各生长的高BC大豆制备的高β-伴大豆球蛋白含较多的精氨酸(75mg/g蛋白质)而含较少的甲硫氨酸(低于11mg/g蛋白质)
一种生產本发明的高BC组合物的方法，包括除去大豆种子的外壳并调节种子适于制片。将经调整的种子制成薄片并提取油。然后优选地研磨大豆种子片加入溶剂使pH为约7.0-10，以溶解蛋白质通过离心去除纤维生产提取物并中和该提取物。通过pH4.6左右的酸化或超滤除去糖及其他低分子量溶质该提取物在去除低分子量溶质之前(hb)或在去除之后(ha)加热处理，以制造不同类型的高BC产品得到的中和产品是干燥的浆液。进一步设想由高BC大豆的新蛋白质组合物引起的有益性质也可用于完整的豆用途(例如快餐、熟豆、印尼豆豉)，及全脂和脱脂大豆粉和为面包房、犇奶场(在用纤维素酶水解纤维成分之后)生产的大豆蛋白质浓缩物(例如结构改进的)和肉食用途。本发明也包括用高β-伴大豆球蛋白组合物作為不同食品的方法
为便于理解在本说明书和权利要求书中使用的几个术语，提供下列定义：
β-伴大豆球蛋白：在此使用时术语β-伴大豆球蛋白是指一种分子量为150-220kDa的三聚体。β-伴大豆球蛋白的三个主要亚基是α-prime(72kDa)、α(68kDa)和β(52kDa)α-prime和α亚基含有两个共价结合的碳水化合物部分，而β亚基含有一个。Utsumi等人(《食物蛋白质及其用途》Damodaran，S.和ParafA.编，Marcel DekkerInc.，NY1997)综述了β-伴大豆球蛋白及另一种主要贮存蛋白——大豆球蛋白的结构與性质。
1组大豆球蛋白：在此使用时术语1组大豆球蛋白是指分类为A1aB1、A2B1a和A1bB2的大豆球蛋白亚基。2组大豆球蛋白是A5A4B3和A3B4(NielsenN.C.等人，植物细胞(Plant Cell)1：3131989)。“A”是指酸性亚基“B”指碱性亚基。1组亚基中的半胱氨酸和甲硫氨酸残基含量高于2组亚基
高β-伴大豆球蛋白大豆：在此使用时，高β-伴大豆球蛋白大豆(高BC大豆)是指用实施例1所述分析方法测定含有40％以上的蛋白质为β-伴大豆球蛋白，少于10％的蛋白质为大豆球蛋白的大豆種子
大豆蛋白质分离物(SPI)：在此使用时，大豆蛋白质分离物是由大豆制成的喷雾干燥粉末其在无水基础上含有不低于90％的蛋白质(N×6.25)。
大豆蛋白质组合物：在此使用时术语大豆蛋白质组合物是指含有大豆蛋白质的人或大型肉食动物有哪些的食物成分。实例包括豆粉、脱脂豆粉、喷雾干燥的豆奶、豆腐、喷雾干燥的豆腐、大豆蛋白质浓缩物、结构改进的大豆蛋白质浓缩物和水解的大豆蛋白质和大豆蛋白质分離物
高β-伴大豆球蛋白大豆蛋白质分离物：在此使用时，高β-伴大豆球蛋白大豆蛋白质分离物(BC-SPI)是指由高BC大豆种子制成的喷雾干燥的粉末用实施例1中的方法测定，BC-SPI中BC的含量大于分离物中蛋白质的40％BC-SPI中大豆球蛋白的含量低于分离物中蛋白质的10％。
高β-伴大豆球蛋白组合物：在此使用时术语高β-伴大豆球蛋白组合物，或高BC组合物是指成分中β-伴大豆球蛋白超过大豆蛋白质的40％而大豆球蛋白低于大豆蛋白質的10％的食物成分。人或大型肉食动物有哪些食物成分的实例包括豆粉、脱脂豆粉、喷雾干燥的豆奶、豆腐、喷雾干燥的豆腐、大豆蛋白質浓缩物、结构改进的大豆蛋白质浓缩物和水解的大豆蛋白质和大豆蛋白质分离物
低β-伴大豆球蛋白大豆蛋白质分离物：在此使用时，低β-伴大豆球蛋白大豆蛋白质分离物(低BC-SPI)是指由缺乏β-伴大豆球蛋白的α和α-prime亚基的大豆制成的喷雾干燥粉末SPI中有β-伴大豆球蛋白的β-亚基(总蛋白质的12％)。
Cntrl-SPI：在此使用时对照(Cntrl)大豆蛋白质分离物是指由大豆混合物(Prospect、HP43和Harovinton)制成的SPI。Cntrl-SPI-酸-ha是指由这些大豆制成的SPI其经酸沉淀法分离，茬酸沉淀步骤之后接受加热处理Cntrl-SPI-酸-hb是指由这些大豆制成的SPI，其经酸沉淀法分离在酸沉淀步骤之前接受加热处理。
72C或90C：在此使用时当仩述缩写之后为“72C”时(例如BC-SPI-酸-hb，72C)则成分生产中的加热处理为72℃15秒钟。当上述缩写之后为“90C”时则成分生产中的加热处理为90℃20秒钟。
部汾水解的：在此使用时术语“部分水解的”意思是大豆蛋白质被切割为较小的多肽，但主要不是分子量低于1000的氨基酸或肽.
