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RNA干扰实验问答
来源:生物谷
浏览人数: 19584
吉玛公司提供的siRNA是双链的还是单链的？     
吉玛公司的siRNA是双链的,而且也是按照双链来定价的。
吉玛公司RNA寡核苷酸使用什么纯化方法？
吉玛公司运用国际上通用的HPLC纯化，如果特殊需要可以进行PAGE纯化。
合成RNA寡核苷酸的最大长度是多少？
目前RNA寡核苷酸的最大长度是40碱基。
我们需要提供什么信息用于siRNA的合成？你们可以帮助免费设计吗？
您需要准确地提供siRNA的19个核苷酸的靶序列和悬垂的合成物，或者您也可以提供相应地基因的GeneID或者Accession Number，由我们公司技术人员为您免费设计。
如何选择siRNA的悬垂组成？
悬垂的序列组成是由顾客自行选择的。最近研究表明悬垂的组成在mRNA靶识别和酶解中不是很重要。悬垂可能在形成RISC的过程中起结构的作用。很多研究人员选择dTdT是因为研究表明脱氧核糖核苷能保护siRNA免受酶解。合成序列最重要的是确定靶mRNA的19个碱基的核心结构。
针对人体基因设计的siRNA对其他物种是否也有效？
一般siRNA都具有物种特异性，很少与其他物种有相同的靶位点，所以针对人体基因设计的siRNA不会沉默其他物种的同源序列。然而，也有研究表明siRNA经过特异性设计后能对两个或两个以上的物种有效，这需要仔细进行siRNA设计和生物信息学分析。
你们提供的siRNA是怎样装运的？如果在常温下放置了一个星期，还有效吗？ 
吉玛公司为您提供的siRNA是冻干粉包装的，在常温下运输。这些冻干的样品在室温下能稳定保存2－4个星期，所以放置一个星期不会影响其沉默效果。但我们建议您收到样品后最好保存于-20℃或-70℃有霜冷冻箱中。
在体外实验中，需要多少量的siRNA？
我们建议您用于实验的siRNA的浓度为100nM。1nmol siRNA的量对于一个24孔板或是96孔板的实验已经足够了。
用100nM 的siRNA转染时只得到50%沉默效率，我可以把siRNA的浓度增加到200nM甚至400nM吗？
增加siRNA的浓度一般不能改进沉默效率。高浓度的siRNA将可能导致去靶作用和对细胞的毒性。siRNA的高基因沉默效率来自于合理的设计，在100nM 甚至更低的浓度都可能有75%的沉默效率。另外，低的转染效率会导致低的沉默效率，建议您更进一步优化siRNA的导入条件。
定量RNA的公式是什么？
研究者可以用Beer法则定量RNA：吸光度（260nm）=(摩尔消光系数)*(浓度)*(路径长度,cm)。为了便于理解，等式变为：浓度＝（吸光度,260nm）/[(摩尔消光系数)*(路径长度,cm)]。当使用一个标准的10mm比色皿时，在公式中路径长度这个变量等于1。
6uL浓度为10uM的siRNA溶解液中含有多少ug的siRNA？        
首先计算含有多少nmol的siRNA：
a. 等式: ? nmol = (6 uL)(10 umol/L)；
b. 单位换算: ? nmol = (6 uL)(10 umol/L)(1 L/1,000,000 uL)(1,000 nmol/umol)；
c. 答案: ? nmol = 0.06 nmol。然后利用siRNA的平均分子量（13,300 g/mol）把nmol变为ug：
a. 等式: ? ug = (0.06 nmol)(13,300 g/mol)；
b. 单位换算: ? ug = (0.06nmol)(13,300 g/mol)(1mol/1,000,000,000 nmol)(1,000,000ug/g)；
c. 答案: ? ug = 0.798≈0.8 ug。所以6uL浓度为10uM的siRNA溶解液中含有0.8ug的siRNA。
我需要浓度为20uM的样品，如何计算重悬siRNA缓冲液的量？
