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基于双荧光素酶报告基因的DNA损伤与修复检测系统的建立与应用
目的：建立一种能够同时对环境致癌物所致HepG2细胞DNA损伤和细胞对损伤DNA的修复能力进行快速检测的系统。方法：5μmol/L氯化镉体外损伤质粒pTK-RL，质粒pgadd153-luc和体外受损的质粒pTK-RL共转染到HepG2细胞中，以16种已知致癌物或3种无遗传毒性的非致癌物刺激细胞，利用双荧光素酶检测方法同时检测DNA损伤和细胞的修复能力；双荧光素酶检测系统检测居民区、垃圾焚烧厂和农田3个不同污染区土壤中非挥发性有机提取物对DNA的损伤作用和细胞对该损伤的修复能力；彗星实验检测DNA的损伤。结果：双荧光素酶报告基因检测系统均可检出已知环境致癌物对DNA损伤与修复能力的影响，非致癌物均未检测到DNA损伤作用和对细胞DNA修复能力的影响；3个不同污染区土壤中非挥发性有机提取物均可诱导DNA损伤并抑制细胞对DNA损伤的修复能力，强度为居民区&垃圾焚烧厂&农田土壤。结论：在本研究条件下建立了可同时检测环境致癌物DNA损伤与细胞修复能力的双荧光素酶报告基因检测系统并可用于环境污染区检测。
Abstract：
OBJECTIVE: Development of a screening system for DNA damage and repair based on dual luciferase assay in human HepG2 cells. METHODS:5μmol/L CdCl2 was used to treat the plasmid pTK-RL in vitro. Plasmid pgadd153-luc and damaged pTK-RL were co-transfected into HepG2 cells and then the reconstituted HepG2 cells were treated with sixteen DNA-damaging agents and three non-genotoxic agents. The DNA damage and DNA repair abilities of HepG2 cells were measured by dual luciferase assay. Three organic extracts from different sites of soil (residential area,garbage dump and farmland) were evaluated by dual luciferase assay. DNA damage was detected by Comet assay. RESULTS:The dual luciferase assay could identify genotoxic and non-genotoxic agents. The three different soil samples had various levels of inducing DNA damage and decreasing DNA repair capacities in HepG2 cells following the order:residential area&garbage dump&farmland. CONCLUSION:In this study,the dual luciferase assay was developed to measure DNA damage and repair.
ZHANG Rong
NIU Yu-jie
FAN Long-gang
WANG Xiu-rong
作者单位：
河北医科大学公共卫生学院卫生毒理学教研室,河北 石家庄,050017
河北医科大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学教研室,河北 石家庄,050017
河北医科大学基础医学院免疫教研室,河北 石家庄,050017
年，卷(期)：
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在线出版日期：
基金项目：
国家自然科学基金，河北省自然科学基金