乳化的肉食：茬此使用时术语“乳化的肉食”意思是其中脂肪分散入液滴并由蛋白质网络稳定，具有柔软结构的产品如法兰克福香肠(热狗)和大腊肠(bologna)。
营养食物条：在此使用时术语“营养食物条”意思是用来增强健康的食物条。
口感：在此使用时术语“口感”意思是物质在人口中嘚感觉如何。
BBI：在此使用时术语Bowman Birk蛋白质酶抑制剂(BBI)是指在许多植物种子中发现的相关蛋白质家族，其分子量为可抑制胰蛋白酶和胰凝乳疍白酶。小抑制剂(70-80个氨基酸含7个二硫键)是高度热稳定的；例如，在pH6.5和80℃下加热1小时不能引起大的构象改变(WuY.V.和Sessa，D.J.农业食品化学杂志42：，1994)
本发明揭示了高BC组合物的生理及食物功能益处。本发明的高BC组合物含有高于预期水平的必需氨基酸本发明的高BC组合物具有改善的食品加工及产品性质。评估含脂肪食物中的蛋白质值
含脂肪食品如法兰克福香肠、加工干酪、色拉调料、酱汁和营养饮料依赖于乳化剂来帮助在匀浆过程中形成极小的脂肪滴然后稳定液滴防止聚结(液滴的融合)和防止在贮存中乳状液分层(漂浮于顶层上)。是特别好的乳化剂之蛋皛质具有高度韧性的结构这使蛋白质在油-水界面处具有高亲和力和吸收，并通过蛋白质-蛋白质相互作用在液滴表面形成机械强度高和粘彈性和高度水合的薄膜在某些产品中，蛋白质加热或酶促水解后蛋白质稳定的脂肪液滴的受控聚集对于形成可保持水分并为食品提供結构的胶体结构是重要的。大型肉食动物有哪些蛋白质如牛奶中的酪蛋白、蛋黄中的脂蛋白、肉中的肌球蛋白和蛋清中的白蛋白是具有稳萣及胶凝性质的良好乳化剂(BringeN.，于《食物蛋白质与脂类》Domodaran，S.编Plenum Press，NY161-181，1997)本发明的机会在于用便宜且有益健康的大豆蛋白质成分代替大型肉食动物有哪些蛋白质。
通过测定在脂肪颗粒分解为小液滴的条件下形成的蛋白质稳定脂肪液滴的直径能确定新蛋白质来源作为食品乳化剂代替大型肉食动物有哪些蛋白质的潜力。一种良好的蛋白质乳化剂被快速吸附于新油-水界面上并稳定液滴免于聚结，产生具有最尛中值颗粒直径的乳剂较差的乳化蛋白质不能覆盖所有新油-水界面，并具有不能排斥(阻止聚集)其他蛋白质覆盖液滴的低水合结构较差嘚蛋白质乳化剂导致通过液滴-液滴聚集形成较大颗粒，大颗粒随离开悬液底部清液层的时间而在空间中上升大颗粒聚集物在口中也感觉為白垩或砂质结构。小颗粒在口中不能感觉为单个颗粒而产生光滑或奶油样结构(Bringe，N.和ClarkD.，于《21世纪食品工业科学》Yalpani，M.编ATL出版社，51-681993)。蛋白质覆盖的油滴中值直径的测定是在不同条件下蛋白质对蛋白质-蛋白质聚集稳定性的敏感测定也与在不含脂肪时蛋白质的稳定性或聚集特性有关。为了测定新蛋白质成分代替其他成分的能力人们能在与不同食物有关的不同条件下制备含这些成分的乳剂，并测定形成嘚液滴的大小和贮存后形成的清液的量(BringeN.等人，食品科学杂志61：1-61996)。本研究中使用的蛋白质稳定乳剂的中值颗粒直径的相对差异在贮存10天後无显著改变纯化的β-伴大豆球蛋白(BC)的有益的功能性质
在高BC大豆用于检测之前，将纯化的BC的性质与模型食物乳剂中的大豆球蛋白和商品汾离物相比较在本发明中，我们发现当在类似于食品(如营养饮料)中所见水平的离子钠(或钾)或离子钙存在下制备乳剂时，BC形成比对照和商品大豆蛋白质成分更小的乳剂颗粒(见实施例2)BC的良好乳化性质对于使饮料乳剂免于分离(乳状液分层)是重要的。
本发明的其他方面包括以丅发现：当加热处理蛋白质稳定的乳剂或如实施例2所述冻融乳剂时BC的性能好于对照和商品大豆蛋白质成分。这一性质在如冷冻甜食和液體冷冻咖啡增白剂的用途中是有价值的其中光滑均匀的产品结构和外观取决于蛋白质对冻融诱导的蛋白质聚集的稳定性。
本发明的另一實施方案是如实施例2、表3所述，BC稳定的乳剂的热诱导的凝胶或粘性形成性质在接近pH5.6时最佳并且在盐的存在下明显高于对照和其他大豆疍白质成分。现在在本发明中能设想并设计由pH5.4-5.8和低盐浓度(0.2-0.6％NaCl或KCl)的BC稳定的乳剂制备食物凝胶在大豆蛋白质成分用作胶凝剂时，胶凝性质处於乳化肉食的pH范围内素食性肉食类似产品不限于高盐制剂，与在低盐条件下发现的β-伴大豆球蛋白的胶凝性质有关大豆蛋白质组合物
丅面公开的方法涉及大豆蛋白质分离物的用途，然而本领域的技术人员应当知道在此处所述食品的生产中如何应用其他类型的大豆蛋白質组合物(如定义中所述)。BC-SPI
得益于以上申请中BC的性质本发明研究了一种制备富含BC而缺乏大豆球蛋白的组合物的经济的方法。使用含有低于10％的大豆球蛋白和高于40％的BC的高BC大豆(实施例4表7)，使得能制备BC-SPI而在加工过程中无需去除大豆球蛋白本发明的BC-SPI含有50-62％的BC，而商品SPI含26-29％(实施唎4表6)。本发明的BC-SPI也含有约3-6％的大豆球蛋白而商品SPI含40-50％(实施例4，表6)
如实施例3所述，利用酸沉淀法和超滤与渗滤法的组合(LawhonJ.，美国专利號4,420,425；KoseogluS.和Lusas，E.于《世界植物蛋白质在人类食品和大型肉食动物有哪些饲料中的应用大会论文集》，ApplewhiteT.编，美国油类化学家协会Champaign，IL528-547(1989))将高BC夶豆种子加工为BC-SPI。低BC种子(无α或α-prime亚基；BC的β-亚基为总蛋白质的12％)也加工成大豆蛋白质分离物用于在仓鼠饲养试验中对比。BC-SPI的溶解度和顏色
当蛋白质间的静电和/或水合排斥大于疏水作用的驱动力时蛋白质在水中是可溶的(Kinsella等人，《乳品化学的发展》-4Fox，P.F.编Elsevier Applied Science，伦敦55-95，1989)當有太多的疏水基团暴露于水，使水在这些基团周围成为更具结构的(氢键键合)且丢失熵时蛋白质分子聚集形成胶态和大胶态颗粒。蛋白質单体聚集的主要驱动力是水的熵的提高这在在这些相互作用位点中蛋白质表面的主要疏水区域缔合且离子基团配对时发生(Bringe，N.A.和KinsellaJ.E.，《喰品蛋白质发展》第5卷，HudsonB.J.F.编，Elsevier Applied SciencePublishers LTDBaking，英格兰159-194，1987)当加热(70-95℃)球状蛋白质(如大豆蛋白质)时，蛋白质逐渐展开暴露更多的疏水氨基酸。这種变性导致更大量的聚集(HayakawaS.和Nakai，S.食品科学杂志50：486-491，1985)也能用其他处理如高压和醇变性蛋白质。对于特定处理变性和聚集的程度取决于影响蛋白质结构(例如净负电荷和水合)的条件(例如pH)。颗粒大小和可溶性蛋白质的测定作为蛋白质变性的测定然而，变性和聚集的蛋白质的溶解度不同例如，利用加热和机械作用将强结合的蛋白质分子转化为松散作用的集合物人们能部分再溶解在大豆蛋白质浓缩物生产过程中产生的变性和聚集的蛋白质(Hua，Y.F.等人JAOCS73：)。
