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琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝
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琼脂糖凝胶电泳
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3秒自动关闭窗口导读：聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片段一、实验目的，1．学习PCR基因扩增的基本原理和操作方法，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，四、操作方法，4．电泳检测扩增结果，防止出现非特异性扩增产物，PCR扩增产物检测分析琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，才能确定是否真正得到了准确可靠的预期特定扩增产物，凝胶电泳是检测PCR产物常用和最简便的方法，能判断产物的大小，有助于产物的鉴定，前者主要用于D 聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片段 一、实验目的 1．学习PCR基因扩增的基本原理和操作方法。 2．理解PCR基因扩增在分子生物实验技术中的重要性。 3．了解引物设计的一般要求。
二、实验原理 多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR )：原理类似于DNA的变性和复制过程，即在高温（93-95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～65℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。
PCR反应系统的组成：引物、寡核苷酸、Taq DNA聚合酶、模板DNA、缓冲液。
三、试剂与器材 1、试剂10×EX Taq Buffer (Mg2+ plus) ；dNTP Mixture (各2.5 mM)
TaKaRa EX Taq聚合酶5U/μl；模板DNA (已预先稀释)；上、下游引物混合物（已预先稀释） 2、器材 微量移液器及吸头，硅烷化的PCR小管，PCR扩增仪(PTC－100)，台式高速冷冻离心机。
四、操作方法 1．编辑设定PCR扩增程序。 2．PCR管中加入灭菌水、缓冲液、四种dNTP、引物、模板、聚合酶。 3．运行程序进行扩增。 4．电泳检测扩增结果。
五、关键步骤与注意事项 1．试剂湿热灭菌，小管分装，防止污染。2．所用的PCR扩增管、微量移液器的吸头都要灭菌。3．试剂混合时要在超净工作台中，戴上一次性手套，防止污染；要离心混匀。 4．每次反应都要设置阴性和阳性对照。5．根据引物的融解温度设定退火温度，防止出现非特异性扩增产物。
六、思考题 1、PCR进行的的基本条件是什么？2、PCR每一循环有哪几个步骤组成？ 3、影响PCR扩增的因素有哪些？4、优化那些条件可以最大限度的减少非特异性扩增？
PCR扩增产物检测分析琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 PCR扩增反应完成之后，必须通过严格的鉴定，才能确定是否真正得到了准确可靠的预期特定扩增产物。凝胶电泳是检测PCR产物常用和最简便的方法，能判断产物的大小，有助于产物的鉴定。凝胶电泳常用的有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，前者主要用于DNA片段大于100bp者，后者主要用来检测小片段DNA。
1．琼脂糖凝胶电泳
这是实验室最常用的方法，简便易行，只需少量DNA即可进行实验。其原理是不同大小的DNA分子通过琼脂糖凝胶时，由于泳动速度不同而被分离，经溴化乙锭（EB）染色，在紫外光照射下DNA分子发出荧光而判定其分子的大小。
用于电泳检测PCR产物的琼脂糖浓度常为1%―2%，应该使用纯度高的电泳纯级琼脂糖，这种琼脂糖已除去了荧光抑制剂及核酸酶等杂质。
（1）制胶 ：琼脂糖凝胶厚度约为3~5mm。过薄则加样孔样品会溢出来，过厚观察时荧光穿透不强以至有些小片段DNA带型不易分辨。如配制2%凝胶100ml，称取琼脂糖2g于三角瓶中，加入100ml 0.5×TBE液，微波炉加热2-5min，使琼脂糖完全溶解（注意不要暴沸），置室温等温度下降至60℃时，加入终浓度0.5μg/ml的EB液，充分混匀后倒板（注意排除气体）。
（2）加样和电泳：上样时一般取PCR反应液5~10μl，加入3μl溴酚兰液，充分混匀，加入凝胶加样孔中。电泳仪可用一般稳压可调中压电泳仪，电泳工作液为0.5×TBE液，接通电源，使样品由负极向正极移动。60-100V恒压电泳约30-60分钟。
（3）检测：将凝胶板放在紫外透射仪的石英玻璃台上进行检测，DNA产物与荧光染料EB形成橙黄色荧光复合物。观察各泳道是否有橙黄色荧光带出现，并与扩增时所设的阳性对照比较，判断阳性或阴性结果。也可在电泳时以标准分子量作对照，判断其扩增片段是否与设计的大小相一致。
2、聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖凝胶电泳繁琐，但在引物纯化、PCR扩增指纹图、多重PCR扩增、PCR扩增产物的酶切限制性长度多态性分析时常用到。
它与琼脂糖凝胶电泳比较具有如下优点： ①分辨率很强，可达1bp； ②能装载的DNA量大，达每孔10μgDNA； ③回收的DNA纯度高； ④其银染法的灵敏度较琼脂糖中EB染色法高2~5倍； ⑤避免了EB迅速退色的弱点，银染的凝胶干燥后可长期保存。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨DNA片段的有效范围：
在两块制胶玻璃板中间放上垫片，放上制胶架，拧紧制胶螺丝夹紧玻璃板。
制备适量合适浓度的凝胶，使之略多于胶板。制备100μl体积凝胶的配制方法见下表。
不同浓度（%）聚丙酰胺凝胶的制法：
试剂 30%丙烯酰胺溶液（ml） 水（ml） 5×TBE（ml） 10%过硫酸铵（ml） TEMED（ml） 3.5% 11.6 67.7 20 0.7 0.035 5% 16.6 62.7 20 0.7 0.035 8% 26.6 26.6 20 0.7 0.035 12% 40 40 20 0.7 0.035 20% 66.6 66.6 20 0.7 0.035 在加入TEMED和10%过硫酸铵后，立即混匀，倒入放置45℃角的玻璃板内，完全注满（注意不要有气泡），迅速将玻璃板放置水平位置。立即放成型梳子于腔顶并夹紧，待30-60分钟胶聚合后，取下胶板，放入电泳槽中固定。
（2）加样和电泳
上下槽中加入1×TBE电泳缓冲液，溢过加样孔，拔出梳子，排出加样孔中的气泡，将PCR产物或限制性内切酶消化产物2与1上样缓冲液混匀，用微量注射器加入加样孔底部，使样品在孔底成一层，两侧孔中加入标准分子量的DNA Marker。
以2-10V/cm电压电泳，电泳时间足够长，使片断足以分开，待指示剂走到适宜位置时关闭电源，将胶片取出。
分开两块玻璃板，将凝胶片放入100ml银染固定液中振荡15min，双蒸水洗3次，每次2min，然后将凝胶片转入100ml 0.2%的AgNO3中于摇床上染色约10min，吸去AgNO3液，用双蒸水洗3次，每次30s，加入100ml显色液约7-10min，待DNA带显示清除时，吸去显色液，加入固定液Na2CO3，静置2-3min，取出凝胶观察。
PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。常见问题如下：
一、假阴性，不出现扩增条带
PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质 ；
②模板中含有Taq酶抑制剂
③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白
④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚
⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增
对策为：①选定一个好的引物合成单位
②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出 现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效
④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2 浓度：Mg2 离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
二、假阳性
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
三、出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现。
原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体
二是Mg2 离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
对策：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。
四、出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。
原因：酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2 浓度过高，退火温度过低，循环次数过多。
对策：1、减少酶量，或调换另一来源的酶
2、减少dNTP的浓度。适当降低Mg2 浓度。增加模板量，减少循环次数。
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