体外导入外源IL-10基因对肝星状细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原分泌的影响--《实用诊断与治疗杂志》2007年11期
体外导入外源IL-10基因对肝星状细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原分泌的影响
【摘要】：目的:利用重组复制缺陷型腺病毒AdIL-10将外源IL-10基因导入肝星状细胞并观察其对肝星状细胞Ⅰ、Ⅲ胶原分泌的影响。方法:用传至1~2代的大鼠肝星状细胞以2×105/孔接种于24孔板,按每组6复孔分为三组:(1)单纯肝星状细胞培养组;(2)AdGFP对照组:肝星状细胞培养24h后取病毒AdGFP以感染复数50感染肝星状细胞;(3)AdIL-10组:肝星状细胞培养24h后取病毒AdIL-10以感染复数50感染肝星状细胞。3d后分别收集各组肝星状细胞,提取总RNA。结果:与单纯肝星状细胞培养组相比,AdIL-10组的IL-10mRNA表达明显增强(P0.01),而AdGFP对照组的IL-10mRNA表达差异无统计学意义(P0.05);AdIL-10组的Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA表达明显降低(P0.01),而AdFP对照组的Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA表达差异无统计学意义(P0.05)。结论:重组腺病毒AdIL-10感染肝星状细胞后可抑制肝星状细胞Ⅰ、Ⅲ胶原分泌。
【作者单位】：
【关键词】：
【基金】：
【分类号】：R575.2【正文快照】：
肝纤维化主要表现为肝组织中细胞外基质(extracellular material,ECM)的合成与降解的稳态机制失衡,导致ECM在细胞外间质的病理性沉积。肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的激活在肝纤维化过程中起着关键作用[1]。本研究利用重组复制缺陷型腺病毒AdIL-10将外源IL-10基因
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舒肝颗粒对大鼠肝星状细胞凋亡的影响
目的：肝纤维化(HF)是各种原因引起的慢性肝损伤所共有的病理改变，肝星状细胞(HSC)的活化增殖是HF形成的中心环节，细胞外基质(ECM)过量产生和沉积是形成HF，最终导致肝硬化、肝功能衰竭的主要原因。因此，抑制HSC活化增殖、促进HSC凋亡、抑制胶原合成分泌、促进胶原降解可抗肝纤维化。目前，抗肝纤维化尚无有效的治疗药物，西医抗肝纤维化治疗主要有抗氧化剂、细胞因子调节剂、血管活性物质调节剂、抑制信号通路等药物，这些药物或因毒性太大，或抗肝纤维化的作用不强，使临床应用受到限制。近年来，中医中药治疗肝纤维化显示出特有的优越性，包括单方和复方的应用和研究，有的研究已深入到分子水平。剔毒护肝方、复方861均从分子水平研究表明具有抑制体外培养的HSC增殖和促进HSC凋亡的作用[1,2]。舒肝颗粒主要是针对酒精性肝病(ALD)尤其是酒精性肝纤维化的防治。通过细胞实验已证明舒肝颗粒能抑制肝星状细胞的增殖，抑制胶原蛋白的分泌，可减少胶原纤维在肝脏内的沉积。
为了进一步探讨舒肝颗粒对肝纤维化的逆转是否有作用，采用舒肝颗粒作用于体外培养大鼠肝星状细胞，观察其是否对大鼠肝星状细胞凋亡有影响，以探讨舒肝颗粒对肝纤维化的防治作用的机制，为舒肝颗粒的临床应用进一步提供理论依据。
1．体外培养大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)。以5×104接种培养好的肝星状细胞在六孔板，培养24小时后，加入舒肝颗粒，分为三个浓度组：4.2mg/ml，2.8mg/ml，1.4mg/ml。加药作用24小时后，取出镜下观察细胞形态的变化。然后吹打细胞，使其成为单细胞悬液，收集细胞悬液，1500转/分离心，冷PBS冲洗后再离心，丢弃上清液，每根试管中加入100μl冷PBS,振荡摇匀，成单细胞悬液；调整细胞浓度1×106，缓冲液稀释1:4；取100μl悬液，于5ml流式管中加入5μl AnnexinV/FITC和10μl 20mg/ml的碘化丙锭，混匀后室温避光孵育15min；在反应管中加入400μl PB，流式细胞仪分析结果。
2．以5×104接种肝星状细胞在六孔板，培养24小时后加药，浓度组同前，加药培养24小时后，镜下观察。吹打细胞，使其成为单细胞悬液，收集细胞液，1500转/分离心，冷PBS冲洗后再离心，丢弃上清液，每根试管中加入100μl冷PBS，振荡摇匀，成单细胞悬液；调整细胞浓度1×106，缓冲液稀释1:4；取100μl悬液，于5ml流式管中加入5μl CD95抗体，混匀后室温避光孵育15min；在反应管中加入400μlPBS，流式细胞仪分析结果。通过流式细胞仪检测CD95，探讨舒肝颗粒诱导肝星状细胞凋亡的可能途径。
3．细胞培养后爬片，以同样的药物浓度作用24小时后，用4℃预冷1:1丙酮和乙醇固定；蒸馏水冲洗、PBS浸泡、双氧水消除内源性过氧化物酶的活性；采用SABC法，先滴加试剂A孵育15分钟，再滴加一抗Bax，37℃孵育3小时，PBS冲洗；依次滴加试剂B、试剂C，每次孵育10分钟，PBS冲洗三次；再滴加DAB显色剂，冲洗、晾干、封片；采用Image plus 7.0系统显微镜照相。4．重复上述实验过程检测Bcl-2。
1．正常对照组的凋亡率是3.4±0.82，不同浓度的舒肝颗粒1.4mg/ml，2.8mg/ml，4.2mg/ml，对肝星状细胞的凋亡率分别是：42.61±6.42,61.07±3.19,87.84±5.49，各组的凋亡率较正常对照组明显增高，差别具有显著性(P<0.05)。在1.4mg/ml组，肝星状细胞的早期凋亡率明显较正常对照组增加(P<0.05)，而中晚期凋亡率较少。在2.8mg/ml组，肝星状细胞的早期凋亡率和中晚期凋亡率均明显升高。4.2mg/ml组，肝星状细胞在舒肝颗粒作用24小时后，大部分已属于中晚期凋亡，早期凋亡较低浓度组明显减少，但较正常对照组仍明显增高(P<0.05)，从早期凋亡和中晚期凋亡的总体趋势看，随着浓度增高，总的凋亡率增加。
2.正常对照组的CD95的表达率是0.10±0.03,不同浓度的舒肝颗粒1.4mg/ml，2.8mg/ml，4.2mg/ml，对肝星状细胞的CD95的表达率分别是：4.77±0.84，9.44±0.61，24.51±5.91(P<0.05)，并随着浓度增高，CD95的表达率也增高。
3．Bax的表达正常组最少，随着药物浓度组的增高，Bax的表达增高，且差别有显著性(P0.05)。Bax/bcl-2的比值随着药物浓度组的增加而比值升高。
1．舒肝颗粒可诱导肝星状细胞的凋亡，且呈浓度依赖性；
2．舒肝颗粒可能通过介导Fas系统促肝星状细胞凋亡；
3．舒肝颗粒可以通过促进Bax的表达，可下调Bcl-2/Bax比率，以增加细胞对凋亡的敏感性，从而促进HSC凋亡。
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HSC-T6 究竟是一种什么细胞?细胞培养最近要做肝星状细胞实验,听师兄师姐们说HSC-T6细胞系 是一种活化细胞,而且永生,非常想知道这种细胞究竟是怎么来的?特点如何?为什么实验大多用这种细胞?