样品浓度的计算如下：（siRNA的量，nmol）/（重悬体积，uL）＝样品浓度，umol/L。在解答前应先统一单位，确保单位可以抵消。例如：您购买了20nmol的siRNA，想溶解为50uM的样品。可按以下方法计算重悬缓冲液体积：a. 等式: (20 nmol)/ ? uL = 50 umol/L；b. 解答未知量: ? uL = (20 nmol)(1 L/50 umol)；c. 单位换算: ? uL = (20 nmol)(1 L/50 umol)(1 umol/1,000 nmol)(1,000,000 uL/1 L)；d.答案: ? uL = 400 uL。因此，应该使用400uL缓冲液去重悬20nmol的siRNA，溶解后为50uM的样品。
一定需要阴性对照吗？
是，阴性对照是RNA干扰实验中不可缺少的。由于在超过200 nM的浓度下，siRNA有可能会导致非特异性的压力反应，在实验体系中必需设置阴性对照。它能够帮助我们确认基因表达水平的降低是否是序列特异性的RNAi的结果。由于siRNA的合成方法和工艺以及转染试剂等因素可能导致广泛的基因沉默现象。如果没有阴性对照，研究人员很可能错误地将广泛的、非特异性基因沉默当作由RNAi引起的基因特异性沉默。
常用的阴性对照有哪些类型?
常用的阴性对照大体分为两种，一种是使用通用阴性对照序列，该序列已经被上千篇文章使用；另一类是使用和靶基因siRNA打乱序列的siRNA作为阴性对照，这样的阴性对照和通用序列相比较，一方面是按照定制产品价格合成的，另一方面，由于打乱序列是没有经过验证的序列，有可能会产生off－target现象。因此，除非有非常特殊的要求，最好使用通用序列作为阴性对照。
在阴性对照体系中和实验体系中观察到同样的实验结果，这是什么原因？
这个结果充分说明了设置阴性对照的必要性。该结果表明您所观察到的表型不是序列特异性knockdown产生的表型，您需要降低siRNA的工作浓度。
为什么说阳性对照在RNA干扰实验中很重要？
阳性对照作为一个实验系统检查是很重要的。也就是说，当您看到siRNA阳性对照的预期实验结果时，您能确保在您的实验方法中您的转染、RNA提取物和检测方法是可靠的。通常最好的阳性对照是内在的对照。
你们能提供预先合成的siRNA对照么？
可以。吉玛能提供许多预先合成的用于RNA干扰实验的对照双链。
用于对照的siRNA的最佳浓度是多少？
阳性对照和阴性对照的siRNA的浓度都应该与基因特异性的siRNA的浓度相同。
不同工作浓度下1OD siRNA可以使用多少次
1 OD siRNA可以使用孔数（孔）
100mm dish
在siRNA 上进行标记的最佳位点在哪里？    
反义链的5'端标记会影响siRNA的沉默活性，所以不推荐标记这个位点。在其他三个末端进行标记对沉默活性几乎没有影响。有研究表明正义链的5'端标记是最有效的化学合成位点。
荧光标记的siRNA是不是可以作为良好的对照？如何检测荧光标记的siRNA？
已经有为数不少的实验室研究过荧光标记的siRNA的荧光检测结果和knockdown效率之间的正相关关系。荧光标记双链是最常用的优化转染条件的方法。可以用流式细胞仪或者荧光共聚焦显微镜检测标记的siRNA。
荧光素的最大吸收率和发射率各在哪个波段？
荧光素在495nm处有最大吸收率，在520nm处有最大发射率。
如何筛选转染试剂？
好的转染试剂有以下特点：1、对siRNA有较高的转染率；2、对细胞的毒性小。在mRNA水平检测siRNA导入的效果比用看家基因的siRNA阳性对照检测更为准确。
转染过程中发现大量细胞死亡，我应该如何处理？
如果出现细胞大量死亡，意味着您的转染条件仍然需要优化：
转染条件的优化一般包括以下几个方面：
1. 调整转染试剂的浓度；
2. 在转染后适当的时间内更换无转染试剂的培养液，
3.调整细胞的生长状态；一般处于良好生长状态的细胞对转染试剂就有更好的耐受性；
4.调整转染试剂和siRNA的比例；