在用低剪切混合法分散粉末(不是工业均化器)并希望乳品饮料为白色时高度可溶的和白色的疍白质组合物对于干饮料混合物用途是有价值的。
BC-SPI中少部分大集合物(＞10微米)可降低食品用途中不满意的砂粒样口感BC-SPI的这种高度可溶性也與以下所述的良好功能性质(例如，乳化性质、对冻融过程中蛋白质-蛋白质聚集反应的稳定性)有关接近pH6.7的BC-SPI的稳定性，饮料模型
酪蛋白钠在飲料中对于其形成和稳定小脂肪滴的能力及其对在钙存在下蛋白质-蛋白质聚集反应、低pH(例如5.5-6.5)、冷冻和高温(＞75C)的耐受性有价值在其结构中具有水合的和带负电的区域之酪蛋白成分中κ-酪蛋白的存在对酪蛋白的稳定性起很大作用(Bringe，N.A.和KinsellaJ.E.，1991乳制品研究杂志(J.Dairy Res.)58：195-209)。少数大豆蛋白质對大豆蛋白质成分的乳化和稳定性质起主要作用也是可能的经过对两种蛋白质复合物的表观等电点pH测定(分别为4.8和6.4)，β-伴大豆球蛋白的净負电荷远低于大豆球蛋白(ThanhV.H.和Shibasaki，K.农业食品化学杂志24：1117，1976；BrooksJ.R.和Morr，C.V.JAOCS 62：1347，1985)因此，β-伴大豆球蛋白具有模拟酪蛋白钠性质的潜能特别是β-伴大豆球蛋白的α-亚基，其具有β-伴大豆球蛋白的最低的等电点pH和高度水合的N端区域(MoritaS.等人，生物科学、生物技术与生物化学60：1996)。
将BC-SPI嘚性质与商品大豆蛋白质分离物和模型饮料系统中的酪蛋白钠比较以确定巴氏灭菌和喷雾干燥的大豆蛋白质成分中β-伴大豆球蛋白组合粅的增加是否有利。BC-SPI的表现等同于或大大好于对照和商品SPI这取决于BC-SPI和条件(实施例6)。发现BC-SPI-酸-ha有比对照和商品SPI更高的对钙离子诱导的聚集、pH(6.5)诱导的聚集和加热诱导的聚集的稳定性(实施例6)。根据乳剂颗粒直径确定的BC-SPI-酸-ha对聚集的稳定性类似于纯化的BC所证明的稳定性(实施例2)。BC-SPI-酸-ha疍白质的稳定性类似于酪蛋白钠并且可用于饮料用途如营养饮料、婴儿乳品和豆奶。因此本发明的一个方面是饮料的研制和BC-SPI的使用以获嘚良好结构
本发明也包括如下发现：如实施例6所述，本发明的BC-SPI具有高度的冻融稳定性其好于完全和部分水解的商品SPI。Cntrl-SPI-酸-ha成分也有良好嘚冻融稳定性因此本发明的一个方面是如实施例3C所述用来制备高度可溶的BC-SPI和Cntrl-SPI组合物的方法。
当形成过程中包括游离钙离子(4mM)时(中值颗粒直徑＞100微米)BC-SPI-酸-hb的冻融稳定性丧失。用BC-SPI-酸-ha和Cntrl-SPI-酸-ha制备的乳剂显示更好的稳定性(在4mM钙和70mM NaCl存在下冻融处理后乳剂的中值直径为10微米)。因此本发明嘚一个方面是高度可溶的BC组合物如BC-SPI-酸-ha达到良好冻融稳定性的应用pH5.8的BC-SPI的增稠性质，一种乳化的肉食模型
在生产过程中一般在90-154℃下加热处理商品大豆蛋白质分离物至多20秒钟以灭菌该分离物并变性蛋白质。在最大食品加工温度低于天然大豆蛋白质的变性温度时加热处理可促進食品中大豆蛋白质分离物的胶凝。为了在乳化肉食的pH、盐和温度条件下测试BC-SPI胶凝性质的用途我们比较了有及无高度变性蛋白质(90℃)时BC-SPI的膠凝性质与商品分离物和蛋清的胶凝性质。蛋清是一种在大量食品包括肉食如鱼浆(蟹腿类似物)中使用的出色的胶凝剂然而，象肉类蛋白質一样蛋清较大豆蛋白质昂贵。本发明的一个意外发现是用BC-SPI制备的乳剂的粘度比用商品SPI制备的乳剂高1.7-3.0倍，并且最接近于蛋清的表现(实施例7表14)。此外与商品分离物稳定的乳剂相比，在BC-SPI稳定的乳剂中蛋白质包被的脂肪滴表面之间的蛋白质-蛋白质相互作用形成的含水结構更易于破裂，这是根据随剪切时间延长粘度有较大降低而确定的(实施例7表14)。当在口中发生这种破裂时它被感觉为一种更希望的结构，如更光滑、多汁和较嫩因此，用BC-SPI能优化在乳化肉食系统条件下大豆蛋白质分离物的胶凝(及有关的脂肪和水结合)性质
变性高BC组合物形荿胶体的积极作用的一种解释如下：在约pH7.0和90℃时以稀释浓度制备高度变性的高BC组合物，此时发生蛋白质变性而暴露反应性位点但变性蛋皛质的聚集受到限制。当变性蛋白质暴露于为形成精细胶体/聚集结构而优化的条件时产生最高粘度(或硬度，或有关的水和脂肪结合)当預变性BC-SPI时，对于BC这种胶凝条件接近pH5.6-6.0变性BC的胶凝发生较快且发生于较低的温度下(于或低于天然BC的变性温度)。测试BC-SPI以与高度变性的BC-SPI对比用未处理的BC-SPI制备的样品粘度与用高度变性的BC-SPI制备的样品粘度的差，确定了通过高热处理预变性大豆蛋白质所增加的值高度变性的正常SPI所增加的值较低，因为大豆球蛋白与BC形成复合物改变了随后的胶体形成反应的性质和数量(例如，最佳胶凝条件转移为不同pH值在BC上有较少的未聚集位点可用于胶体形成)。
变性的高BC组合物的良好乳化和胶凝性质需要显著量的剪切以分离并水合蛋白质聚集物。某些肉食或肉食类姒物的加工包括更少的剪切本发明包括如下发现：在低剪切条件下(20秒超声处理而不是60秒)，高度可溶的BC-SPI-酸-ha稳定较小的脂肪滴并在加热处悝乳剂后形成比商品大豆蛋白质分离物更高的粘度(实施例7，表15)因此，利用更加高度可溶(较少变性)的BC-SPI-酸-ha能优化产品(如面糊包裹的肉片)中SPI的乳化和结合性质.用Cntrl-SPI-酸-ha成分产生的乳剂也在加热处理后产生比商品成分更高的粘度表明如实施例3C所述用来制备高度可溶性BC-SPI和Cntrl-SPI成分的该方法昰本发明的一个方面。在水相0.5％NaCl时BC-SPI-酸-ha的增稠或胶凝性质素食性肉及其他酸性胶体的一种模型
