如何在NCBI上查找基因的启动子序列
　　表观遗传学是近几年生物学研究进展最为迅速的一门学科。而DNA甲基化作为表观遗传学最热门的研究方向，进展速度甚为惊人。
　　从绘制单碱基精度的人类DNA甲基化图谱到发现CpG岛海滩现象，再到植物中去甲基化调控机制的研究，研究者对DNA甲基化的关注度不断增加。如何更好地利用这些技术手段，应用于自己的个性化研究，是每个科研工作者最为关心的问题。很多老师虽然对此极感兴趣，却感觉有点无从下手。
　　通常大部分研究都集中在基因的启动子区，那么如何查询基因的启动子序列呢？
　　首先，打开NCBI官网：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
　　然后在搜索框中找到“gene”,并输入想要查找的基因号，例如（at1g11180）,然后“search”
　　在搜索结果中，找到如下图中的“MapViewer”，查看基因在染色体中的位置
　　下一步的结果就能够查看该基因的位置，还有很多其他的信息，找到右下角的
　　你可以查看到三种形式的序列：Graphics 、FASTA和GenBank，推荐使用后者，因为可以看到对序列的注释，可以清楚的看到哪是基因，哪是启动子，哪是CDS等。点击“GenBank”查看；
　　由下图可以看出，该基因序列范围：，mRNA范围： (,,,,,)，CDS范围： (,,,, ,)，基因中的外显子不是连续的，因此CDS也不是连续的；
　　CDS上游的序列就是该基因启动子部分，而具体的启动子的长度是不一样的，可以根据需要进行选择。如果觉得上游的序列不够长，可以在右上角设定显示的碱基的范围，从而获得足够长度的序列（通常我们选择上游2kb区域）；
　　值得注意的是，该基因编码方向为→
　　如果是上图蓝色框中右边方向←，则选择序列下游2kb序列。
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1 材料与方法
1.1 材料与试剂
样品采自洛阳神州牡丹园，经神州牡丹园总园艺师付正林鉴定为芍药Paeonia lactiflora Pall.。DNase I kit、PrimerScript II 1st strand cDNA synthesis kit、DNA凝胶回收试剂盒、克隆载体pMD18-T、DNALigation Kit Ver.2.1、限制性内切酶BamH I和HindIII、DL 2000 DNA Marker、蛋白质Marker、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）均购自宝生物工程（大连）有限公司；高保真KOD-PlusDNA聚合酶为日本TOYOBO公司产品；大肠杆菌菌株DH5α和BL21（DE3）及原核表达载体pET-32a (+) 由本实验室保存；其余试剂均为国产或进口分析纯。
1.2 引物设计
根据本课题组克隆的PlActin cDNA序列（JX310002）及原核表达载体pET-32a (+) 的多克隆位点序列，应用Primer Premier 5.0软件设计一对特异性PCR引物用于扩增PlActin基因的编码区序列（coding sequences，CDS），其中上下游引物分别插入了BamH I和HindIII酶切位点，引物5’-CGCGGATCCATGGCCGATGCTGAGGATATCC-3’和5’-CCCAAGCTTTTAAAAGCACTTCCTGTGG- ACA-3’由北京华大基因研究中心合成。
1.3 PlActin基因的RT-PCR扩增、克隆及测序
芍药花瓣总RNA提取、纯化及cDNA合成参照文献方法进行[]。RT-PCR扩增总体积为50 μL，含5μL 10×缓冲液、5 μL 2.0 mmol/L each dNTP、4 μL 25 mmol/L MgCl2、10 pmol/μL上下游引物各1.5 μL、5 μL cDNA、1 μL KOD-plus DNA聚合酶、27 μL ddH2O。PCR扩增程序为94 ℃预变性2min，随后98 ℃、10s，54 ℃、30s，68 ℃、40s，共35个循环，后进行72 ℃、7min延伸；1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。
目的基因经纯化后与pMD18-T载体连接并转化大肠杆菌DH5α，应用菌落PCR、质粒PCR及BamH I和Hind III双酶切鉴定出阳性重组子，并进一步进行序列测定验证。
1.4 PlActin基因原核表达载体的构建