如果同一管转染试剂在不同实验中对细胞的毒性有差异，一般说来应该是实验过程本身带来的差异；
如果已经做了以上几项工作，转染效率仍然得不到提高，建议您更换一种转染试剂。
如何将siRNA导入到细胞内？
使用什么样的转染方法，很大程度上取决于您使用的细胞系：
 1.贴壁的、易转染的细胞，我们推荐使用RNAi-mate；
 2.悬浮的或原代的细胞，我们推荐使用电击转化方法；
 3.电击转化效率仍然很低的细胞，需要选择载体系统。
上海吉玛除提供化学合成的siRNA以外，还提供完整的载体系统，请参阅产品资料。
我的课题主要是研究细胞凋亡相关基因，我手上有一些新基因需要使用RNA干扰进行深入研究，我该如何选择对照系统？
用RNAi进行pathway研究，是RNAi主要应用之一。在这样的课题中，对照系统的选择尤其重要。已经发表的和已经验证的siRNA为RNA干扰研究提供了系统性对照。用RNAi进行细胞凋亡相关基因的研究，以往已经有众多的文献报道，可以查阅上海吉玛网站www.吉玛公司.com。
我刚刚开始接触RNA干扰技术，从文献上看，不同细胞应该选用不同的转染试剂，不同的研究目的，应该使用不同的siRNA，我的经费有限，如何有效确定我的研究体系？
在开始RNA干扰研究之初，需要确定以下几个方面：
使用化学合成的siRNA还是使用载体构建shRNA？我们推荐您使用化学合成的方法来筛选有效的目的片段，然后把您筛选出来的目的片段插入到载体，进行抗性筛选，得到稳定表达的细胞株，再做长期研究。
反义核酸和RNAi有何差异？
反义核酸和RNAi从作用原理到使用的范围都有很大差异。这里只能做一个简单的介绍：从原理上说，反义核酸是一段与靶基因配对的单链DNA或类似DNA的片段与靶基因结合，结果阻止靶基因的转录或是翻译，以往的研究表明在反义核酸的研究中，序列的有效性和有效序列的非特异性往往有比较高的正相关性，这就在一定程度上限制了反义核酸的应用。
RNAi的作用机理是双链的RNA进入细胞内，导致靶基因的切割和降解。siRNA的序列可以选择在高度特异针对靶基因的位置，也就为RNAi作为药物研究提供了高效、低副作用的空间。自从RNAi技术问世以来，国外很多专业从事反义核酸研究的公司都纷纷转向RNAi研究， ISIS是一个非常就有代表性的例子。他们认为，如果使用反义核酸可以进行的研究，以及反义核酸可以涉及的研究领域，RNAi均可以毫不示弱的开展，并且应该会得到更加令人满意的结果。
我使用合成的双链DNA克隆载体，但是测序结果不正确，是DNA合成的问题，还是其他问题？
首先，质量良好的、并且是退火状态良好的dsDNA是克隆成功的关键因素。一般情况下，需要挑不止一个克隆测序（通常是2个以上），如果两个克隆的序列都是错误的，并且错误的碱基是相同的,那么基本可以确定是DNA oligo合成的问题. 如果两个克隆的不同碱基发生错误，有可能是合成片段本身的问题，也有可能是克隆过程造成的问题，可以再多挑1~2个克隆测序确证。大多数情况下，两个阳性克隆中，一般至少会有一个克隆是正确的，这种个别碱基在个别分子中的错误是合成和克隆过程9共同造成的，但一般发生的几率较低。
我计划使用RT-PCR检测基因knockdown结果，之前应该注意哪些问题？
我们推荐RT-PCR的引物应该设计在target位置的两侧，而不是同侧。目前已经知道的siRNA介导的基因knockdown机制是RSIC先介导靶mRNA的切割，切割导致靶mRNA的降解，由于切割和降解可能具有不同的时间点，因此，设计于同侧的PCR引物可能导致假阴性结果或knockdown效率的低估。
另外，RT-PCR结果会因为靶基因mRNA降解时间不同、细胞内靶基因mRNA丰度不同而导致假阴性结果，特别对于丰度较高的基因，推荐使用的检测方式包括定量PCR、Northern检测、western检测等。这些方法会更加真实的反映RNAi的结果。
开始体内实验前需要注意什么问题？