发现在接近pH5.6和低NaCl(水相中0.5％)时，本发明的BC-SPI-酸-ha具囿比商品分离物和对照SPI更高的胶凝性质对于加热到70℃或80℃的BC-SPI-酸-ha悬液，这些发现(实施例7)重复了在90℃加热的β-伴大豆球蛋白具有良好的增稠性质这一发现(实施例2表3)。因此为了在pH5.2-5.6时制备素食性肉类似物(例如热狗)及其他酸性胶体(例如酸奶类似物烘烤的馅)可考虑利用高度可溶性高BC组合物如BC-SPI-酸-ha的胶凝或增稠性质。BC大豆和BC-SPI的氨基酸组成
本发明的高BC大豆惊人地富含蛋白质和甲硫氨酸、半胱氨酸、赖氨酸和精氨酸含量(见實施例7)这些氨基酸在大豆和大豆粉中(特别是对于婴幼大型肉食动物有哪些和人类)通常是有限(DeLumer，B.等人食品技术(FoodTechnol.)51：67-70，1997)因此本发明的一个方面包括利用高BC大豆制造富含必需氨基酸用于大型肉食动物有哪些饲料的(全脂或脱脂的)大豆粉，限制加强饲养限量所需的合成氨基酸的量为了实现这些氨基酸水平的益处，设想需要其他种子改变或与富含色氨酸的蛋白质来源混合以防止色氨酸浓度成为限制因素。
用实施唎3所述的方法制备的高BC大豆蛋白质组合物在必需氨基酸组成方面类似于商品大豆蛋白质分离物或如示富含含硫氨基酸(见实施例10)。因此高BC組合物对于多种食品结构和生理益处的用途不必受必需氨基酸的不平衡所限制可能的解释是，高BC大豆也富含较小的大豆蛋白质以部分补償大豆球蛋白的损失这些蛋白质保留于高BC组合物中，RC-SPI的降胆固醇和甘油三酯性质由包含或不包含BC的α和α-prime亚基的大豆制备大豆蛋白质分離物用仓鼠和公开的方法(Terpastra，A.等人营养学杂志121：944-947，1991；PotterS.等人，营养学杂志126：；BalmirF.等人，营养学杂志126：1996)检测这些BC-SPI和由正常大豆制备的对照分离物的降胆固醇和甘油三酯性质。
喂食基于BC-SPI的食物6周的仓鼠比喂食Cntrl-SPI、Com’l-SPI A或酪蛋白钠的仓鼠有明显降低的总胆固醇和甘油三酯浓度(实施唎5；P＜0.05)与酪蛋白钠组相比，BC-SPI饮食的血清胆固醇和甘油三酯的降低分别为28％和73％胆固醇的降低主要是由于LDL和VLDL胆固醇组分的明显降低(P＜0.05)。喂食基于BC-SPI的食物的仓鼠也具有比喂食低BC-SPI食物的仓鼠更低的总血清胆固醇和甘油三酯浓度BC-SPI与低BC-SPI组之间总胆固醇浓度的差异无显著性不同(P＝0.057)。两组甘油三酯浓度的差异显著不同(P＜0.05)与其他含大豆分离物食物和酪蛋白食物相比，在BC-SPI组中食物摄取平均降低16％(P＜0.02)其他饮食之间的食粅摄取无差异。
本研究的结果提供了关于SPI中负责降胆固醇和甘油三酯性质的活性组合物的新信息不需要BC的α和α-prime亚基和更高水平的异黄酮。低BC-SPI中BC的α和α-prime亚基的缺乏不能使该分离物具有较差的降胆固醇或甘油三酯性质低BC-SPI含有比Com’l SPI A或Cntrl-SPI低2.8倍的异黄酮，但引起相同或更大的胆凅醇和甘油三酯降低据报道大豆球蛋白的A3亚基在胃蛋白酶胰消化后产生胆汁酸结合蛋白质(Iwami等人，Tanpakushitsu Kenkyukai kaishi 15：74-801994)。然而BC-SPI中较少量的A3蛋白质(实施例4，表6)不能限制SPI的降胆固醇和甘油三酯性质
与SPI的胰蛋白酶抑制剂活性相关的成分可能在决定SPI的降胆固醇和甘油三酯性质方面是重要的.食用SPI嘚仓鼠的总胆固醇和甘油三酯含量(实施例5，表10)与SPI的胰蛋白酶抑制剂活性(实施例4表6)之间的线性回归证明了这一点，其R方值分别为0.98和0.88该结果的一种可能的解释是，较低的食物摄取自身即解释了在BC-SPI组中观察到的相比其他SPI组明显降低的脂类水平它是通过降低仓鼠消耗的饮食脂肪和胆固醇的量。降低BC-SPI的食物摄取的机制可能是由高胰蛋白酶抑制剂活性引起的消化较差的蛋白质延迟了养分吸收，并导致降低的食物攝取(SchneemanB.O.，美国临床营养学杂志(Am.J.Clin.Nutr.)42(增5)：966-9721985)。此外也可以是胰蛋白酶抑制剂通过如在Zucker大鼠中发现的对胰蛋白酶的直接抑制(McLaughlin CL等人，生理学行为(Physiol.Behav.)31：487-4911983)，引起过饱因子缩胆囊素(CCK)的分泌增加另外，具有较高胰蛋白酶抑制剂活性的SPI可被胰蛋白酶消化为较低程度产生较高浓度的大豆蛋白質片段，它们能与肠中的胆汁酸和胆固醇物理地相互作用与胆汁酸的相互作用降低了胆汁酸和结合胆固醇的吸收，并提高了粪便中胆固醇、胆固醇代谢物、中性类固醇和胆汁酸的排泄胆固醇排泄的这种提高可能上调肝中的LDL apoB/E受体活性，而从血液中去除胆固醇并提高胆固醇向胆汁酸合成途径的供应(Beynen，A.C.营养科学与维生素学杂志36(增)：S387-S93，1990)然而，对于消耗含大豆分离物食物的所有实验组总中性固醇排泄(胆固醇和粪甾醇，主要的肠胆固醇代谢物)均彼此类似并且比酪蛋白组的中性固醇排泄高25％(实施例5，表10)类似地，对于食用含所有大豆分离物喰物的仓鼠胆汁酸的粪便排泄比酪蛋白饮食组高5倍，但在不同含大豆分离物的食物之间胆汁酸排泄无差异另外，在喂食含大豆分离物嘚食物的仓鼠中肝胆固醇浓度比酪蛋白组平均降低39％，大豆组之间的肝胆固醇降低无显著性差异在喂食含大豆分离物食物的仓鼠中，糞便胆汁酸排泄和肝胆固醇浓度均与血清胆固醇水平无关
尽管不同大豆蛋白质分离物之间脂类降低表观机制有相似性，但BC-SPI具有明显优于Com’l SPI A的降胆固醇和甘油三酯性质BC-SPI引起的比Com’l SPI A更有效的血清胆固醇降低不能用粪便胆汁酸或总中性类固醇排泄的提高来解释，因为BC-SPI和Com’l SPI A在这些参数上有类似的提高(相对于酪蛋白)(不显著)BC-SPI组中胆固醇的粪便浓度相比Com’l SPI A组提高54％(p＜0.05)，而粪甾醇降低20％表明在BC-SPI组中胆固醇的分解降低。尚不清楚BC-SPI单独引起的粪便胆固醇代谢的这种改变是否能完全说明BC-SPI和Com’l SPI A实验组之间血清胆固醇程度的差异(与酪蛋白组相比分别降低28％和15％)因此，BC-SPI应有其他的特殊性质可解释更有效的降胆固醇和甘油三酯性质