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T6肝星状细胞系
我当然知道它是T6肝星状细胞系。。。汗
HSC-T6（大鼠肝星状细胞系）：
弃培液-->以D-Hanks'液洗两次-->0.05％胰酶消化-->镜下观察细胞变圆（约5分钟）-->以完全培液（DMEM+10% FCS）终止反应-->吹打，1:3 - 1:4接种，然后继续培养。
该细胞系生长速度很快，所以采用1:3 - 1:4接种，而且换液间隔不要超过48h，否则细胞容易脱落下来
/view/240ccbd6be77.html
HSC-T6的传代、复苏、冻存我都做过，所以不用介绍了。但是，现在想想自己对这种细胞怎么来的确一点也不知道，觉得说不过去，只是看着大家这么做自己就跟着做，太没点探求的精神了
HSC-T6（大鼠肝星状细胞系）：来源于美国Friedman实验室，从建系到现在已经传了78代。
/view/240ccbd6be77.html确实有用，谢谢
没什么，都是学生物的，你是什么专业？
感染内科，肝纤维化研究
没别的问题了吧？
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你好，现在也需要养HSC-T6 ，想问一下，HSC-T6 能永生吗？好养吗？谢谢啊T6系为大鼠肝星状细胞转染SV40后由低浓度血清筛选得到的永生化细胞株，是永生细胞系。很好养，我是这么养的：将冷冻保存的HSC-T6细胞系于37℃快速复苏后接种至含10%FBS的H-DMEM中，37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱内贴壁培养。待细胞生长至融合状态，铺满瓶壁70%~80%以上时，用0.25%胰蛋...
你好，你的细胞系在哪买的。？
我的细胞是实验室原来就有的，早期是别的实验室赠送的
细胞系（cell line）指原代细胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体。 也指可长期连续传代的培养细胞。你这里应该是指的后者特点是无限扩增采用细胞系来进行实验可以保证良好的细胞状态一致性，而且细胞扩增容易现行的人教社大纲版选修教材中是这样介绍细胞株和细胞系的： 　　原代培养的细胞一般传至10代左右就不容易传下去了，细胞的生长就会出现停滞，大部分细胞衰老...
你的问题有些钻牛角尖
我没用过这种细胞，但我用过其它的细胞系
就像一款手机型号，你要问它为什么要命名为这种型号，这种问题没多大意义
至于无限细胞系是怎么来的，上面细胞系的概念已经明了了吧？
我并不觉得钻牛角尖，任何东西都有最初的来源，希望通过网络这个平台可以让知道这个问题答案的人看到可以回答。而且手机型号的命名肯定也不是随便命名的，也有他的道理，只是不是那行的不知道而已。。。
我大概了解了下，HSC是一类细胞
下面是一篇文献中的描述
HSC- T6 系为 SV40 转染 SD 大鼠的 HSCs， 是活化的 HSCs，能表达 α- SMA、 波形蛋白(vimentin)， 具有表达高水平 COL-Ⅰ、 TIMP- 1 mRNA特性， 该细胞系能够长期传代， 传代后具有稳定的表型
要的就是这个答案，可以把这篇文献名告诉我吗？
杨道坤,梁海军,申保生,孙屹峰,乔汉臣,. 三甲益肝颗粒含药血清对HSC-T6细胞形态、增殖和凋亡的影响[J]. 第三军医大学学报,2010,(5).
看来我的文献还是看少了。。。非常感谢你的帮助，你是学基础的？我最近在做细胞实验，感觉概念和基础问题还是比较多的，希望以后多多指教
扫描下载二维码丹参素对肝星状细胞中PI3-KAkt信号通路的影响_伤城文章网
丹参素对肝星状细胞中PI3-KAkt信号通路的影响
重庆医科大学 硕士学位论文 丹参素对肝星状细胞中PI3-K/Akt信号通路的影响 姓名：王珏 申请学位级别：硕士 专业：消化内科 指导教师：戴立里
重庆医科大学硕士研究生学位论文英汉缩略语名词对照英文缩写Ｐ１３一Ｋ英文全称Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ３－ｋｉｎａｓｅｓ，Ｐ１３－Ｋ中文全称 磷脂酰肌醇３激酶蛋白激酶Ｂ 肝星状细胞ＡｋｔＰｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｂ，ＰＫＢＨＳＣＨｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌＥＣＭ 口．ＳＡＭＥｘｔｒａｃｅｌｌ ｍａｔｒｉｘ细胞外基质 ａ一平滑肌动蛋白 过氧化物酶标链霉素亲ａ．ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｏｎＳＡＢＣＳｔｒｅｐｔ Ａｖｉｄｉｎ Ｂｉｏｔｉｎ ｅｎｚｙｍｅ ＣｏｍｐｌｅｘＤＡＢＤｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ二氨基联苯胺磷酸缓冲液 ＤＭＥＭ培养基ＰＢＳＰｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅＤＭ［ＥＭＤｕｌｂｅｃｃｏｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅｓ ｍｅｄｉｕｍＯＤＡｖｅｒａｇｅ ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ平均光密度多聚甲醛 Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹ＰＦＡＰａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅＷＢ阢ｓｔｅｍｂｌｏｔＦＣＳＦｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ胎牛血清 每分钟转速ｒｍｐＲｏｌｌｓ ｐｅｒ ｍｉｎｕｔｅ重庆医科大学 研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果．据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意． 