体内实验设计包含动物模型的选择、给药途径、剂量和给药次数等等。siRNA使用的数量及浓度主要取决于给药靶点的性质，诸如肿瘤的类型，组织的类型，靶基因表达水平，动物模型个体大小等等，针对不同的研究模型，最好先查阅相关资料。
在体内研究中，最好的给药途径是什么？给药频率是多少？
寡核苷酸可以通过大剂量给药或使用ALZET微小泵持续给药。大剂量给药时要慎重，因为已有研究表明：一些毒性与寡核苷酸反义链的浓度有关，快速给药时可能会导致动物下肢瘫痪或致死，所以给药时要注意观察。很多已发表的论文实验是通过尾静脉给药的。任何给药方式都需要优化，以确保最佳的导入方式和动物的健康。一般拿静脉注射来说，每天注射一到两次，连续注射一到两周。
上海吉玛合成的siRNA是否可以用于动物水平的实验?
上海吉玛 的siRNA经过严格HPLC纯化,已经被用户通过局部注射用于小鼠的体内实验,并且得到满意的实验结果。
小鼠体内实验需要多少siRNA？
迄今为止还没有明确的siRNA体内实验使用量的计算方式，在实验前最好先从文献中查询是否已经有相关的文章发表。对于常规实验，一般使用100 μL的注射体积，浓度为10 to 500 μM。原先用antisense的研究表明，当剂量大于20 mg/kg/day (416 mM)时,会观察到明显的毒性。最好针对您的实验绘制剂量反应曲线。常规情况下，给药剂量可以以 ~5mg/kg/day [~7.7 nmol/day or 100 mM per day]作为优化起点。需要注意的是，这个剂量只是一个预实验的起点，最后的给药剂量取决于动物模型、靶基因、靶组织和给药方式等因素
沉默效果不理想，应该如何处理？
最常见的影响沉默效果的两个原因是：转染效率低和siRNA序列设计的效果不理想。如果您初次使用siRNA或采用了新的细胞系，并发现沉默效果不佳，我们建议您对转染效率进行检测，并选择优化转染条件。如果您已经对实验转染条件进行优化但是问题依然存在，我们建议您换用另一种转染试剂或是采用其他技术，这也许能提高转染效率。如果已经提高了转染效率但是沉默效果仍然未达到要求，可能是因为siRNA序列设计的效果不理想。
为什么使用载体导入shRNA？
在哺乳动物细胞中，RNAi可以通过直接导入特异阻断所选择基因表达的分子而诱导，导致产生基因功能缺失表型。这些分子可以通过化学合成、体外方法制备或者细胞内DNA模板产生。前两种方法只能用于瞬时阻断，可能很难导入难以转染的、不分裂的或者原代细胞类型。通过载体导入pol III 启动子表达的短的发夹RNA（shRNA）扩展了RNAi实验的选择，包括稳定和可诱导表达以及病毒导入。
为什么使用pol III型启动子？
使用pol III型启动子是为了有效表达shRNA。这些pol III型启动子包含了表达RNA上游所有的必要的元件，而且在一个短的多聚胸苷区内终止。一旦shRNA被表达，它被转移出细胞核，在细胞质中被Dicer加工成siRNA。Dicer优先识别由 pol III型启动子产生的shRNA，因为它们不带有5’或者3’两侧连接的序列。siRNA进入RISC复合体中，在哺乳动物细胞中产生RNAi效应。
H1启动子和U6启动子有什么差别？
上海吉玛的supersilencing shRNA 载体分别使用Pol III依赖H1或者U6的启动子。尽管H1和U6是polⅢ 型启动子，然而可能根据使用细胞系的不同，效率有些小的差别。
是否可以插入到真核表达质粒载体中？
可以，这些载体都是真核表达载体，根据国外的经验，质粒载体的knockdown作用一般仅持续一周左右，一周后被down的RNA水平即恢复原有水平，其机制尚未阐明。推荐使用逆转录病毒载体达到稳定转染的效果。
一般设计多少bp的siRNA，以及转录的终止子？
因为人工合成siRNA价格太高，现在经常采用RNAi expression vector，抑制序列一般在19-22bp。使用Pol III启动子时转录终止码为5'-TTTTT-3'，而使用Pol II启动子则为polyA。其实这两种终止码都不能完全避免通读(readthrough)现象的发生。现在RNAi多用前者，是因为其较短，不形成复杂的空间结构；后者因为较长，形成的空间结构可能会对抑制序列发卡结构的形成构成空间阻碍或产生遮挡效应。