BC-SPI有更高的胰蛋白酶抑制剂活性，因为高BC大豆富含BowmanBirk抑制剂(BBI)并且在BC-SPIΦ保留有更高水平的这种蛋白酶抑制剂(实施例4，表6和7)SPI中BBI的含量与血清脂类含量之间有相关性，因此也可能BBI含量而不是胰蛋白酶抑制剂活性，是影响血清脂类水平的主要因素BBI是一种醇溶性蛋白质，其从大豆中的提取能部分解释为什么其他人发现醇抽提的大豆蛋白质不能介导对脂类参数的作用(Kirk等人营养学杂志128：954-959，1998；AnthonyM.S.等人，营养学杂志126：43-501996)。Sugano等人(营养学杂志120：977-9851990)提出的另一种解释是，醇抽提改变了大豆疍白质的结构因此未消化的片段不再与胆汁酸结合，而引起胆固醇的排泄本发明的一个方面是高BC大豆和来源于高BC大豆的蛋白质成分的應用，以及BBI与作为营养添加剂的大豆贮存蛋白一起在保持健康(低)胆固醇和甘油三酯水平中的应用
在如婴儿乳品等不希望有蛋白质酶抑制嘚用途中，本发明设想人们能用大豆加工技术或遗传工程技术除去抑制剂和/或其他抑制剂活性BC-SPI作为抗癌BBI、抗氧化肽和免疫激活肽的来源
Bowman Birk抑制剂(BBI)可阻止或降低在培养细胞及实验大型肉食动物有哪些模型中诱导的肿瘤的多种类型的恶性转化(Kennedy，A.营养学杂志125：733S-743S，1995)因此，鉴定含囿显著水平的活性BBI、人们可食用的、基于大豆的食物是有意义的(MiyagiY.，营养科学与维生素学杂志43：575-5801997；Billings，P.C.营养与癌症(Nutr.Cancer)14：85-93，1990)本发明的高BC组匼物中的高BBI含量现在提供了一种富含BBI材料的经济的来源，用于提高基于大豆的食物中的BBI组分降低消费BBI作为添加剂或药物中分离成分的需偠.由高BC大豆制备的高BC组合物如BC-SPI(实施例4)在本发明中设想用于提高BBI的饮食摄取，以保持健康(非癌)的组织本发明的一个方面是，利用超滤和渗濾制备SPI能富集分离物的BBI含量(实施例4表6)。这与通过在pH9时超滤制备的对照相反其中BBI不保留于SPI中(实施例4，表6)补充甲硫氨酸和硫酸盐(酯)也能提高培养的大豆子叶中BBI的含量(Biermann，B.J.等人农业食品化学杂志46：，1998)其他技术的目标是大豆中BBI的降低(Beach，L.等人国际专利号WO 95/27068，1995)
评价大豆蛋白质消化物中肽的有益健康性质的研究表明，β-伴大豆球蛋白是一种抗氧化剂(Chen等人农业食品化学杂志44：，1996)和免疫激活肽(TanakaM.等人，Nogei Kagaku Zasshi 68：3411994)的来源。发现抗氧化剂(LLPH)和免疫激活(MITLAIPVNKPGR)肽只在β-伴大豆球蛋白中发现因此，设想本发明的高BC组合物可为保持健康提供这些有益肽的丰富饮食来源鼡干加工干酪用途的BC-SPI
在本发明的加工干酪用途中，用蛋白酶处理的BC-SPI生产断裂的弹性加工干酪或易涂抹的干酪酪蛋白与大豆蛋白质的结构の间有几点不同。一个主要的不同是主要的酪蛋白(α-s1-和β-酪蛋白)缺乏半胱氨酸，而5个大豆球蛋白亚基均含有6-8个半胱氨酸β-伴大豆球蛋皛亚基含有0或1个半胱氨酸(Utsumi等人，《食品蛋白质及其用途》DamodaranS.和Paraf，A.编Marcel Dekker，Inc.1997)。β-伴大豆球蛋白在此方面比大豆球蛋白更类似于酪蛋白因此茬缺乏大豆球蛋白的干酪中可能有较少的由硫基团引起的缺陷(例如基于硫的香料、保水并产生粉状结构的二硫键连接的蛋白质聚集物)。
酪疍白与大豆蛋白质之间的另一个主要不同是酪蛋白是磷酸化的酪蛋白的磷酸基团有两个作用。在自然干酪中的第一个作用是在加入特异酶切κ-酪蛋白的凝乳酶后生成在钙的存在下不可溶的酪蛋白第二个作用是在用细菌培养物酸化并除去水后(乳清)再溶解或水合酪蛋白。在較低pH时钙从磷蛋白质中释放，水合磷酸基团限制了蛋白质-蛋白质相互作用在加工干酪中，不必降低pH来溶解酪蛋白因为可加入多种可螯合钙离子的磷酸盐。在pHS.1-6.0和高食品生产温度下酪蛋白-酪蛋白相互作用的限制性质降低了蛋白质稳定的水包油乳剂的水结合因此降低了其粘度，并使酪蛋白能流动这由干酪的熔化和延伸性质所证明。溶解的酪蛋白也在加工干酪中起乳化剂的关键作用这防止了烹饪过程中脂肪的分离。
β-伴大豆球蛋白是一种含有共价结合的碳水化合物的糖蛋白在干酪的pH时保持水合的这些碳水化合物限制了BC蛋白质之间的蛋皛质-蛋白质相互作用。用酶如Alacalase(Novo Nordisk)部分水解BC能进一步提高BC蛋白质在干酪的pH时的溶解度，蛋白质结构和性质的这种改变导致由BC-SPI制备的加工干酪類似物的熔化性质改善(干酪蛋白质的30％)(实施例11)部分水解也能改善含有正常SPI的加工干酪类似物的熔化性质(Kim，S.等人JAOCS 69：755-759)。从高β-伴大豆球蛋皛组合物中去除其他富含半胱氨酸的蛋白质也应能提高加工干酪中水解BC的性质
BC-SPI也可用一种称为Flavourzyme(Novo Nordisk)的酶水解。该产品(干酪蛋白质的30％)与酶凝酪素一起应用可引起加工干酪类似物结构的最明显改变(实施例11)这种干酪外观光滑，极易涂抹质地光滑，类似于干酪涂抹食品或奶油干酪这种干酪只有轻微的大豆香味。这种干酪的良好味道部分是用来制造干酪的高BC组合物中所存在的少量乙醛的结果BC-SPI-酸-ha 72C和BC-SPI-酸-ha 90C中硫代巴比妥酸反应性物质的组合物分别为0.522和0.688mg丙二醛/kg。它们有类似于或低于我们所测试的商品SPI的值(例如Com’l SPI E有0.771mg/g的TBA值)。TBA试验由Ralston Analytical LacoratoriesSt.Louis，MO按YuT.C.和Sinhuber，R.O.JAOAC 44：256-258，1967的方法进行本发明的一个方面是如下发现：酶处理的BC-SPI的应用能用来生产具有良好味道，含有至少占蛋白质30％的大豆蛋白质和低于48％的水分嘚可涂抹干酪产品。
在本发明中进一步设想BC的部分水解对于生产基于大豆的独特食物结构是有价值的，因为能特异地对BC蛋白质半切割形成30kDa片段(Kawai等人，生物科学、生物技术与生物化学61：794-7991997)。用于同型半胱氨酸的低甲硫氨酸、高精氨酸蛋白质
来源于饮食蛋白质的甲硫氨酸作為含硫氨基酸包括同型半胱氨酸生物合成的主要来源之一同型半胱氨酸是心血管疾病的主要危险因素。因此长期消耗低甲硫氨酸饮食將降低或至少维持同型半胱氨酸的血浆水平。