应用限制性内切酶BamH I和Hind III对阳性重组子pMD18-T-PlActin和原核表达空载体pET-32a (+)进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳后用凝胶回收试剂盒纯化目的基因PlActin和原核表达空载体pET-32a (+)，然后将二者用连接试剂盒连接并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在含有100 μg/mL 氨苄青霉素（Amp）试剂的固体LB平板上进行过夜培养。经菌落PCR初步检测后，挑取阳性单菌落过夜培养，提取质粒进行质粒PCR检测，再进一步用BamH I和Hind III双酶切鉴定，鉴定出的阳性重组子pET-32a (+)-PlActin转化DE3菌株感受态细胞，获得基因表达工程菌。
1.5 PlActin重组蛋白的原核表达、电泳检测及干胶制备
挑取1个基因表达工程菌的单菌落，接种在5 mL含100μg/mL Amp的LB培养基中，37 ℃过夜培养；吸取1 mL过夜培养的表达工程菌菌液，加入49 mL含100 μg/mL Amp的LB培养基中，37 ℃培养至菌体密度（以600 nm处吸光度表示，A600）达0.6，在LB培养基中加入IPTG，使其终浓度为0.6 mmol/L。继续培养4h，取1.5 mL菌液，10000 r/min离心2 min，收获菌体用于SDS-PAGE电泳检测。
用200 μL 2×SDS上样缓冲液悬浮菌体细胞，100 ℃煮沸5min；取10 μL用于电泳检测。SDS-PAGE电泳的浓缩胶为4%、分离胶为10%，上样后60 mA恒流1 h。电泳完毕后剥胶，在60 ℃水浴中用考马斯亮蓝R250染色30min；60 ℃水浴中脱色3 h，待完全脱色后制备干胶。将SDS-PAGE电泳凝胶和2张比电泳玻璃板略大的玻璃纸置于含微量甘油的去离子水中浸泡约5 min，然后取一张玻璃纸置于玻璃板上，赶尽气泡，将SDS-PAGE电泳凝胶置于玻璃纸上，其上再放置一张玻璃纸，赶尽气泡，将玻璃纸的多余部分包裹在玻璃板放置凝胶的背面，置于室温下阴干3～5 d，待胶完全干燥后扫描干胶并永久保存。
1.6 IPTG浓度对PlActin重组蛋白表达量的影响
当扩大培养的50 mL基因工程菌菌体密度达0.6时，添加IPTG至终浓度分别达0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mmol/L。37 ℃诱导表达4 h，取出1.5 mL菌液用于SDS-PAGE电泳，分析基因工程菌总蛋白中重组Actin蛋白的表达量。
1.7 菌体密度对PlActin重组蛋白表达量的影响
当扩大培养的50mL基因工程菌菌体密度达0.1～1.1时添加IPTG至终浓度为0.4 mmol/L，37 ℃诱导表达4 h，取出1.5 mL菌液用于SDS-PAGE电泳，分析基因工程菌总蛋白中重组Actin蛋白的表达量。
1.8 诱导时间对PlActin重组蛋白表达量的影响
当扩大培养的50 mL基因工程菌菌体密度达0.6时，加入IPTG至终浓度为0.4 mmol/L诱导，分别在2、5、10、20、40min及1、2、4 h时各取出1.5 mL菌液用于SDS-PAGE电泳，分析基因工程菌总蛋白中重组Actin蛋白的表达量。
2 结果与分析
2.1 PlActin基因的亚克隆及测序
应用RT-PCR技术成功扩增出了PlActin基因PCR产物（图 1-A），PCR产物大小与预期值一致，命名为PlActin。PCR产物经纯化后与克隆载体pMD18-T连接，经菌落PCR和质粒PCR初筛后的阳性重组子pMD18-T-PlActin进一步用BamH I和HindIII双酶切鉴定，双酶切电泳结果与预期结果完全一致（图 1-B），表明成功亚克隆了PlActin基因。测序结果表明PlActin与PlActincDNA序列（JX310002）完全一致，且CDS上下游成功插入了BamH I（GGATCC）和Hind III（AAGCTT）酶切位点，能够用于下一步PlActin基因原核表达载体的构建。
1-PlActin的RT-PCR扩增2～3-阳性重组子pMD18-T-PlActin/BamH I＋HindIII双酶切鉴定M-Marker
1-RT-PCR amplification of PlActin 2—3-characterization of positive recombinant by BamH I and Hind IIIM-Marker
图 1 PlActin的RT-PCR扩增 (A) 及阳性重组子pMD18- T-PlActin/BamH I＋Hind III双酶切鉴定 (B)Fig.1 RT-PCR amplification of PlActin (A) and characterization of positive recombinant by BamH I and Hind III (B)
2.2 原核表达载体pET-32a (+)-PlActin的构建
pMD18-T-PlActin和pET-32a (+) 经BamH I和Hind III双酶切后，回收目的基因PlActin和空载体，纯度及浓度（图 2-A、B）达到连接的要求，可以用于下一步的连接反应。二者的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经菌落PCR初筛后，提取质粒进行质粒PCR检测（图 3-A），再进一步用