如何使用Pol III启动子制备RNAi表达载体
目前发表的RNAi表达载体大多采用3型Pol III启动子，如human/mouse U6启动子等。其中人U6启动子有几个明显的特点：1.具有TATA box，位于-30~-25bp，被Pol III转录；2.在转录起点上游-66~47bp处存在PSE(proximal sequence element)，该元件是snRNA激活因子蛋白复合物的结合位点；3.在-244~-214存在DSE(distal sequence element)；4.启动子下游存在5'-TTTT-3'序列为Pol III提供转录终止信号；5.PSE和DSE之间的距离变化可显著影响转录效率；6.+1位的G对转录效率影响较大。根据这些特点，在使用U6启动子构建RNAi表达载体时，U6启动子的长度最好在300bp左右，尽量不改变PSE和DSE的间距，同时保留TATA box和+1位的G，在下游应有5'-TTTTT-3'序列作为终止信号。另外可以根据需要在启动子上游或终止信号下游设计测序引物序列、酶切位点等等。
如有兴趣可以利用同尾酶设计poly-RNAi表达载体，从而可以观察同时knockdown两个或多个基因表达后产生的效应。若是条件允许，可以对U6启动子进行shuffling，筛选具有特殊用途的突变的Pol III启动子。
为什么RNAi表达载体的克隆有时无法测序？
可能原因是stem的长度刚好和primer相当，所以primer退火时hairpin结构也形成，从而影响测序。分析一下发现它与stem的长度及序列有关。冷泉港推荐改变sense strand上几个碱基，使其在DNA水平不互补，但RNA却能利用G-U互补形成hairpin。
human u6 promoter 表达框，是如何设计的？
human U6 promoter表达框包括human U6 promoter、终止码TTTTT和中间自行设计的抑制序列或抑制序列的发卡结构。从人基因组中可以扩增出U6 promoter，后面的序列全部自己设计。
上海吉玛制药技术有限公司
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RNA干扰抑制丙型肝炎病毒复制的研究进展
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&王新宇 尹有宽 张继明
RNA干扰技术(RNAi)是近两年来产生的新兴生物技术。RNAi作用的基本原理是双链小干扰RNA(siRNA)结合核酶复合物形成RNA诱导的沉默复合体(RISC)，激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录体上并切割mRNA，进而破坏特定目的基因转录产生的mRNA，使其功能沉默。由于siRNA作用的阶段是在目的基因转录成为mRNA以后，即转录后，所以RNAi引导的基因沉默又称转录后基因沉默(PTGS)。首次发现dsRNA能够导致基因沉默的线索来源于秀丽杆线虫的研究.。之后的研究表明，dsRNA也同样能阻止哺乳动物基因的表达，但是siRNA大小必须小于30nt。最近的研究发现，RNAi可在数种不同的哺乳动物细胞中抑制多种病毒的复制。一、目前丙型病毒(HCV)感染及治疗的现状HCV感染是慢性肝病最重要的病因之一，全球约有1．7亿人受到HCV感染，每年有300～4OO万的新发病例 J。我国也是丙型高发地区之一，HCV感染者约占总人【l的3．2％ 。急性HCV感染者中大约有80％的患者会成为慢性持续性感染者，其中20％的患者经历2O～3O年后可进展为，1％ ～5％患者可进展为肝细胞性(HCC)。丙型已成为全球性的公共卫生问题，严重影响了社会和经济的发展。