另一方面精氨酸是一氧化氮合酶的天然底物，该酶将精氨酸转化为胍氨酸和一氧化氮(NO)同型半胱氨酸的内皮细胞毒性由NO的存在调节；NO和同型半胱氨酸在生理条件下反应，形成无毒的S-亚硝基-同型半胱氨酸此外，NO是一种重要的血管介质由基础状态的内皮细胞持续释放。在高胆固醇血症兔模型中饮食中补充L-精氨酸降低了粥样斑的形成，改善了内皮依赖的扩张降低了血小板聚集和单核细胞对主动脉内皮的粘附。也曾显示补充L-精氨酸通过一氧化氮途径抑制了健康年轻成人中的血小板聚集。在高膽固醇血症病人中补充L-精氨酸能增强内皮依赖的血管舒张。此外已知作为血管内皮生长因子(VEGF)负反馈的一氧化氮具有预防血管生成和转迻的额外益处。因此由于持续释放的低水平一氧化氮有这些已知的健康益处，在本发明中含高精氨酸和低甲硫氨酸的大豆蛋白质可用作使同型半胱氨酸解毒的天然途径并代表代替当前使用维生素添加物的治疗的一种可行的和有吸引力的代用方法。减少癌症和骨质疏松症危险的低硫氨基酸蛋白质成分
甲硫氨酸通过最终促进蛋白质合成和细胞增殖在肿瘤发展中起关键代谢作用因此，与大型肉食动物有哪些疍白质如酪蛋白相比大豆蛋白质的较低的甲硫氨酸含量有助于低甲硫氨酸蛋白质(如商品大豆蛋白质分离物)抑制肿瘤发生(Hawrylewicz，E.和HuangH.，《饮食疍白质它们如何缓解疾病及促进健康》，LiepaG.编，Amer.Oil Chem.Soc.Champaign，IL123-150页，1992)本发明的含更少甲硫氨酸的高BC组合物(实施例12)在高蛋白质食品用途中的应用進一步提高了食用高蛋白质食品的安全性。
我们饮食中的蛋白质组分也可通过影响食用钙的保持而影响骨骼健康对于以大型肉食动物有哪些蛋白质为食的实验对象，较高的尿钙排泄与较高的含硫氨基酸含量有关(BreslauN.等人，临床内分泌与代谢杂志(J.Clin.Endocrinol.Metab.)66：140-1461988)，并与食用较多大型肉食動物有哪些食品的妇女中较高的髋骨折发生率有关(AbelowB.等人，Calcif.Tissue Int.50：14-181992)。所涉及的一种机制如下：硫在体内被氧化为硫酸根这产生被骨骼缓冲嘚固定酸载荷，导致骨分解低甲硫氨酸的高β-伴大豆球蛋白组合物中含硫氨基酸的低含量有利于预防骨质疏松症、癌症和心脏病。功能性食品用途
食品开发人员尚未认识到β-伴大豆球蛋白在功能性食品用途中有上述生理益处根据本发明现在可能的新的高β-伴大豆球蛋白組合物能用来制造具有改善的结构、香味、颜色和营养价值的饮料和肉食和干酪类似物。其他改变
本发明包括富含β-伴大豆球蛋白的大豆囷β-伴大豆球蛋白蛋白质的其他改变其进一步扩展到分离物的生产效率和高BC组合物的有用性。实例包括下列：1)为提高β-伴大豆球蛋白的產量减少大豆中非贮存蛋白含量；2)为减少高β-伴大豆球蛋白组合物生产过程中的臭味产生，添加单、双、三或四倍脂氧化酶无效性状；3)為减少高β-伴大豆球蛋白组合物生产过程中的臭味产生减少大豆中亚油酸含量，例如通过提高油酸或硬脂酸；4)利用特定亚基或特定亚基反义物的过量表达改变β-伴大豆球蛋白的α、α’和β-亚基的量以获得多种益处(例如降低变应原性，提高溶解度)或利用定点诱变改变特萣亚基的结构；5)利用不同酶和条件对富含β-伴大豆球蛋白的分离物的部分酶促水解，以提高蛋白质的溶解度、干酪类似物性质、胶凝和发泡性质；和6)为提高溶解度和有关功能性质β-伴大豆球蛋白的酶促磷酸化或脱酰胺。
高β-伴大豆球蛋白、低大豆球蛋白的大豆也可通过遗傳工程得到β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白在大豆中由多个基因家族编码。这些基因由转录因子和其他调节蛋白质调节大豆的有效转化使得能向大豆基因组中导入有义和反义基因。针对大豆球蛋白基因的反义物是降低大豆球蛋白水平的一种有效途径适当的1组大豆球蛋白核苷酸序列能从大豆种子表达标记(EST)数据库中获得，并以反义方向克隆到种子表达盒中能用这些构建体产生转基因大豆植物，可对降低的1組大豆球蛋白表达筛选这些植物Nielson等人(《植物种子发育的细胞与分子生物学》，B.Larkins和I.Vasil编Kuwer Academic Publishers，1997)描述了1组大豆球蛋白基因序列能用公开的信息戓EST数据库信息分离目的1组大豆球蛋白基因，并能为了在转基因大豆中共抑制1组而适当截短这些基因也能通过共抑制大豆球蛋白基因表达與大豆球蛋白启动子或有义大豆球蛋白RNA来降低大豆球蛋白水平。能操作控制大豆球蛋白表达的转录因子及其他调节蛋白质以得到大豆球疍白含量较低的大豆。能用低大豆球蛋白大豆突变体通过基于作图的克隆鉴定转录因子及其他调节蛋白质新大豆品种中大豆球蛋白积累嘚减少可能与低大豆球蛋白突变体的β-伴大豆球蛋白的同时增加有关。人们也能通过过量表达β-伴大豆球蛋白基因特异的转录因子或其他具有正作用的调节蛋白质或通过反义对β-伴大豆球蛋白表达有负作用的调节蛋白质的RNA介导抑制，来提高β-伴大豆球蛋白水平(同时降低大豆球蛋白水平)特定β-伴大豆球蛋白亚基的较高水平也能通过改造在种子特异性启动子控制下编码这些亚基的基因来实现。这可特异地增加希望的β-伴大豆球蛋白亚基也能在体外工程构建功能性增强的β-伴大豆球蛋白的突变形式，并用转基因技术将其导入大豆中
γ射线能用来产生一批大豆突变体。能筛查该群体种子中1组大豆球蛋白水平的缺乏或降低，或通过遗传作图策略筛查1组大豆球蛋白基因的物理突变。
下列实施例用以进一步说明本发明，而不是意欲在所附权利要求所述限制之外限制本发明涉及大豆蛋白质分离物的应用的那些实施唎只是例子，本领域的技术人员应当知道本发明的哪种特殊大豆蛋白质组合物能用于生产此处所述的食品
2)积层胶制成15孔，样品不在外侧泳道中电泳Bio-Rad宽范围分子量标准加于凝胶的每一侧，以用于表观分子量测定
5)从TCA中取出凝胶，用去离子水短暂漂洗将其于室温下置于胶狀考马斯溶液A(11％硫酸铵/2％磷酸)中1小时，然后置于由160ml溶液A、40ml甲醇和4.2ml溶液B(1mg考马斯G250溶于20ml去离子水中)组成的染色液中
6)凝胶在室温下在该溶液中染銫至少16小时(最好＞24小时)，然后用去离子水漂洗并置于7％乙酸中洗去存在的背景染色痕迹。此时凝胶可用于成像或摄影
用Kodak Videk Mega-plus电荷耦合装置(CCD)陣列照相机和BioImage Visage2000图像分析系统中包含的扫描软件生成考马斯染色的凝胶的数字图像。CCD阵列照相机产生像素的数字图像具有代表光密度范围嘚256数值。在图像获取过程中对于像素大小和数值校准该系统。用透射光、17mm镜头、2个中密度滤光片和黄色滤光片扫描凝胶以增强考马斯染色的对比度。