BamH I和Hind III双酶切鉴定（图 3-B），电泳结果表明相对分子质量较大的酶切产物与原核表达载体大小一致，相对分子质量较小的酶切产物与目的基因PlActin的大小一致，表明原核表达载体pET-32a (+)-PlActin构建成功。
1-原核表达空载的纯化回收 2-目的基因PlActin的纯化回收
1-purification of empty prokaryotic expression vector 2-purificationof objective gene PlActin
图 2 原核表达空载体及目的基因的纯化回收Fig.2 Purification of empty prokaryotic expression vector and objective gene PlActin
1～2-原核表达载体的质粒PCR鉴定 3～4-原核表达载体的BamH I和Hind III双酶切鉴定
1—2-plasmid PCR characterization of prokaryotic expression vector 3—4-double enzymes digestion ofprokaryotic expression vector by BamH I + Hind III
图 3 原核表达载体的质粒PCR (A) 及BamH I和Hind III双酶切鉴定 (B)Fig.3 Plasmid PCR characterization(A) and double enzymes digestion of prokaryotic expression vector (B)
2.3 PlActin基因在大肠杆菌中的诱导表达
鉴定出的阳性重组子pET-32a (+)-PlActin转化DE3菌株感受态细胞，获得基因表达工程菌。挑取1个表达工程菌单菌落，37 ℃过夜培养后按2%体积比扩大培养，待菌体密度达0.6，在LB培养基中加入IPTG，使其终浓度为0.6 mmol/L。继续培养4 h，SDS-PAGE电泳检测诱导结果。由图 4可以看出，与未诱导的阴性对照相比，诱导的工程菌总蛋白中增加了一个相对分子质量约为60 000的新蛋白，表明PlActin重组蛋白诱导表达成功。
1-阴性对照 2-IPTG诱导
1-notinduced 2-IPTG induced
图 4 SDS-PAGE电泳检测PlActin基因在大肠杆菌中的表达Fig.4 Expression of PlActin in E. coli detected by SDS-PAGE
2.4 IPTG浓度对PlActin重组蛋白表达量的影响
从图 5可以看出，设置的所有IPTG浓度均能有效诱导PlActin重组蛋白的表达。从节约成本的角度选择诱导剂IPTG的浓度为0.1mmol/L。
1-阴性对照2～10-IPTG浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mmol/L
1-not induced 2—10-IPTG at concentration of 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, and 0.9 mmol/L
图 5 IPTG浓度对PlActin重组蛋白表达量的影响 Fig.5 IPTG concentration on effect of expression level of recombinant Actin
2.5 诱导起始菌体密度对PlActin重组蛋白表达量的影响
从图 6可以看出，当诱导时宿主菌菌体密度在0.1～1.1时，PlActin重组蛋白均可高效表达，当宿主菌菌体密度值从0.1增加至0.4时，重组Actin蛋白的表达量也相应增加，当宿主菌菌体密度从0.4增加至1.2时，Actin蛋白表达量基本保持恒定。因此，优化的诱导起始菌体密度为0.4～0.6。
1-阴性对照2～13-A600值分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2
1-negative control 2—13-A600 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, and 1.2
图 6 诱导起始菌体密度对PlActin重组蛋白表达量的影响Fig.6 Bacteria density on effect of expression level of recombinant Actin
2.6 诱导时间对PlActin重组蛋白表达量的影响
从图 7可以看出，加入IPTG诱导2 min后，PlActin重组蛋白即高效表达；在检测的2 min至4 h内，其表达量占宿主菌总蛋白的比例基本保持一致。但由于培养时间越长，收获的宿主菌相对更多，因此优化的诱导表达时间为4 h。由于PlActin重组蛋白在2 min内即高效表达，推测该重组蛋白的主要形式为包涵体。