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任．学位论文作者签名：王盟：日期：‰３．４．１４学位论文版权使用授权书本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学 位期间论文工作的知识产权单位属重庆医科大学．本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学．学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅．学校可以公布学位论文的全部或部分内容（保密内容除外），可以采用影印、缩印或其他手段保存论文．论文作者签名： 指导教师签名：丑Ｕ、重庆医科大学硕士研究生学位论文第一部分大鼠肝星状细胞的分离培养摘要目的：分离获取高产量、高活性、高纯度的肝星状细胞。 方法：用原位循环灌流法，密度梯度离心法分离纯化大鼠的肝星 状细胞，用含胎牛血清的ＤＭＥＭ培养液培养细胞并传代。 结果：肝星状细胞得率为３ｘ１０７个／鼠，纯度大于９７％，存活率大 于９２％。 结论：分离出的大鼠肝星状细胞产量高、活性好、纯度高。 关键词：肝星状细胞，细胞分离，培养，循环灌流重庆医科大学硕士研究生学位论文第二部分丹参素对肝星状细胞中Ｐ１３．Ｋ／Ａｋｔ 信号通路的影响摘要目的：研究丹参素对肝星状细胞蛋白激酶Ｂ（Ａｋｔ）署ｌ磷酸化蛋白激 酶Ｂ（ｐ．Ａｋｔ）蛋白表达的影响，探讨丹参素抗肝纤维化的机制。 方法：采用原位循环灌流法提取Ｗｉｓｔａｒ大鼠的肝星状细胞，在肝 星状细胞培养板内分别加入不同浓度的丹参素和渥曼青霉素在体外培 养２４小时后，用ＭＴＴ法观察丹参素以及渥曼青霉素对肝星状细胞增 殖的抑制作用。用流式细胞仪观察丹参素和渥曼青霉素对肝星状细胞 周期的影响。Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ方法检测不同浓度丹参素和渥曼青霉素作用 后的肝星状细胞中Ａｋｔ和Ｐ―Ａｋｔ的表达情况。 结果：ＭＴＴ检测表明浓度为０．０６２５ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｏ．１２５ｍｍｏｌ／Ｌ， ０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ的丹参素对肝星状细胞增殖的抑制作用依次增强，浓度为２０ｎｍｏｌ／Ｌ，４０ ｎｍｏｌ／Ｌ，６０ｎｍｏｌ／Ｌ的渥曼青霉素对肝星状细胞增殖的抑制作用也依次增强。流式细胞仪检测结果显示丹参素和渥曼青霉素使Ｇｌ 期肝星状细胞增多，Ｓ期肝星状细胞减少，肝星状细胞停滞于Ｇ。期。 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测出丹参素和渥曼青霉素对肝星状细胞中Ａｋｔ蛋白的表 达没有明显影响，但是不同浓度的丹参素和渥曼青霉素作用于肝星状 细胞２４小时后，细胞中有ｐ－Ａｋｔ的表达，且随药物浓度增加表达逐渐重庆医科大学硕士研究生学位论文减弱。 结论：丹参素和渥曼青霉素对肝星状细胞增殖的抑制作用与其抑 制ｐ－Ａｋｔ的表达有关。 关键词：丹参素，渥曼青霉素，肝星状细胞，蛋白激酶Ｂ（Ａｋｔ）， 磷酸化蛋白激酶Ｂ（ｐ．Ａｋｔ）４重庆医科大学硕士研究生学位论文ＰＡＲＴ １ ＴＨＥ ＩＳＯＬＡＴＩｏＮ ＡＮＤ ＣＵｌ月ＵＲＥ ｏＦ ＨＥＰＡＴＩＣＳＴＥＬＬＡＴＥ ＣＥＬＬＳ ＯＦ ＲＡＴＡＢＳＴＲＡＣＴＡｉｍ：Ｔｏ ｉｓｏｌａｔｅ ａｎｄ ｇｅｔ ｈｉｇｈ ｏｕｔｐｕｔ ａｎｄ ｐｕｒｉｔｙ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ ｏｆｒａｔ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｔｈｅｒａｔｈｅｐａｔｉｃ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎｓｔｅｌｌａｔｅ ａｎｄｃｅｌｌｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｗｉｔｈｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅｒｅｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ．ｐｕｒｉｆｉｅｄｗｉｔｈ ｄｅｎｓｉｔｙｇｒａｄｉｅｎｔＲｅｓｕｌｔｓ：Ｉｎ ｔｈｉｓ ｗａｙ，ｔｈｅ ｏｕｔｐｕｔ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ ａｍｏｕｎｔｅｄ ｔｏ５－－６ｘ １０７ ｃｅｌｌｓ ｐｅｒ ｒａｔ．Ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ａｂｏｖｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ９２％．９７％．ＴｈｅＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｇｅｔｔｉｎｇ ｈｉｇｈ ｏｕｔｐｕｔ ａｎｄ ｐｕｒｉｔｙ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＨｅｐａｔｉｃＲｅｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ．ｓｔｅｌｌａｔｅｃｅｌｌｓ，Ｃｅｌｌｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅ，５重庆医科大学硕士研究生学位论文ＰＡＩ玎２ＥＦＦＥＣＴ ＯＦ ＤＡＮＳＨＥＮＳＵ ＯＮ ＴＨＥ ＳＩＧＮＡｌＩＮＧＰＡＴＨⅥｉ“ＯＦ Ｐ１３ｌ饥～ＫＴＡＢＳＴＲＡＣＴＡｉｍ：Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｄａｎｓｈｅｎｓｕ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄｏｎｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｋｔｐｒｏｔｅｉｎｓ（ｐ－Ａｋｔ）ｉｎＨｅｐａｔｉｃ ｓａｔｅｌｌｉｔｅｃｅｌｌｓ（ＨＳＣｓ）． ＷｉｓｔａｒＭｅｔｈｏｄｓ：ＨＳＣｓｒａｔｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ ｏｆｂｙｉｎ－ｓｉｔｕｐｅｒｆｕｓｉｏｎｗｉｔｈｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ｔｈｅａｎｄｄｅｎｓｉｔｙ ｗｅｒｅｇｒａｄｉｅｎｔｔｏｅｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎｗｉｔｈＮｙｃｏｄｅｎｚ．ＴｈｅｎＨＳＣｓｅｘｐｏｓｅｄ０．０６２５ｍｍｏｌ／Ｌ，０．１ ２５ｍｍｏｌ／Ｌ，０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ ｎｍｏｌ／Ｌ，６０ ｎｍｏｌ／ＬＤａｎｓｈｅｎｓｕａｎｄ ２０ｎｍｏｌ／Ｌ，４０Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎｆｏｒ ２４ｈｏｕｒｓ．Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｄａｎｓｈｅｎｓｕ ａｎｄＷｏｒｔｍａｎｎｉｎｏｎｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙＭＴＴａｓｓａｙ．Ｔｈｅｃｅｌｌｃｙｃｌｅ ｏｆ ＨＳＣｓ ｗａｓ ａｎａｌｙｓｅｄ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｋｔ ａｎｄＰ―Ａｋｔ ｗｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ａｔ ｔｈｅＷｅｓｔｅｍｂｌｏｔ． ｏｆｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ０．０６２５ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｏ．１ ２５ｍｍｏｌ／Ｌ，ｉｎｈｉｂｉｔ ＨＳＣ ｐｒｏｌｉｆｅｒ ａｃｔｉｏｎ ｉｎ０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｄａｎｓｈｅｎｓｕ ｃｏｕｌｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｃｌｏｓｅ―ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｎｎｅｒ．Ａｔ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ２０ｎｍｏｌ／Ｌ，４０ ｎｍｏｌ／Ｌ，６０ ｎｍｏｌ／ＬＷｏｒｔｍａｎｎｉｎｃｏｕｌｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔＨＳＣ ｐｒｏｌｉｆｅｒ ａｃｔｉｏｎ ｉｎｃｌｏｓｅ―ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｎｎｅｒ．Ｂｏｔｈ Ｄａｎｓｈｅｎｓｕ ａｎｄ Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ ｃｏｕｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ＨＳＣｓ ｉｎ Ｇ１ ｐｈｒａｓｅ ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ＨＳＣｓ ｉｎ Ｓｐｈｒａｓｅ．Ｄａｎｓｈｅｎｓｕ ａｎｄ Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ６ｈａｄｎｏｍａｒｋｅｄ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓｏｎＡｋｔ重庆医科大学硕士研究生学位论文ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｂｕｔ ｐ－Ａｋｔ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ＨＳＣｓ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｗｉｔｈｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｄａｎｓｈｅｎｓｕ ａｎｄ Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅａｎｔｉ－ｆｉｂｒｏｔｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｄａｎｓｈｅｎｓｕ ｍｉｇｈｔ ｂｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐ―Ａｋｔ ｉｎ ＨＳＣｓ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｄａｎｓｈｅｎｓｕ，Ｂａｉｋａｌｉｎ，ＨＳＣ，Ａｋｔ，Ｐ―Ａｋｔ，Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ．７重庆医科大学硕士研究生学位论文丹参素对肝星状细胞中Ｐ１３．Ｋ／Ａｋｔ信号通路的影响．＾上－Ｊ－刖吾对肝纤维化发病机制的研究揭示，肝星状细胞（ＨＳＣ）的激活是肝纤维化发生、发展的中心环节，ＨＳＣ是抗纤维化治疗的主要靶细胞。在肝纤维化发展过程中， 磷脂酰肌醇３激酶（Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３－ｋｉｎａｓｅｓ，Ｐ１３Ｋ）／蛋白激酶Ｂ（Ａｋｔ）是其重要 信号转导途径之一，有研究表明抑制Ｐ１３Ｋ的活性可抑制ＨＳＣ增殖。 