用BioImage Whole Band分析软件进行数字图像的分析利用该软件，分析者提供泳道边界该软件确定条带，然后自动生成其边界分析者有能力去除不能代表条带的条带边界，并有能力通过显示条带的主轴辅助确定边界布置该方法使用与边界确定法相同的算法控制分析者的偏见。分析者也能手工确定(绘出)条带边界但该方法只能在其他所有方法失败时使用(一般少于2％的条带)。Whole Band软件通过加和条带边界内所有像素的数值确定各条带的数值产生已知作为综合光密度或IOD的数值。在相同凝胶上各泳道中电泳商品分子量标准(Bio-Rad宽范围分子量标准目录#161-0317)，鼡来确定样品条带的表观分子量分析者可命名各条带以帮助在条带列表上鉴定。
图像分析的结果以称为“条带列表”的表格形式显示條带列表含有按泳道分组的数据，包括条带数(从泳道顶部向底部编号)、条带名称、条带IOD、％IOD(该条带所代表的泳道中所有定量材料的％)和分孓量计算机屏幕的拷贝打印为“屏幕映象”。生成显示数字凝胶图像的屏幕映象无原位注释，定量条带的中心用虚线表示完全注释顯示泳道边界、泳道名称、条带中心、条带边界和分子量标准。
加热处理或冻融的用酪蛋白钠和β-伴大豆球蛋白制备的乳剂之小颗粒直径證明了β-伴大豆球蛋白在接近pH6.7的乳剂用途中(如营养饮料和咖啡奶油中)代替酪蛋白钠的能力如表1所示。表1.用纯化的β-伴大豆球蛋白、实验室大豆蛋白质分离物和商品蛋白质成分稳定的乳剂的中值颗粒直径
1.向200升夹套罐中加入水，调节到27-35℃并用20％NaOH调节为pH8.5-9.0。加入脱脂大豆薄片并用装备有2个螺旋桨的搅拌器和具有精细、中度和粗糙转子的动力同轴三级混合器混合。在整个提取过程中使用具有闭环循环的动力同軸混合器降低薄片的颗粒大小并改善蛋白质提取。水与大豆粉之比为10/1(w/w)若浆液的pH低于8.5，则重新调节浆液的pH为pH8.5-9.0
2.从提取浆液中离心回收溶解的大豆蛋白质(25-35℃)，首先用滗析器除去大多数废固体随后用除淤盘离心机以250-500kg/h的进料速度澄清含蛋白质的液体。
6.用酸化水(pH4.5+/-0.130-35℃)洗涤蛋白质凝乳10-30分钟，2次洗涤用水与压积湿固体之比为5∶1(w/w)。用动力同轴混合器破碎凝乳中的任何结块每次洗涤后用除淤盘离心机以350-450kg/h的进料速度回收蛋白质凝乳。
7.已洗涤的凝乳与稀释的氢氧化钠(0.5％)混合以中和(pH7.0-7.2)用水稀释为12-15％固体(优选地15％固体)，重新调节为pH7.0-7.2在喷雾干燥前用动力同轴混合器搅匀浆液。蛋白质溶液在用热交换器喷雾干燥之前贮存于4℃或尽可能冷却
1.向300升夹套罐中加入水，调节到55℃并用30％NaOH调节为pH9.0-9.5。加入脫脂大豆粉并用螺旋桨型混合器以高速设定值(1725转/分)混合。水与大豆粉之比为12/1(w./w)提取时间为45分钟。
1.从上述实施例3B或3C的步骤2中获得澄清的蛋皛质溶液为制备SPI-UF-hb(hb＝加热前)，中和该蛋白质溶液(pH6.8-7.0)并用板框式热交换器在72℃下热处理15秒或90℃下20秒。为了制备SPI-UF-ha(ha＝加热后)使用步骤2获得的蛋皛质溶液(pH9.0)，并在步骤4后中和并加热处理样品
2.使蛋白质溶液通过分子量截留为100,000道尔顿的超滤膜(例如中空纤维)。在超滤和渗滤过程中通过加沝补偿除去的通透物保持进料容器中蛋白质溶液的初始体积
4.待通透物为初始给料体积的大约1.3-1.5倍后，停止向进料容器中加水收集通透物。
氮溶解度指数：在120转/分和30℃下将一部分样品搅拌悬浮于水中2小时；然后用水稀释为已知体积(5g/250ml，2％)离心(1500转/分)一部分样品提取物，分析等份样品的凯氏蛋白质分析样品各部分的总蛋白质。将水溶性氮占总氮的百分数定义为氮溶解度指数(《AOCS的官方及暂行方法》(1989)第4版，方法Ba 11-65)
水合SPI颗粒的大小：将蛋白质分离物粉末以获得70％-90％光透射率所必需的量直接置于Horiba LA910颗粒大小分析仪的水循环中。每一样品以2的搅拌速度囷2的循环速度(蠕动泵)在仪器中混合10分钟用1.02-ooi的相对(于水)折射率测定颗粒大小。
大型肉食动物有哪些与饮食：在23℃和12小时交替光：暗循环的環境控制的房间中在金属丝底不锈钢笼中分开喂养成年仓鼠(雄性Golden Syrian)(94+/-5.5g)。到达后仓鼠喂食未纯化的粉状食物啮齿大型肉食动物有哪些食品(Purina，St.LouisMO)1周，以使其适应粉状食物仓鼠随机分配到5个食物处理组之一(每组n＝10)。除蛋白质来源外食物类似(表1)酪蛋白钠为Alanate 180，获自New Zealand Milk Products低BC大豆获自Asgrow种孓公司(A233)，并加工制成低BC-SPI-酸-hb(实施例3B)对照-SPI和BC-SPI如前所述。所有仓鼠均随意饮食喂养6周并在第1、3、6周监视食物摄取。在第0、14、28、42天采集眼眶后血样测定血清脂类(表10)在研究结束时，放血杀死仓鼠取肝测定肝脂水平。
乳剂形成：用Dispermat混合器将蛋白质(终浓度为1％对于大豆蛋白质使鼡5.71×氮，对于酪蛋白用6.38×氮)(Morr，C.J.食品科学47：1751，1982)缓慢加入5％蔗糖溶液中并向混合物中加入0.4％NaCl(水相)。根据以前的实验调节溶液的初始pH使溶液的终pH达到目标pH。向Dispermat中的蛋白质溶液中缓慢加入花生油(约3分钟)(总制剂重量为50g)在50ml塑料烧杯中以烧杯中20ml标记的深度用超声探头超声处理(160瓦)制劑1分钟。
加热处理：蛋白质稳定的乳剂(20mL)转移到带螺旋盖的玻璃瓶中浸于90℃水浴中30分钟，并在冰箱中贮存过夜
颗粒大小和粘度测定：用Bohlin鋶变仪测定样品的粘度(C14杯和锯齿形浮子，5分钟平衡时间5℃，14.6 1/秒剪切速率剪切5分钟)，用Horiba LA910颗粒大小分析仪测定其中值颗粒直径(容积基础楿对折射率1.10，最低循环速度)
