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抗伏马菌素B1单链抗体的制备及其免疫学检测初步应用研究.pdf 88页 88页
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抗伏马菌素B1单链抗体的制备及其免疫学检测初步应用研究.pdf
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伏马菌素(Fumonisins)是由串珠镰刀菌属产生的常见于玉米等谷物中的一
类真菌毒素，具有神经毒性、肝肾毒性及潜在的致癌性，伏马菌素Bl(FBl)
是最主要污染组分，也是毒性最强的。建立食品中伏马菌素污染残留的有效监
控和检测方法是防止其造成食品安全问题的重要手段。目前，FBl的检测方法
有高校液相色谱分析、液相色谱．质谱联用技术、免疫学分析和电化学分析等，
其中免疫学方法以其简单快速、灵敏、高通量等特点显示出独特的优势。单链
抗体(Single．chainfragment，scFv)是单克隆抗体(Monoelonalantibody,
McAb)完整抗原结合特性的最小功能单位，其相对于单克隆抗体具有易于遗传
改造和表达等优点，且有利于生物合成酶标记抗体和发展多种免疫学检测模式。
本研究制备了抗FB。单克隆抗体和单链抗体，基于特异性单链抗体建立了玉米
immunosorbent
assay，ELISA)检测
中FBl的酶联免疫吸附试验(Enzyme．1inked
方法。主要研究结果如下：
1分别制备了戊二醛交联法和碳化二亚胺缩合法合成的FBl免疫抗原，即
抗血清，且两组小鼠抗血清在效价和特异性方面未发现明显差异，均未见与FB2
有高交叉反应率。将FBI．GA．KLH免疫的小鼠脾脏细胞与骨瑟瘤细胞进行细胞
融合，经ELISA筛选和亚克隆后获得两株分泌抗FBl单克隆抗体的细胞株，
命名为1D1l和3FI
2采用鼠源抗体可变区简并引物从杂交瘤细胞总RNA中扩增获得两株单
克隆抗体可变区片段后，采用重叠延伸PCR将其与弹性连接肽组装成单链抗体
鉴定。测序后，对单链抗体的氨基酸序列进行比对、理化性质分析和同源建模，
结果表明展示在噬菌体表面盼随株单链抗体均具有抗体活性，其序列与鼠源抗
体可变区具有高同源性，均能形成正确的空间构象，理论分子量约为25．26
理论等电点为中性或偏碱性，为亲水性蛋白。
3以克隆1D1l为研究对象，构建了单链抗体及其碱性磷酸酶融合蛋白
(scFv．AP)原核表达载体，优化了原核表达条件，单链抗体及其融合蛋白均主
要以包涵体形式存在于细胞质中；对包涵体蛋白进行了纯化与复性后，单链抗
体蛋白具有与亲本单克隆抗体相似的抗体活性，基于seFv的间接竞争ELISA
线性拟合范围是2．10．76．45¨gL。(R2=0．9922)，IC50值为12．67lagL～，与FB2
交叉反应率为5．23％。seFv．AP融合蛋白具有抗体和碱性磷酸酶双活性，但其
碱性磷酸酶活性较低而无法应用于建立检测体系。
4通过ELISA分析表明该单链抗体对温度较敏感，热处理会导致其发生不
可逆失活，65℃处理10mill便可使其完全失活；通过圆二色谱分析发现抗体
的失活是因其二级结构破坏所导致的。间接竞争ELISA结果表明甲醇的存在会
降低单链抗体的ELISA检测体系的灵敏度。基于该单链抗体建立了玉米中FB，
为8．32kg-1，样品加标回收率为86．74．105．41％，变异系数为9．72．11．62％，
30份玉米污染样品的ELISA检测结果与高效液相色谱法的检测结果具有较好
的相关性(R2=o．969)。
关键词：伏马菌素；单克隆抗体；单链抗体；原核表达；酶联免疫吸附试验；
稳定性；玉米
Fumonisinsarea
metabolites
secondaryfungal
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