磷脂酰肌醇３激酶（Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３－ｋｉｎａｓｅｓ，Ｐ１３一Ｋ）是一种蛋白酪氨酸激酶，广泛地分布在真核生物的各种细胞中，目前在与Ｐ１３Ｋ相关的信号途径中研究较多的是Ｐ１３Ｋ／Ａｋｔ信号途径，该途径在细胞的生长、增殖、分化、凋亡等方面发挥着 重要作用。在哺乳动物细胞中，Ｐ１３．Ｋ是由调节亚基Ｐ８５和催化亚基Ｐ１１０构成的异源二聚体，分为Ｉ、ＩＩ、ＩＩｌ３个亚型，其作用是将磷脂酰肌醇环上的第３位羟基进行磷酸化。Ａｋｔ，又称蛋白激酶Ｂ（ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＢ，ＰＫＢ），是一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，Ａｋｔ氨基端含有一个血小板一白细胞Ｃ激酶底物同源结构区域（ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ，ＰＨ域），该结构域特异性作用于底物中丝氨酸／苏氨酸残基并使其磷酸化。渥曼青霉素（Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ）是一种常用的Ｐ１３Ｋ／Ａｋｔ抑制 剂，Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ可以通透细胞膜，与Ｐ１３Ｋ的１１０ｋＤ催化亚基相结合，特异性抑制Ｐ１３Ｋ，抑制Ｐ１３Ｋ／Ａｋｔ信号途径，并抑制Ａｋｔ磷酸化。 丹参素是丹参的水溶性有效成分，其结构为３，４．二羟基苯乳酸，有研究表明，丹参素可有效改善肝脏微循环，对肝纤维化组织增生具有降解和预防作用。本实验从细胞Ｐ１３Ｋ／Ａｋｔ信号通路的角度，以Ｐ１３Ｋ／Ａｋｔ通路特异性抑制剂渥曼青霉素为 对照，研究丹参素对肝星状细胞中Ａｋｔ和Ｐ．Ａｋｔ表达的影响，探讨丹参素对肝星状细胞增殖的影响是否与信号通路Ｐ１３Ｕ心有关系。８重庆医科大学硕士研究生学位论文第一部分大鼠肝星状细胞（ＨＳＣ）的分离和培养研究表明，肝星状细胞的活化是肝纤维化形成的中心环节，目前对抗肝纤维化药物的研究是建立在分离和培养肝星状细胞的基础之上。本文采用罗云和郑元义博士分离提纯ＨＳＣ的方法分离培养出产量高、活性高的原代肝星状细胞【ｌ】【２１。１．材料和方法１．１材料实验动物健康成年雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠，体重３００－－４００９，由重庆腾鑫公司提供。 主要试剂 ＳＡＢＣ试剂盒 ＤＭＥＭ干粉 优质胎牛血清（ＦＣＳ） 胰蛋白酶 链霉蛋白酶Ｅ（Ｐｒｏｎａｓｅ Ｅ） ＩＶ型胶原酶（Ｔｙｐｅ ＤＮＡ酶Ｉ（Ｄｎａｓｅ Ｉ） Ｎｙｃｏｄｅｎｚ（１ ８％） Ｄ―Ｈａｎｋ’ｓ干粉 小鼠抗ｄｅｓｍｉｎ抗体 兔抗鼠ａ．ＳＡＭ单克隆抗体Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ一１００ ０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ ＩＶ ｅｏｌｌａｇｅｎａｓ）武汉博士德公司 美国Ｇｉｂｉｏ公司 天津灏洋公司 美国Ｓｉｇｍａ公司美国Ｓｉｇｍａ公司美国Ｇｉｂｉｏ公司美国Ｓｉｇｍａ公司挪威Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ公司 美国Ｇｉｂｉｏ公司 武汉博士德公司 武汉博士德公司 美国Ｓｉｇｍａ公司 武汉博士德公司分离和培养用溶液 Ｄ－－Ｈａｎｋ’ｓ液：用供配剂１Ｌ的Ｄ－－Ｈａｎｋｓ干粉加双蒸水至终体积１０００ｍｌ，调整 ＰＨ至７．０。 Ｈａｎｋ’ｓ液：用供配剂１Ｌ的Ｈａｎｋ’ｓ干粉加双蒸水至终体积１０００ｍｌ，调整ＰＨ９重庆医科大学硕士研究生学位论文至７．０。酶消化液：Ｈａｎｋ’Ｓ液５０ｍｌ中加入ＩＶ型胶原酶２５ｍｇ，Ｐｒｏｎａｓｅ至７．３。Ｅ５０ｒｎｇ，调整ＰＨ细胞分散液：Ｈａｎｋ’Ｓ液２０ｍｌ中加入ＩＶ型胶原酶１００ｍｇ，ＰｒｏｎａｓｅＩＥ ４ｍｇ，Ｄｎａｓｅｌｍｇ，调整ＰＨ至７．３。 ＤＭＥＭ培养液：ＤＭＥＭ培养液中按１０－－２０％的比例加入胎牛血清，按１００ｕ／ｍｌ加入青霉素，按１００ｕ／ｍｌ加入链霉素。 ０．２５％胰蛋白酶液：Ｄ－－Ｈａｎｋ’ｓ液１００ｍｌ中加入胰蛋白酶２５０ｍｇ。 以上溶液均用滤膜抽虑灭菌。 主要仪器 ＤＤＢ－－３００电子蠕动泵 上海医疗器械厂 、日本Ｏｌｙｍｐｕｓ产品 ＴＧＬ一１６８型，美国 ＳＨＰＬ．ＬＡＢ２３００型，美国 上海净化设备厂 上海天平仪器厂 上海医疗器械厂 德国Ｒｏｓｉ公司 美国Ｃｏｓｔａｒ公司显微镜离心机 二氧化碳细胞孵箱 医用超净工作台 电子天平 恒温水浴箱 磁力搅拌器 ２４孔板１．２方法细胞提取０）Ｗｉｓｔａｒ大鼠一只，腹腔注射１０％水合氯醛（０．３ｍｌ／１００９体重）和肝素（１００ｕ ／蚝体重）。 ②大鼠麻醉生效后，将其固定于超净工作台上，７５％酒精常规消毒，紫外线照射２０分钟。③依次切开腹部皮肤、皮下组织、肌肉和腹膜。推肠管于右侧，游离门静脉 及前静脉，各预置缝线１根，待门静脉插管成功后，结扎固定，剪开前腔静脉。 ④用Ｄ．Ｈａｎｋ’Ｓ液经门静脉插管灌流，速度１５．２０ｍｌ／ｍｉｎ。１０重庆医科大学硕士研究生学位论文⑤待肝脏颜色变淡时，将灌流速度调慢并打开胸腔，结扎后腔静脉；前腔静脉插管，结扎固定。⑥灌流约１０分钟后，自前腔静脉流出的Ｄ．Ｈａｎｋ’Ｓ液不含肉眼可见的血液，改用酶消化液于３７＂Ｃ循环灌流约１５分钟，速度为１０．１５ｍｌ／ｍｉｎ。⑦当肝脏变软，压之凹陷不易恢复时，小心切断肝周韧带，取肝置于平皿内，用眼科剪去除被膜、血管等纤维结缔组织。⑧加入细胞分散溶液，于３７＂（２进行震荡消化１０分钟左右。 ⑨将细胞溶液过２００目细网滴入试管内，加入ＤＭＥＭ，５００ｒｐｍ离心５分钟。⑩取上清，１５００ｒｐｍ离心１０分钟。 口取沉淀，加入２倍体积１８％Ｎｙｃｏｄｅｎｚ，混匀后，上覆２―３ｍｌ ＤＭＥＭ。Ｆ１２６００ｒｐｍ离心２０分钟，抽吸界面细胞层即为含ＨＳＣ液。口加入少许ＤＭＥＭ，１５００ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ，反复１次。口取沉淀，即为ＨＳＣ。加ＤＭＥＭ重悬。 细胞鉴定方法：①细胞活率鉴定：用Ｏ．４％台盼蓝染色１－２ｍｉｎ后计数未着色细胞数（即活细胞数）所占细胞总数的百分率，即为活率。