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DNA损伤修复与细胞凋亡
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DNA损伤是复制过程中发生的DNA永久性改变，并导致特征改变的现象。情况分为：substitutation （替换）deletion （删除）insertion （插入）exon skipping （外显子跳跃）
DNA损伤DNA损伤的改变类型
DNA损伤导致的各种损坏的染色体
DNA损伤点突变（point mutation）
指DNA上单一碱基的变异。替代嘌呤（A与G之间的相互替代）、替代嘧啶（C与T之间的替代）称为转换（transition）；嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤则称为（transvertion）。
DNA损伤缺失（deletion）
指DNA链上一个或一段的消失。
DNA损伤插入（insertion）
指一个或一段插入到DNA链中。在为蛋白质编码的序列中如缺失及插入的核苷酸数不是3的整倍数，则发生读框移动（reading frame shift），使其后所译读的氨基酸序列全部混乱，称为（frame-shift mutaion）。
DNA损伤倒位或转位
（transposition） 指DNA链重组使其中一段核苷酸链方向倒置、或从一处迁移到另一处。
DNA损伤双链断裂
已如前述，对单倍体细胞一个双链断裂就是致死性事件。
DNA损伤DNA损伤的原因
DNA存储着生物体赖以生存和繁衍的，因此维护DNA分子的完整性对细胞至关紧要。外界环境和内部的因素都经常会导致DNA分子的损伤或改变，而且与RNA及蛋白质可以在细胞内大量合成不同，一般在一个中只有一份DNA，在真核二倍中相同的DNA也只有一对，如果DNA的损伤或遗传信息的改变不能更正，对体细胞就可能影响其功能或生存，对则可能影响到后代。 所以在进化过程中生物细胞所获得的修复DNA损伤的能力就显得十分重要，也是生物能保持遗传稳定性之所在。在细胞中能进行修复的生物大分子也就只有DNA，反映了DNA对生命的重要性。另一方面，在中突变又是与遗传相对立统一而普遍存在的现象，DNA分子的变化并不是全部都能被修复成原样的，正因为如此生物才会有变异、有进化。
DNA损伤DNA分子的自发性损伤
DNA损伤DNA复制中的错误
以DNA为模板按硷基配对进行DNA复制是一个严格而精确的事件，但也不是完全不发生错误的。硷基配对的错误频率约为10-1-10-2，在DNA的作用下错误配对频率降到约10-5-10-6，复制过程中如有错误的核苷酸参入，还会暂停，以其3’-5’的活性切除错误接上的核苷酸，然后再继续正确的复制，这种校正作用广泛存在于和真核的DNA聚合酶中，可以说是对DNA复制错误的修复形式，从而保证了复制的准确性。但校正后的率仍约在10-10左右，即每复制1010个核苷酸大概会有一个硷基的错误。
DNA损伤DNA的自发性化学变化
生物体内DNA分子可以由于各种原因发生变化，至少有以下类型：
①碱基的异构互变 DNA中的4种碱基各自的异构体间都可以自发地相互变化（例如式与酮式硷基间的互变），这种变化就会使间的氢键改变，可使腺嘌呤能配上、胸腺嘧啶能配上鸟嘌呤等，如果这些配对发生在DNA复制时，就会造成DNA序列与亲代DNA不同的错误性损伤。
②碱基的 碱基的环外氨基有时会自发脱落，从而会变成、腺嘌呤会变成次（H）、会变成黄嘌呤（X）等，遇到复制时，U与A配对、H和X都与C配对就会导致子代DNA序列的错误变化。自发脱氨基的频率约为每个细胞每天190个。
③脱与脱 自发的水解可使嘌呤和嘧啶从DNA链的磷酸骨架上脱落下来。一个哺乳类细胞在37℃条件下，20h内DNA链上自发脱落的嘌呤约1000个、嘧啶约500个；估计一个长寿命不复制繁殖的哺乳类细胞（如神经细胞）在整个生活期间自发脱嘌呤数约为108，这占细胞DNA中总嘌呤数约3%。
④修饰与链断裂 细胞呼吸的副产物O2-、H2O2等会造成DNA损伤，能产生胸腺嘧啶乙二醇、羟甲基等碱基修饰物，还可能引起DNA单链断裂等损伤，每个哺乳类细胞每天DNA单链断裂发生的约为5万次。此外，体内还可以发生DNA的，结构的其他变化等，这些损伤的积累可能导致老化。
由此可见，如果细胞不具备高效率的修复系统，生物的将大大提高。
DNA损伤物理因素引起的DNA损伤