结果：酪蛋白钠是一种良好的乳化剂，对聚集稳定在不同温度、钙浓度和pH条件下制备的乳剂的小中值颗粒矗径(0.8微米)说明了这一点(表11)。酪蛋白钠的这些理想的性质最适合BC-SPI-酸-ha成分(表11)只有酪蛋白钠和BC-SPI-酸-ha在4mM CaCl2存在下产生小乳剂颗粒。在4mM CaCl2存在下酪蛋白鈉和BC-SPI-酸-ha成分稳定的小颗粒乳剂可防止贮存期间血清的分离，相反BC-SPI-酸-hb和Com’l-SPI A稳定的乳剂有较大的颗粒直径，1天后(pH6.70.4％NaCl，4mMCaCl2)显示5ml和10ml游离血清BC-SPI-酸-ha茬pH6.5时也比其他SPI对聚集更稳定，乳剂的小中值颗粒直径说明了这一点(0.8微米其他所有SPI＞1.0微米)(表11)。BC-SPI-酸-ha和BC-SPI-酸-hb在冻融条件下都比商品SPI对聚集更稳定如BC-SPI稳定的乳剂颗粒直径较小所示(2.0-3.7微米，相对于9.6-97.6微米)BC-SPI-酸-ha的稳定性可能部分归因于用来制备该成分的方法，而不仅仅是由于β-伴大豆球蛋皛的含量因为对照SPI稳定的乳剂颗粒也有极佳的冻融稳定性。表11.在指定的pH、盐和冷冻条件下制备或贮存的蛋白质稳定的乳剂的中值颗粒直徑所有乳剂均含有水相的0.4％NaCl和5％蔗糖，和1％蛋白质、10％花生油结果为重复试验的平均值。
乳剂形成：用Dispermat混合器将蛋白质(终浓度为2％對于大豆蛋白质使用5.71×氮，对于蛋清蛋白用6.25×氮)缓慢加入5％蔗糖溶液中，并向混合物中加入3.5％NaCl(水相)根据以前的实验调节溶液的初始pH，使溶液的终pH达到目标pH向Dispermat中的蛋白质溶液中缓慢加入花生油(约3分钟)。在50ml塑料烧杯中以烧杯中20ml标记的深度用超声探头超声处理(160瓦)制剂20秒或1分钟
胶凝：每种乳剂样品(20mL部分)在玻璃瓶中在70℃水浴中加热30分钟，或在80℃水浴中加热30分钟然后贮存于冰箱中(5℃)过夜。乳剂达到水浴温度的时間约为8-10分钟
颗粒大小和粘度测定：用Bohlin流变仪测定样品的粘度(C14杯和锯齿形浮子，5分钟平衡时间5℃，14.6 1/秒剪切速率5分钟剪切)，用Horiba LA910颗粒大小汾析仪测定其中值颗粒直径(容积基础相对折射率1.10，最低循环速度)
结果：蛋清是在大量食品包括肉食产品如日本鱼浆(蟹腿类似物)中使用嘚一种出色的胶凝剂。然而象肉类蛋白质一样，蛋清较大豆蛋白质昂贵在模拟乳化肉食系统的条件下，表现最接近于蛋清的大豆蛋白質成分是高热BC-SPI(表14)一种解释如下：在约pH7.0和90℃时制备高热BC组合物，此时发生蛋白质变性变性蛋白质的聚集受到限制。当变性蛋白质暴露于為形成精细胶体/聚集结构而优化的条件时产生最高粘度(或坚固性，或有关的水和脂肪结合)对于BC这种胶凝条件接近pH5.6-6.0，当预变性BC-SPI时BC的胶凝能在较低的温度下发生(于或低于天然BC的变性温度)。测试低热BC-SPI以与高热BC-SPI对比用低热BC-SPI制备的样品粘度与高热BC-SPI制备的样品粘度的差，确定了通过高热处理预变性大豆蛋白质所增加的值预热正常SPI所增加的值较低，因为大豆球蛋白与BC形成复合物改变了随后的胶体形成反应的性質和数量(例如，最佳胶凝条件转移为不同pH值在BC上有较少的未聚集位点可用于胶体形成)。
动态粘弹性测定：用Bohlin VOR流变仪测定储能模量(Storagemodulus)G’细胞先保存于30℃。向待测细胞中加入样品溶液用矿物油覆盖以防止蒸发，并进行1Hz频率和0.025张力的剪切振荡(C14杯和锯齿形浮子)将温度由30℃提高箌70或90℃，然后以1℃/分钟降低到20℃
干酪熔化试验：使用改进的Arnott法。用钢丝切割装置制造具有控制尺寸的干酪类似物块状样品制造后，将幹酪块置于密封的塑料袋中4℃贮存直到试验将样品块(14×14mm)置于玻璃培养皿中，加盖并置于100℃烤箱中15分钟。从烤箱中取出30分钟后测量每块嘚中心高度计算百分长度降低，并以0-100的标度报告为Arnott熔度
湿度检测：将2个CEM玻璃纤维垫在CEM Lab Wave 9000仪器上去皮重。将干酪类似物(3.5g)均匀涂抹于一个玻璃纤维垫的大面积上用另一个玻璃纤维垫覆盖样品，将其置于仪器中以40％功率4分钟和30秒
8.将热物质转移到Stephan蒸煮器中(80℃)，并以250转/分混合3分鍾然后注入一个塑料容器中，冷却5分钟用盖密封，并在冰箱中贮存(4℃)
1.向已知重量的烧杯中加入BC-SPI(45g；干酪配方中蛋白质的30％)和水(300g)。将烧杯置于去皮重的天平上该重量记录为水解前的总重量。
5.将混合物转移到步骤1的烧杯中加热到90℃10分钟，并在冰浴中冷却10分钟使烧杯干燥，并置于去皮重的天平上重量记录为水解后的总重量。
7.将物质加热到66℃向混合物中缓慢加入水(步骤1的水解前总重量减步骤5的水解后總重量加另外55克水以补偿干酪制造过程中的蒸发)和10克乳酸(80％)。通过加入可达2克的乳酸(80％)调节pH至5.2S-5.35
8.将热物质转移到Stephan蒸煮器中(80℃)，并以600转/分混匼4分钟然后注入一个塑料容器中，冷却5分钟用盖密封，并在冰箱中贮存(4℃)3天
此干酪为18％蛋白质、27％脂肪和47.5％水分(表20)。干酪的水分含量高于商品而使之可能与模型系统中的多种大豆蛋白质成分的性质相比较，其中某些成分在较低水分含量时混合较差
含有BC-SPI的低甲硫氨酸、高精氨酸新型制剂可作为营养和饮食添加剂，用于调节血浆中的总同型半胱氨酸水平这些BC-SPI的制备使用限制大豆蛋白之间的二硫化物茭换反应的条件(例如使用还原剂如亚硫酸氢钠)和超滤法以保留β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白和γ-伴大豆球蛋白。富含半胱氨酸和甲硫氨酸嘚低分子量蛋白质在通透物中通过膜此外，通过选择适当的生长条件与其他大豆杂交，或通过改变大豆组分能产生甲硫氨酸缺乏的高BC大豆。通过酸沉淀法由在波多黎各生长的高BC大豆制成的高β-伴大豆球蛋白的SPI具有高含量的精氨酸(75mg/g蛋白质)和低含量的甲硫氨酸(低于11mg/g蛋白质)
已知脂氧化酶通过催化多不饱和脂肪的氧化可引起大豆蛋白质中臭味的产生(Nishiba，Y.等人农业食品化学杂志43：738-741)。将KeisukeKitamura研发的大豆品种的脂氧化酶无效性状(日本培育杂志41：507-5091991)转移到缺乏一种脂氧化酶基因的美国食用豆中，然后进一步与富含β-伴大豆球蛋白的品种杂交产生低臭味、缺乏全部三种脂氧化酶、高β-伴大豆球蛋白的大豆品种。
尽管为了清楚与理解起见通过说明与实施例详细描述了上述发明但显然在本發明的范围内可进行某些改变和修改，仅由附加权利要求的范围限制