HCV是黄病毒家族中的一员，主要在感染者的肝脏中进行复制。HCV主要有6种基因型，每个型别之间都至少有超过30％的核苷酸序列差异。HCV基因型的原始株1a主要见于美国和北欧地区，而1b最初是在日本发现，现在已经呈世界性的分布。HCV是一条长约9．6kb的正链RNA，包括5 非编码区(5'-UTR)、开放读码框架(ORF)以及3 非编码区(3 一UTR)。由于HCV基因组是一条单链的RNA，其本身就是mRNA，所以HCV天生就是基于RNAi治疗的合适对象。5'-UTR由341个核酸(nt)组成，在这个区域中核酸序列高度保守。而且即使在最相近的HCV亚型之间，其5'-uTR也不全相同。ORF翻译产生一条多肽链，它随后被加工成至少lO种不同的蛋白质，其中包括1种壳(核心)蛋白，2种包膜蛋白(El和E2)和5种非结构蛋白(NS2，NS3，NS4，NSSA和NSSB)。其中NSSB蛋白是一种RNA依赖的RNA多聚酶(RdRP)，它是HCV复制的关键酶。研究已经发现，NSSB协同NS3和NS4A产生一条RNA基因组的负链拷贝，而其又可以产生众多的正链RNA拷贝。目前尚无针对HCV的疫苗。针对HCV感染的经典治疗方案是a干扰素联合利巴韦林，其治疗的病毒学应答率在40％ ～6o％之间。近年经l临床观察认为，聚乙二醇a干扰素与利巴韦林联合治疗为最佳治疗方案，其治疗的病毒学应答率高达60％～ 80％ ，不同的报道由于基因型的差别而有所不同。最近一种NS3蛋白酶的小分子抑制剂(BILN2061)在临床研究中显示出优于干扰素或利巴韦林的疗效，但是该药物作为一种治疗HCV的标准治疗方法还为时尚早。 。在抗HCV的治疗中，一个很大的难题就是如何对付与准种同时存在的变异种群。准种是指在感染个体内循环的既有区别又相互关联的不同的病毒株。病毒的异质性导致了NSSB基因编码的RNA依赖的RNA多聚酶的高错配率，而后者对于HCV的复制有着重要的地位。研究发现，5'-UTR比HCV的其它基因有着更高的保守性，如在HCV 1b 基因型的不同准种中，3O至170nt的序列是卜分保守的 。由于RNAi技术对于siRNA和靶序列之间的单个碱基错配都非常敏感 ，看来5 ．UTR是针对HCV进行RNAi的最佳靶位。二、RNAi抗HCV的研究缺乏体外细胞培养模型一直是HCV研究的一个主要障碍。但最近，HCV亚基因组的复制子系统已经被开发出来 ’ 。这些复制子已经适应『突变，而且能够在细胞培养中有效的复制。它们缺少结构基因，因此不能产生有活性的病毒颗粒。利用亚基因HCV复制子系统，最近使用合成的双链RNA(dsRNA)已经成功抑制了HCV RNA在培养细胞中的复制。针对HCV基因组的特异性靶位见表l。Seo等 使用一种HCV RNA 基因组的复制子进行了RNAi研究，复制子中包含了一段新霉素耐药基因用于细胞株的筛选，一段荧光素酶基因用于监测复制子表达的水平。研究发现，当使用针对5'-UTR或者是荧光素酶的特异性siRNA转染细胞后，荧光素酶的水平下降了85％ ～90％ ，而非特异性的对照组siRNA和与荧光素酶靶位有3个核苷酸错配的siRNA则根本不能减少荧光素酶的水平。为了排除siRNA细胞毒性导致荧光素酶活性减低的可能，研究者同时还监测了细胞ATP水平，发现转染和没有转染的细胞均没有变化。Kapadia等 使用了一种包含HCV基因型1b型亚基因的复制子系统，siRNA针对的靶位是NS3和NSSB，在转染2 d后利用实时PCR测定，发现RNA水平分别有5．7和8．3倍的抑制。通过Western印迹法检测NS3和NSSB的蛋白水平，转染2 d后发现并没有变化，但是4 d后，开始出现了下降。这个现象提示这些蛋白质代谢的半衰期相当长。他们还比较了RNAi和IFN对于HCV的抗病毒效果，发现siRNA相比IFN，其抑制病毒复制的能力要强3倍，而且siRNA的抗病毒效应是独立于IFN的。