射线引起的DNA损伤是最引人注意的。
DNA损伤紫外线引起的DNA损伤
DNA分子损伤最早就是从研究紫外线的效应开始的。当DNA受到最易被其吸收（～260nm）的紫外线照射时，主要是使同一条DNA链上相邻的嘧啶以连成二聚体，相邻的两个T、或两个C、或C与T间都可以环环（cyclobutane ring）连成二聚体，其中最容易形成的是TT二聚体.。
人皮肤因受紫外线照射而形成的频率可达每小时5× 104/细胞，但只局限在皮肤中，因为紫外线不能穿透皮肤。但微生物受紫外线照射后，就会影响其生存。紫外线照射还能引起DNA链断裂等损伤。
DNA损伤电离辐射引起的DNA损伤
电离辐射损伤DNA有直接和间接的效应，直接效应是DNA直接吸收射线而遭损伤，间接效应是指DNA周围其他分子（主要是水分子）吸收射线能量产生具有很高反应活性的自由基进而损伤DNA。电离辐射可导致DNA分子的多种变化：
①硷基变化 主要是由OH-自由基引起，包括DNA链上的硷基氧化修饰、的形成、硷基环的破坏和脱落等。一般比更敏感。
②变化 脱氧核糖上的每个碳原子和羟基上的氢都能与OH-反应，导致脱氧核糖分解，最后会引起DNA链断裂。
③DNA链断裂 这是电离辐射引起的严重损伤事件，断链数随照射剂量而增加。射线的直接和间接作用都可能使脱氧核糖破坏或断开而致DNA链断裂。DNA中一条链断裂称单链断裂（single strand broken），DNA双链在同一处或相近处断裂称为双链断裂（double strand broken）。虽然单断发生频率为双断的10-20倍，但还比较容易修复；对单倍体细胞（如细菌）一次双断就是致死事件。
④ 包括DNA链交联和DNA-蛋白质交联。同一条DNA链上或两条DNA链上的硷基间可以结合，DNA与蛋白质之间也会以共价键相连，、中的、调控蛋白、与复制和转录有关的酶都会与DNA共价键连接。这些交联是细胞受后在显微镜下看到的染色体畸变的分子基础，会影响细胞的功能和DNA复制。
DNA损伤化学因素引起的DNA损伤
化学因素对DNA损伤的认识最早来自对化学武器杀伤力的研究，以后对癌症化疗、化学的研究使人们更重视突变剂或致癌剂对DNA的作用。
1、对DNA的损伤 烷化剂是一类亲电子的化合物，很容易与中大分子的亲核位点起反应。烷化剂的作用可使DNA发生各种类型的损伤：
①。烷化剂很容易将烷基加到DNA链中嘌呤或的N或O上，其中鸟嘌呤的N7和腺嘌呤的N3最容易受攻击，烷基化的嘌呤硷基配对会发生变化，例如鸟嘌呤N7被烷化后就不再与配对、而改与胸腺嘧啶配对，结果会使G-C转变成A-T。
②碱基脱落。 烷化鸟嘌呤的糖苷键不稳定，容易脱落形成DNA上无硷基的位点，复制时可以插入任何核苷酸，造成序列的改变。
③断链。DNA链的上的氧也容易被烷化，结果形成不稳定的磷酸三酯键，易在糖与磷酸间发生水解，使DNA链断裂。
④交联。烷化剂有两类，一类是单烷化剂，如甲烷，只能使一个位点烷基化；另一类是双功能基烷化剂，化学武器如氮芥、硫芥等、一些抗癌药物如环磷酰胺、苯丁酸氮芥、丝裂霉素等、某些如等均属此类，其两个功能基可同时使两处烷基化，结果就能造成DNA链内、DNA链间、以及DNA与蛋白质间的交联。
2、、修饰剂对DNA的损伤 人工可以合成一些硷基类似物用作促突变剂或抗癌药物，如5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-氟尿嘧啶（5-FU）、2-氨基腺嘌呤（2-AP）等。由于其结构与正常的硷基相似，进入细胞能替代正常的硷基参入到DNA链中而干扰DNA复制合成，例如5-BU结构与胸腺嘧啶十分相近，在酮式结构时与A配对，却又更容易成为烯醇式结构与G配对，在DNA复制时导致A-T转换为G-C。
还有一些人工合成或环境中存在的化学物质能专一修饰DNA链上的硷基或通过影响DNA复制而改变硷基序列，例如亚硝酸盐能使C脱氨变成U，经过复制就可使DNA上的G-C变成A-T对；羟胺能使T变成C，结果是A-T改成C-G对；黄曲霉素B也能专一攻击DNA上的硷基导致序列的变化，这些都是的化学物质或致癌剂。
DNA损伤DNA损伤的后果
突变或诱变对生物可能产生4种后果：
①致死性；
②丧失某些功能；
③改变（genotype）而不改变表现型（phenotye）；
④发生了有利于物种生存的结果，使生物进化。
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