细胞活率＝（未着色细胞数／总细胞数）ｘ１００％。②细胞得率鉴定：用红细胞计数法计算每ｍｌ细胞悬液中的细胞数以及细胞总数（产量）。③细胞形态观察：在倒置显微镜下观察所分离的ＨＳＣ的形态和培养后ＨＳＣ形态变化以及生长情况。④细胞性质鉴定：作ｄｅｓｍｉｎ、Ｑ．平滑肌肌动蛋白（ｉｔ．ＳＭＡ）染色（二者皆为位于ＨＳＣ胞浆内的特异性标志物）后，计数显棕色的细胞占细胞总数的百分率，ＨＳＣ 阳性率＝（棕色细胞数／细胞总数）ｘ１００％。 取对数生长期ＨＳＣ，０．２５％胰蛋白酶液脱壁，离心及台盼蓝染色计数后，用 含１０％ＦＣＳ的ＤＭＥＭ培养液配制成ｌｘｌ０５／ｍｌ的细胞悬液；将预先用重铬酸盐漫 泡过夜、清洗、高压消毒后的盖玻片，置入２４孔培养板（１块／孔），按２ｘ１０４／ｃｍ２ 密度接种。１０天后吸去培养液，ＰＢＳ洗２次，每次５分钟，用小鼠抗ｄｅｓｍｉｎ抗体，重庆医科大学硕士研究生学位论文小鼠抗ａ．ＳＡＭ抗体，ＳＡＢＣ法作免疫化学染色。具体步骤如下：ａ．固定：４％多聚甲醛，室温３０分钟；ｂ．漂洗：ＰＢＳ洗３次，每次５分钟；ｃ．阻断内源性过氧化物酶：０．３％Ｈ２０２一甲醛溶液，室温３０分钟。ｄ．ＰＢＳ洗３次，每次５分钟； ｅ．穿透：Ｏ．１％Ｔｒｉｔｏｎ．１００，４＂Ｃ作用４分钟。 ￡ＰＢＳ洗３次，每次５分钟； ｇ．正常山羊血清室温孵育３０分钟； ｈ．滴加一抗，同时用ＰＢＳ代替一抗作为阴性对照４＂Ｃ湿盒孵育过夜； ｉ．ＰＢＳ洗３次，每次５分钟； ｉ．滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素亲和素工作液，３７＂Ｃ湿盒孵育３０分钟； ｋ．ＰＢＳ洗３次，每次５分钟；１．ＤＡＢ显色５分钟，镜下观察控制显色程度，自来水冲洗终止显色反应； ｍ．苏木素轻度复染，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片；ｎ．阳性结果判定：胞浆呈棕褐色者为阳性。细胞培养方法细胞以５ｘ１０４／ｃｍ２接种在１００ｍｌ塑料瓶中，在５％Ｃ０２，９５％空气的二氧化 碳培养箱里培养，４８小时首次换液后，改用含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养液，以后每２―４天更换一次培养液。培养１０天左右原代细胞呈单层生长。细胞传代方法原代培养ＨＳＣ长满单层后，吸去培养基，０．２５％胰蛋白酶于３７＂Ｃ消化１０分钟左右，吸去胰蛋白酶，加入３ｍｌＤＭＥＭ吹打培养瓶壁，收集细胞悬液，１５００ｒｐｍ 离心１０ｍｉｎ，反复一次，加入含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ液重悬，５ｘ１０４个／ｃｍ２的 浓度接种。培养７天左右传代细胞呈单层生长。２．结果细胞得率和纯度：每只大鼠ＨＳＣ得率为３ｘ１０７个／９，，经台盼蓝染色纯度达９７％以上，细胞贴壁存活率在９２％左右。 细胞形态和活力：在倒置显微镜下见刚分离的星状细胞呈圆形，胞浆脂滴丰１２重庆医科大学硕士研究生学位论文富，接种２４小时后，大部分细胞贴壁，４８小时后部分细胞出现多角伸展，随着培养时间的延长，细胞逐渐呈星状，然后向梭形变化，经１０天左右细胞呈单层生长， 传代接种１―２小时后，大部分细胞贴壁，２４小时后细胞全部伸展生长，约一周后， 传代ＨＳＣ呈单层长满培养瓶底。（图１一１） ＨＳＣ鉴定：刚分离的原代ＨＳＣ的ｄｅｓｍｉｎ阳性率在９０％左右，传代培养ＨＳＣ 的ｄｅｓｍｉｎ阳性率达９８％，原代及传代培养细胞的ａ－－ＳＭＡ表达均呈阳性。（图ｌ－－２，ｌ一３）３．讨论肝星状细胞的分离和培养是研究药物对肝纤维化作用机理的基础。原位灌流 法的优点在于分离所用酶的消耗量较少，大鼠肝星状细胞的得率、纯度和活力均 能达到实验要求。技术关键在于循环灌流体系的建立，要求成功地进行门静脉和前腔静脉穿刺插管。 肝星状细胞的得率受下列因素的影响：１．大鼠的年龄、性别、体重和营养状况 等可以影响ＨＳＣ的得率和存活率：年龄太小，体重太轻的大鼠的门静脉太细，插管不容易成功；营养状况不好的大鼠的细胞存活率低；体重过大的大鼠的肝内脂滴聚集较多，ＨＳＣ的得率低。２，门静脉插管是关键：快速、准确的插管是循环灌 流的前提，为保证插管成功，术前给大鼠注射肝素并在导管中灌注肝素可防止血液凝固，插管时尽量插到肝门处，否则酶消化液可导致肝外血管的消化，使灌流 液外漏。３．胶原酶和链蛋白酶的消化：胶原酶消化不充分，细胞得率少；链蛋白酶消化不充分，肝细胞大量存在，影响ＨＳＣ纯度。酶消化液最好在配制后两天内使用，并加入Ｃａ２＋，预热至３７＂Ｃ一３８℃，使进入肝脏的灌流液温度保持在３７＂Ｃ左右，灌流时间为２０分钟。４．Ｄｎａｓｅ ｌ的应用：破坏的肝细胞会释放出大量的ＤＮＡ，使细胞悬液粘度大量增加，影响过滤和密度梯度的形成，因此在细胞分散液中必须使用Ｄｎａｓｅ Ｉ，以破坏ＤＮＡ，减少细胞粘度。５．Ｎｙｃｏｄｅｎｚ：密度梯度离心是纯化星状细胞的重要步骤，Ｎｙｃｏｄｅｎｚ是密度梯度离心的介质，其浓度是形成密度梯度的关 键。６．严格无菌操作：由于真个细胞分离时间较长，容易受细菌污染，因此整个操作过程应严格按照无菌操作原则进行。１３重庆医科大学硕士研究生学位论文第二部分丹参素对肝星状细胞中Ｐ１３．Ｋ／Ａｋｔ信号通路 的影响丹参素是丹参的水溶性有效成分，其结构为３，４一二羟基苯乳酸，有研究表明， 丹参素可有效改善肝脏微循环，对肝纤维化组织增生具有降解和预防作用ｆ３】。磷脂 酰肌醇３激酶（Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３－ｋｉｎａｓｅｓ，Ｐ１３．Ｋ）是一种蛋白酪氨酸激酶，广泛地分 布在真核生物的各种细胞中，在哺乳动物细胞中，Ｐ１３一Ｋ是由调节亚基Ｐ８５和催化亚基Ｐ１１０构成的异源二聚体，分为Ｉ、ＩＩ、ｌｉｂ个亚型【４１。目前在与Ｐ１３Ｋ相关的信号途径中研究较多的是Ｐ１３Ｋ／Ａｋｔ信号途径。蛋白激酶Ｂ（ｐｒｏｔｅｉｎ又称Ａｋｔ，是一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，是Ｐ１３黜信号途径的关键分子。ｋｉｎａｓｅＢ，ＰＫＢ），磷酸化蛋白激酶Ｂ（ｐ－Ａｋｔ）在促进细胞凋亡、抑制细胞增殖方面起重要作用【５】【６】。