& 表l 在已经进行的沉默HCV的研究中所采用的小靶位RandaU等 使用了一个相类似的RNA复制子系统，siRNA靶位针对5 UTR，利用实时PCR检测HCV RNA的水平，发现转染12 h后病毒水平下降5倍，转染96 h后病毒下降80倍。HCV RNA的水平在8 d后依然能够检测出。绝大多数的细胞在使用针对NS5A的抗体进行免疫荧光检测时，依然能够检测到蛋白。在siRNA处理过的细胞中对G418发生耐药的克隆明显减少，这些证据支持siRNA介导了在这个系统中抑制HCVRNA复制的过程。这项研究也显示了利用RNAi抑制HCV复制的高度特异性。当siRNA仅和靶序列有3nt的差异，就不能抑制病毒复制。Wilson等 选择了两条siRNA进行研究，靶位均为NS5B区，在转染72 h后进行Northern印迹法分析，发现HCV RNA的水平下降了大约90％。同时，他们还应用免疫印迹的方法检测了NS3和NS5B区编码的非结构蛋白的表达水平，结果均为阴性。此后，他们又采用r一个基于质粒的表达系统来合成siRNA，这个质粒系统可以分别表达siRNA的正义链和反义链。他们利用电穿孔的方法将siRNA和HCV亚基因组同时导人细胞。3周后与对照组相比，发现G418耐药的克隆在siRNA表达的细胞中减少了70％ 。研究提示，通过RNAi长期抑制基因表达可以用这种方法来实现。Yokota等. 选择的5个靶位均是针对5 ．u rR区。他们发现，其中最有效的siRNA是siRNA．331，它在浓度为2．5 nmol时就成功抑制了81％的HCV复制，当浓度提高到125 mmol时，抑制的效率达到了94％。在此基础上，他们构建了一个DNA载体用以表达siRNA．331。他们分别使用了两种方式来构建载体，一种是串联的形式，把正义链和反义链分别置于U6启动子的下游，另一种是茎环形式的载体，在这种形式中正义链的3末端和反义链的5 末端通过一段9 nt的环状序列相连，同样也置于U6启动子的下游。两种形式的siRNA表达载体都抑制了HCV复制，但茎环结构与串联结构相比效率更高。Radhakrishnan等 ‘利用整合在VA1融合结构中的复制子，通过持续表达短发卡样RNA(shRNA)，成功地完全抑制了细胞中的HCV，这个结果是通过RT—PCR的方法检测到的。VA1是一种腺病毒基因，先前曾经应用于核酶表达的研究 ，最近也用来表达shRNA ，但两者都只是在抗HIV的研究中采用，靶位也都是内源基因CCR5。VA1．shRNA融合的转录子主要存在于细胞质中 ，而对于被认为主要在细胞质中起作用的RNAi，其无疑占有优势。Sen等 在人类细胞系(HepG2)中针对HCV基因型1a型的NS5A区设计r siRNA，成功抑制了NS5A RNA和蛋白的表达。该研究通过内源性的a肌动蛋白和dsRNA激活的丝氨酸色氨酸激酶作为参照进行检测，发现两者的量并没有相应地减少，从而证实了siRNA的病毒抑制作用。研究还发现，siRNA还有效地抑制了NS5A介导激活的IL_8启动子。Kronke等“ 为了避免基因型之间以及准种之间的差异而造成的RNAi失败，制定了两种不同的方案来进行研究。首先，他们使用lr Dicer酶产生siRNA，这样产生的不同siRNA针对了病毒基因组的不同区域，从而避免了siRNA高度特异性造成的局限，并且成功地抑制了HCV复制子在细胞内的复制。此后，他们又使用逆转录病毒作为载体来制造shRNA，一共选择了l2个区域，其中大部分都位于5 V rR这一高度保守的区域。研究发现，只有在第Ⅳ域及其附近选择的靶位才能够比较理想地抑制病毒复制子的复制。Takigawa等 也使用了质粒表达(pAVU6+27)和含有pAVU6+27表达框架的慢病毒来进行RNAi的研究，他们发现上述的两种方法对于HCV．1b型的NS3和NS5B靶位的RNAi都取得了比较理想的效果，而且这两个区域同5 UTR相比都取得了更加好的抑制效果。这些研究结果都表明，利用RNA在复制子系统中抑制HCV是可行的，而且在这个系统中靶位的选择也并不困难。