1-阴性对照2-2 min 3-5 min 4-10 min 5-20 min 6-40 min 7-1 h8- 2h 9-4 h
1-negative control 2-2 min 3-5 min 4-10 min5-20 min 6-40 min 7-1 h 8-2 h 9-4 h
图 7 诱导时间对PlActin重组蛋白表达量的影响
Fig.7 Induced time on effect of expression level of recombinant Actin
当蛋白质在细菌中高效表达时，经常会形成包涵体。不溶性包涵体的形成虽然为后续的分离纯化带来方便，但通常要采用强变性剂才能溶解包涵体，溶解后还需复性才能回收正确折叠的重组蛋白。通常先用尿素、Triton X-100、EDTA等洗去包涵体中的杂质，再用尿素等变性剂溶解包涵体。在变性剂溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态[]。一般来说，包涵体中含有超过50%的重组蛋白，在优化条件下重组蛋白可占包涵体的90%以上[]。溶解的包涵体复性的第1步是透析或稀释除去变性剂。为了降低蛋白质重折叠的进程，复性通常在低浓度蛋白条件下进行[]。
通过体外研究某一种蛋白的理化特性进而推测其在体内的理化过程以及生理功能是一种常用的研究手段[]。本研究亚克隆了PlActin基因，在其CDS上下游成功插入了BamH I（GGATCC）和Hind III（AAGCTT）酶切位点；基于鉴定的重组子pMD18-T-PlActin构建了PlActin原核表达载体pET-32a (+)-PlActin并转化DE3受体细胞获得了基因表达工程菌；获得的PlActin基因原核高效表达体系为最优IPTG浓度为0.1 mmol/L、菌体诱导起始密度为0.4～0.6、诱导表达4 h。pET-32a (+) 载体上含有Trx（硫氧还蛋白）标签、S（RNase S前15个氨基酸）标签和His标签，已经建立的PlActin原核高效表达体系为下一步基于变复性和亲和色谱技术纯化PlActin重组蛋白及其理化性质的鉴定奠定了一定基础。
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Clark E D B. Refolding of recombinant proteins [J]..[发明专利]一种检测ETV6基因CDS区域的引物和方法在审
申请/专利权人：
公开/公告号：CNA
发明/设计人：;;
公开/公告日：
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【说明书】：
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。实施例1特异性扩增引物、测序引物和检测试剂盒一种检测ETV6基因CDS区域的特异性PCR扩增引物包括：SEQNO1：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAGAGATGCTGGAAGAAAC；SEQNO2：AACAGCTATGACCATGCCCAAATAATTTCCTGCGAACA；SEQNO3：TGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTTCATTGTCTC；SEQNO4：AACAGCTATGACCATGCAGCGTGGCGAAGTCCTGTG；SEQNO5：TGTAAAACGACGGCCAGTGGCTCTTGAGATGTGGAGACT；SEQNO6：AACAGCTATGACCATGCATAATCTTCCTTCAACTTCCTTCC；SEQNO7：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGCTCCGTAGATCGTTGTTG；SEQNO8：AACAGCTATGACCATGTGAACTTACACGAAGAAGACCAG；SEQNO9：TGTAAAACGACGGCCAGTCATTTACCGCCTGTAGAG；SEQNO10：AACAGCTATGACCATGGAGAGCCTTGGAGGGCGCCTA；SEQNO11：TGTAAAACGACGGCCAGTAGTTAGACAATCAGTCAACCCAAG；SEQNO12：AACAGCTATGACCATGGAAGACAGACGATTATCCTCCAAT；SEQNO13：TGTAAAACGACGGCCAGTGCAGCCGATTAGCAGGTAG；SEQNO14：AACAGCTATGACCATGTCCGATAGGCAGGTAGAGATC；SEQNO15：TGTAAAACGACGGCCAGTACCTCCTCCACTTCTTCTTCC；SEQNO16：AACAGCTATGACCATGCCTGTGCTGGGTAGTTTGTC。