渥 曼青霉素（Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ）是一种常用的Ｐ１３Ｋ／Ａｋｔ抑制剂，Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ可以通透细胞 膜，与Ｐ１３Ｋ的ｌ １０ｋＤ催化亚基相结合，特异性抑制Ｐ１３Ｋ，抑制Ｐ１３Ｋ／Ａｋｔ信号途径，并抑制Ａｋｔ磷酸化［６１。本实验从细胞Ｐ１３Ｋ／Ａｋｔ信号通路的角度，以Ｐ１３Ｋ／Ａｋｔ通路特异性抑制剂渥曼青霉素为对照，研究丹参素对肝星状细胞中Ａｋｔ和Ｐ．Ａｋｔ的表达的影响，探讨丹参素影响肝星状细胞增殖与信号通路Ｐ１３眦ｔ的关系。１．１材料实验动物见第一部分 其他药品和主要试剂丹参素 Ａｋｔ抗体 ｐ－Ａｋｔ抗体ＭＴＴ ＤＭＳＯ１．材料和方法四川省药品检验所 美国ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司， 美国ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司， 武汉博士德公司 美国Ｓｉｇｍａ公司 碧云天试剂公司渥曼青霉素１４重庆医科大学硕士研究生学位论文主要仪器细胞分离培养所需仪器酶标计数仪 倒置显微镜 磁力振荡器见第一部分Ｂｉｏ．ＴＥＫ公司 日本Ｏｌｙｍｐｕｓ产品上海浦江分析仪器厂美国ＢＤＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ 美国Ｃｏｓｔａｒ公司流式细胞仪９６孔板 电泳系统美国Ｂｉｏ．Ｒａｄ公司 美国Ｂｉｏ．Ｒａｄ公司 美国Ｂｉｏ―Ｒａｄ公司 美国Ｂｉｏ．Ｒａｄ公司美国Ｂｅｃｋｍａｎ公司转移电泳仪电泳槽垂直电泳槽Ｇｅｌ Ｄｏｅ２０００凝胶成像系统微量高速冷冻离心机微量可调加样器美国Ｂｅｃｋｍａｎ公司１．２实验方法原位循环灌流法提取肝星状细胞见第一部分 ＨＳＣ的鉴定和培养见第一部分 四甲基偶氮唑盐（ＭＴＴ）比色分析法检测丹参素和渥曼青霉素对ＨＳＣ增殖的影响‘７ｉ①Ｍ１ｖｒ溶液（５ｍｇ／ｍ１）的配制：１００ｍｇＭＴＴ加入２０ｍｌＰＢＳ中，搅拌至完全 溶解，０．２２ｕｒｎ滤膜抽虑灭菌。４＂Ｃ保存，两周内使用； ②０．２５％胰酶消化液消化细胞，离心及台盼蓝染色计数后，用含ＩＯ％ＦＣＳ的 ＤＭＥＭ培养液配制成５ｘ１０４／ｍｌ的细胞悬液，按１００ｕ蚜Ｌ加入９６孔培养板，每组均 设定３个复孔，在３７０Ｃ、５％Ｃ０２恒温培养箱中培养。 ③于二氧化碳孵箱培养２４ ｈ后换液，设空白调零组（不接种细胞）、对照组（只含 等量ＤＭＥＭ）及实验组（加不同浓度的丹参素，其终浓度分别为０．０６２５ｍｍｏｌ／Ｌ， Ｏ．１２５ｍｍｏｌ／Ｌ，０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ；渥曼青霉素终浓度为２０ｎｍｏｌ／Ｌ，４０ 每组设３个复孔；１５ｎｍｏｌ／Ｌ，６０ ｎｍｏｇＬ），重庆医科大学硕士研究生学位论文④再培养２４ ｈ后加入ＭＴＴ（５ ｇ／Ｌ）２０Ｉ．ｔＬ，继续培养４ｈ；⑤４ｈ后吸出上清，每孔加二甲亚砜ＤＭＳＯ １５０９Ｌ，振荡溶解１０ ｍｉｎ，待结晶完全溶解；⑥在酶联免疫测定仪上选择波长４９０ ｎｌｎ，空白孔调零，测定各孔吸光度Ａ。 ⑦统计学处理：结果用Ｘ＋Ｓ表示，采用ＳＰＳＳｌ．０软件的ｑ检验进行分析。 流式细胞仪测丹参素和渥曼青霉素作用后ＨＳＣ的细胞周期 ①传代肝星状细胞在含２０％胎牛血清的培养瓶中生长２４小时，然后用无血清 培养基同步化处理４８小时； ②加入丹参素（终浓度为０．０６２５ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｏ．１ ２５ｍｍｏｌ／Ｌ，０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ）、渥曼 青霉素（终浓度为２０ｎｍｏｌ／Ｌ，４０ｎｍｏｌ／Ｌ，６０ｎｍｏｌ／Ｌ），培养２４小时；③培养２４小时后，将贴壁细胞用０．２５％胰酶消化，３０００ｒｐｍ／ｍｉｎ离心３０分钟； ④加入ＰＢＳ后轻轻吹打细胞，细胞呈单细胞悬液状态后滴入４＂Ｃ预冷的７０％乙醇中，边滴边振荡，防止细胞聚集成团：⑤用４００目无菌尼龙网过滤一次，调整细胞数为ｌｘｌ０６／ｍｌ，ＰＩ碘化丙锭作 用后，于流式细胞仪作ＤＮＡ细胞周期分析。 ⑥统计学处理：结果用Ｘ４－Ｓ表示，采用ＳＰＳＳｌ．０软件的ｑ检验进行分析。 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ方法测丹参素和渥曼青霉素对ＨＳＣ的Ａｋｔ以及ｐ－Ａｋｔ表达的影响（至）Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ、ＲＴ－ＰＣＲ主要试剂的配置ａ、１ ０％过硫酸胺（ＡＰ）：过硫酸胺ｄｄＨ２００．１９１．０ｍｌ４。Ｃ保存，在一周内使用。 ｂ、１．７４ｍｇ／ｍｌ（１０ｒｅｔｏｏｌ／Ｌ）ＰＭＳＦＰＭＳＦ ０．１７４ｍｇ异丙醇ｌｍｌ 溶解后，装于１．５ｍｌ离心管中，．２０℃保存。１６重庆医科大学硕士研究生学位论文ｃ、ＳＤＳ―ＰＡＧＥ分离胶配制 ８％ＳＤＳ―ＰＡＧＥ分离胶（用于ＦＸＲ、ＳＲＥＢＰ．１ｅ）ｄｄＨ２０３．３ｍｌ ２．７ｍｌ３．８ｍｌ ０．１ｍｌ ０．１ｍｌ ６９ｌ３０％丙烯酰胺／１％亚甲双丙烯酰胺ｌＭ ｔｒｉｓ（ｐＨ８．８） １０％ＳＤＳ １０％ＡＰ ＴＥＭＥＤ在１００ｍＬ的烧杯中，依次加入ｄｄＨ２０、３０％丙烯酰胺／１％亚甲双丙烯酰胺、 ｐＨ８．８的Ｔｒｉｓ、１０％ＳＤＳ和，混匀后再加入１０％ＡＰ，最后加入ＴＥＭＥＤ，震荡混匀， 立即灌胶，现用现配。 ｄ、Ｔｒｉｓ甘氨酸电泳缓冲液聪ｓ碱（ＭＷｌ２１．１４）甘氨酸（ＭＷ７５．０７）ＳＤＳ ｄｄＨ２０３．０３９ １８．７７９ １０．０ ｇ至１０００ｍｌ溶解后４。Ｃ保存。ｅ、Ｔｒｉｓ甘氨酸电转缓冲液 甘氨酸（ＭＷ７５．０７）Ｔｒｉｓ（ＭＷｌ２１．１４）ＳＤＳ ２．９ ｇ ５．８９ ０．３７９ ２００ｍｌ甲醇ｄｄＨ２０至１０００ｍｌ溶解后４＂Ｃ保存。ｆ、１Ｍ Ｔｒｉｓ．ＨＣＩ（ＰＨ６．８）Ｔｒｉｓ ｄｄＨ２０ ２．１１９至１００ｍｌ１ＭＨＣｌ数滴调ＰＨ至６．８４＂Ｃ保存ｇ、ＴＢＳＴ缓冲液ＩＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣＩ（ＰＨ６．