研究者还提出了这样一个问题，HCV感染的靶细胞含有RNAi所需要的所有组分，但是在正常的感染过程中，HCV为何并不能诱导RNAi反应。一个可能的解释是，在体内，HCV抑制了依赖Dicer的长dsRNA裂解成为大约2lnt大小siRNA这一过程 ’ 。RNAi也已经有效地沉默了成年小鼠体内HCV NS5B基因的表达。这个研究中HCV的NS5B基因与荧光素酶基因融合，并在小鼠的肝脏中表达 。设计针对HCV NS5B区的siRNA或者是siRNA表达质粒通过水动力转染的方法导入小鼠的肝脏，然后检测荧光素酶的量。化学合成的siRNA抑制了大约75％的荧光素酶表达，而基于质粒的siRNA成功抑制了98％ 的荧光素酶 。三、RNAi遇到的困难及未来初步研究表明，基于RNAi的抗HCV治疗是有效的，然而依然有很多问题等待解决。其中最突出的问题包括给药的方式、耐药与病毒逃避 。RNAi对于靶区域的错配有着极高的敏感性。研究显示，即使是一个碱基的错配也可能导致RNAi活性的丧失 ，因此RNAi用于治疗时，另一个严峻的问题是病毒只要发生一个碱基的变异便能产生耐药。在HCV方面，这个问题显得尤为突出，HCV中RdRP由于缺乏校读功能，当其复制时会产生大量的错误。这类问题也已经在脊髓灰质炎病毒RNAi的研究中观察到“ 。近来在H1V的研究中这类问题出现得更多 20]。另一个可能出现的问题是当不能完全抑制病毒时，残余的病毒可能会反跳。以慢性丙型患者为例，通常患者血液中的病毒载量在l 05～l0 基因组拷贝／ml之间，也就是说，即使RNAi治疗成功地抑制了90％的病毒RNA，残余的病毒依旧足够利用靶区域的突变而产生耐药。这样，同时选择多个靶位的混合siRNA或者RNAi协同如核酶以及反义核酸技术作为一种联合治疗的手段来对抗病毒可能会取得更好的疗效。总之，RNAi作为一种崭新的抗病毒技术，在已经进行的体外和体内研究中得到了比较理想的效果，但是目前离临床应用还有一定差距，还需要研究者在有效性、持久性和安全性等方面进行更深入的研究。& 参 考 文 献Fire A， Xu S， Montgomery MK，et a1． Potent and specific genetic interference by double·stranded RNA in Caenorhabditis elegans．Nature，l998。391：806．81 1．Global surveillance and control of hepatitis C ． Report of a W HO consultation organized in collaboration with the viral hepatitis prevention board，Antwerp，Belgium．J Viral Hepat，—47．Laman：e D，Anderson PC，Bailey M ，et a1．An NS3 protease inhibitor wi thantiviral efects in humans infected with hepatitis C virus．Nature，：l86．189．Soler M，Pellerin M，Malnou C E，et a1．Quasispecies heterogeneity and&Chinese I4epatology，Mar 2005，Vol 10，No．1 constraints on the evolution of the 5 noncoding region of hepatitis C virus(HCV)：relationship with HCV resistance to 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& 中华肝脏2005年3月第10卷第一期
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