对ETV6基因CDS区域的特异性PCR扩增产物进行测序的测序引物序列如下：测序-F：TGTAAAACGACGGCCAGT测序-R：AACAGCTATGACCATG。检测ETV6基因CDS区域的检测试剂盒包括：(i)DNA提取试剂；(ii)PCR扩增反应试剂，其中ETV6基因CDS区域的特异性PCR扩增引物序列包括SEQNO1至SEQNO16。(iii)测序反应试剂，其中测序引物序列包括测序-F和测序-R。实施例2：检测方法检测ETV6基因CDS区域方法包括如下步骤：(i)提取样本中的DNA(ii)以DNA为模板，依据所述的特异性扩增引物(SEQNO1～SEQNO16)、进行CDS区扩增；(iii)使用测序引物对PCR产物进行测序反应，并将得到的产物上机测序，最终对比参考序列，并依据测序图谱，获得样本ETV6的CDS区序列信息。1.PCR扩增方法如下：一例样本共进行8个PCR反应，每个PCR体系均为20ul。详细配制如下表：上游引物为SEQNO1、SEQNO3、SEQNO5、SEQNO7、SEQNO9、SEQNO11、SEQNO13、SEQNO15；上游引物为SEQNO2、SEQNO4、SEQNO6、SEQNO8、SEQNO10、SEQNO12、SEQNO14、SEQNO16。PCR反应程序：94℃5min预变性；98℃10s，60℃30s，68℃30s，40个循环；68℃5min。2.PCR产物酶纯化。一例样本的酶纯化体系为11ul：小牛碱性磷酸酶(CIP)0.1uL，核酸内切酶ExoⅠ0.5uL，灭菌水1.4uL，第二轮PCR产物9ul。酶纯化反应：37℃，50min孵育；95℃，5min变性；4℃保存。3.样本进行测序反应。一例样本的测序体系为5ul：BigDye1ul、测序引物1ul、灭菌水2ul、酶纯化产物1ul。测序反应条件为：4.测序反应产物进行酒精纯化向每管中加入2ul的125mMEDTA，涡旋混匀，静置5min；然后加入15ul无水乙醇，13500rpm离心30min；倒置除掉上清，加入50ul冰冻的75％乙醇，13500rpm离心15min；倒置除掉上清，并放置于100℃金属浴上以完全挥发酒精；加入10ul的Hi-DiTMFormamide，震荡离心后将产物转至96孔板；95℃5min变性后，将96孔板置于ABI3500进行测序。5.结果分析具体为：参考如图1所示的ETV6的CDS标准序列，使用SeqMan软件判断样本的CDS序列信息。实施例3选取4例正常人的外周血进行ETV6的CDS区域PCR扩增。步骤如下：(i)提取样本中的DNA(ii)以DNA为模板，依据所述的特异性扩增引物(SEQNO1～SEQNO16)、进行CDS区PCR扩增；PCR扩增方法如下：一例样本共进行8个PCR反应，每个PCR体系均为20ul。详细配制如下表：上游引物为SEQNO1、SEQNO3、SEQNO5、SEQNO7、SEQNO9、SEQNO11、SEQNO13、SEQNO15；上游引物为SEQNO2、SEQNO4、SEQNO6、SEQNO8、SEQNO10、SEQNO12、SEQNO14、SEQNO16。PCR反应程序：94℃5min预变性；98℃10s，60℃30s，68℃30s，40个循环；68℃5min。图2至图9结果显示上述4例样本的ETV6CDS区均能较好的被PCR扩增获得，同时电泳条带清晰，特异性理想，PCR产物可进行下一步测序检测。实施例4随机选取2例正常人的外周血(样本A及样本B)，通过实施例3方案获得其ETV6CDS区的PCR扩增产物后，进行ETV6CDS区的测序检测，测序步骤如下：(i)PCR产物酶纯化：一例样本的酶纯化体系为11ul：小牛碱性磷酸酶(CIP)0.1uL，核酸内切酶ExoⅠ0.5uL，灭菌水1.4uL，第二轮PCR产物9ul。酶纯化反应：37℃，50min孵育；95℃，5min变性；4℃保存。(ii)样本进行测序反应。一例样本的测序体系为5ul：BigDye1ul、测序引物1ul、灭菌水2ul、酶纯化产物1ul。测序反应程序：(iii)测序反应产物进行酒精纯化向每管中加入2ul的125mMEDTA，涡旋混匀，静置5min；然后加入15ul无水乙醇，13500rpm离心30min；倒置除掉上清，加入50ul冰冻的75％乙醇，13500rpm离心15min；倒置除掉上清，并放置于100℃金属浴上以完全挥发酒精；加入10ul的Hi-DiTMFormamide，震荡离心后将产物转至96孔板；95℃5min变性后，将96孔板置于ABI3500进行测序。根据测序结果图10至图27可知，上述两例样本的ETV6CDS区域均测序成功，同时图谱中的各个碱基峰清晰可辨，结果理想。通过该检测方法中的引物进行样本检测，发现其具有较高的稳定性、特异性；同时使用Sanger测序法对受检样本进行测序，可获得理想的测序结果。
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