８） ２０ｍｌ１７重庆医科大学硕士研究生学位论文ＮａＣＩ８．８９ ０，５ｍｌ２０％Ｔｗｅｅｎ２０ｄｄＨ２０ ｈ、１ ０ｘ丽春红染液（储存液）：至１０００ｍｌ丽春红Ｓ 三氯乙酸 磺基水杨酸２．０ ｇ ３０ ｇ ３０ ｇ加ｄｄＨ２０至１００ｍｌ，使用时将其稀释１０倍。 ②蛋白样本的制各 ａ．冷ＰＢＳ漂洗细胞两次，胰酶消化，４＂Ｃ，１０００ｒｐｍ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，收集细胞；ｂ．取细胞样品与细胞裂解液６０娜冰上孵育２０ｒａｉｎ，离心（１２，０００ｒｐｍ／ｍｉｎ，３０ｍｉｍ， ４℃），取上清； ｃ．取ｌ ｐｌ蛋白液加５９山去离子水，再加上考马斯亮蓝ｌｍｌ，室温放置１５ｍｉｎ。在５９０ｒｉｍ紫外分光光度计下测吸光值，据标准盐线计算出各组蛋白质浓度。 ③电泳丸准备好玻璃板，依次用水，ＤＨ２０，乙醇擦净，晾干，按厂家的介绍装好垂直电泳槽，ｌ，２％琼脂糖封边。 ｂ．按蛋白需要制备８％分离胶７－８ｍｌ；ｃ．小心将分离胶注入到准备好的玻璃板间隙中，至红色标志带约中上１／３处，加 入ｌｍｌＤＨ２０覆盖压平及排除空气，于３７＂Ｃ静置至胶凝固；ｄ．当水、胶之间出现折射线（即胶已凝固），３ｍｉｎ后倒去上层水，并用滤纸小心吸干胶顶端残存的液体；ｅ．按前述配方制备注入到玻璃间隙中，垂直插上梳子； ￡在胶聚合的同时，将预存的蛋白再次１００度加热５ｍｉｎ：ｇ．浓缩胶聚合完成以后，垂直快速拔梳子，加入预先配好的电泳缓冲液，轻轻冲 洗梳空数次，以去除可能残留的杂质： ｈ．按每孔道７０ｐ，ｇ蛋白计算各组电泳所需加的量。微量玻璃加样器按梳孔加入； ｉ．电泳，开始时为６０ｍｖ恒压，当溴酚蓝进入分离胶后，改用８０．１００ｍｖ恒压， 至预染Ｍａｒｋｅｒ显示目的蛋自条带已全部分开，断开电源； ｊ．取下胶，进行转膜及显色。１８重庆医科大学硕士研究生学位论文＠ＳＤＳ．ＰＡＧＥ转膜 ａ．戴一次性塑料手套，轻轻剥离玻璃板，参照蛋白Ｍａｒｋｅｒ，切取所需目的蛋白所在凝胶（需包含上下各一Ｍａｒｋｅｒ条带），浸泡于电转缓冲液：ｂ．裁剪与凝胶等大的六张滤纸，浸泡于电转缓冲液；裁剪ＰＶＤＦ膜略大于滤纸，浸泡于甲醇中约３０秒激活，并将膜剪下一角以标记蛋白面； ｃ．打开转膜用的夹子，黑面置下，从下向上依次平铺三层滤纸、凝胶、ＰＶＤＦ 膜、三层滤纸（各层间务必用玻棒赶走气泡）。将夹子置于充满电转缓冲液电转槽 中，ＰＶＤＦ膜对正极方向、凝胶对负极方向，接通电源，４＂Ｃ下恒流（２５０ｍＡ）转 膜： ｄ．电转后，将ＰＶＤＦ膜浸入丽春红染液中染色５ｍｉｎ（摇床上４０ｒｐｍ），双蒸 水洗涤ＰＶＤＦ膜，以证实转膜是否成功。⑤免疫杂交及显色 ａ．取出ＰＶＤＦ膜，脱色摇床上ＴＢＳＴ缓冲液稍洗膜，以去除杂质；ｂ．将膜置于５％牛血清白蛋白中，蛋白面向下，于脱色摇床上室温封闭１ｈ： Ｃ．Ａｋｔ，ｐ－Ａｋｔ一抗按ｌ：６００稀释，１３－ａｃｔｉｏｎ按１：５００牛血清白蛋白稀释，将ＰＶＤＦ 膜的蛋白面向上，置入预先在培养皿中制好的槽中，上面加一抗至完全覆盖，培 养皿外面塑料膜密封以防水分蒸发，４。Ｃ孵育过夜；ｄ．取出培养皿，室温脱色摇床上轻摇孵育１―２ｈ，以期一抗更好结合；ｅ．ＴＢＳＴ缓冲液洗ＰＶＤＦ膜三次，每次１ ０ｍｉｎ，以去除未结合一抗； ｆ．－－抗按ｌ：７５００稀释，将ＰＶＤＦ膜的蛋白面向上，置入预先在培养皿中制好的槽中，上面ＪＪｎ－抗至完全覆盖，培养皿外面塑料膜密封以防水分蒸发，室温脱色摇床上轻摇孵育９０ｍｉｎ， 同上洗膜：ｇ．取出待显色的ＰＶＤＦ膜，置于洁净的培养皿中，加入现配的ＤＡＢ液显色， 观察，待充分显色后（不超过１０ｍｉｎ），双蒸水终止，凝胶成像仪成像。⑥统计学处理：结果采用Ｘ＋Ｓ表示，采用ＳＰＳＳｌ．０软件的ｑ检验进行分析。２．结果２．１肝星状细胞得率，肝星状细胞活率，肝星状细胞纯度见第一部分。１９重庆医科大学硕士研究生学位论文２．２丹参素和渥曼青霉素对肝星状细胞增殖的抑制作用在浓度为０．０６２５ｍｍｏｌ／Ｌ，０．１２５ｍｍｏｌ／Ｌ，０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ时，丹参素对肝星状细胞 的增殖有明显抑制作用，并且其抑制作用随着丹参素浓度的提高而增强。在浓度为２０ｎｍｏｌ／Ｌ，４０ ｎｍｏｌ／Ｌ，６０ ｎｍｏｌ／Ｌ时，渥曼青霉素对肝星状细胞的增殖有明显抑制作用，并且其抑制作用随着渥曼青霉素浓度的提高而增强（表２―１，图２―１）。表２―１丹参素和渥曼青霉素对ＨＳＣ增殖的影响组别Ａ（ｎ；９，一Ｘ士Ｓ）０．６４＋０．０２５ ｍｍｏｌ／Ｌ对照组丹参素０．０６２５ 丹参素０．１２５丹参素０．２５０．５８士０．０３４＊＊△ ０．５０士０．０４１｝＋☆０．３６土－０．０１９｝半ｏ ０．５２士０．０２７＊＊▲ｍｍｏｌ／ＬｍｍｏＶＬ渥曼青霉素２０ ｎｍｏｌ／Ｌ 渥曼青霉素４０ ｎｍｏｌ／Ｌ 渥曼青霉素６０ ｎｍｏｌ／Ｌ０．４５士０．０２４＊＊★０．３５士０．０２０｝木●｝｝与对照组相比，ｐ＜０．０１。☆组与△相比有显著差异ｐ＜０．０１，。组与☆组相比有显著差异ｐ＜０．０１。 ★组与▲组相比有显著差异ｐ＜０．０１，?组与★组相比有显著差异ｐ＜０．０１。Ｏ．７ ０．６ ０．５ Ｏ．４ Ｏ．３ Ｏ．２ Ｏ．１ ０●瞄绷罄”爨ｊ爵鹫‘嘲瓤ｌｉ释强≈目麟∞％ｉ嚣“黼“簿？鬻器？；¨ 象ｒ。：｝－强“黼 ≯藏堑鬻蒸ｊｌ攀｜：｛“≯镤熬；爱。ｉ豢ｉ磐”重庆医科大学硕士研究生学位论文２．３丹参素和渥曼青霉素对肝星状细胞增殖周期的影响随着丹参素和渥曼青霉素浓度的增加，Ｇｏ／Ｇｌ期细胞比例逐渐增多，Ｓ期细胞比例逐渐下降，Ｇ２／Ｍ期细胞变化不明显，表明丹参素和渥曼青霉素可阻滞ＨＳＣ由Ｇｏ／Ｇｌ进入Ｓ期。（表２―２，图２―２，２―３，２―４，２―５，２―６，２―７，２―８，２―９）表２―２丹参素和渥曼青霉素对ＨＳＣ细胞周期的影响★★与对照组相比，ｐ＜０．０１。各细胞周期中☆组与△相比有显著差异ｐ＜０．０１，。组与☆组相比有 显著差异ｐ＜０．０１。★组与▲组相比有显著差异ｐ＜０．ｏｌ，?组与★组相比有显著差异ｐ＜０．０１。７０＿６０ ５０ ４０ ３０ ２０１ ０‘一｛｝；｜ＩＩ。一ＩＩ●ｌ０ｔ ｔ ｔ ｔ ｉｋ ｔ ｛ｉ ｔ…ｆｊ二∽ｗ１：皑ｊ¨，卜ｆ’１图２―２丹参素和渥曼青霉素对ＨＳＣ细胞周期影响的直方图 Ｄ１一丹参素ｏ．０６２５ ｍｍｏｌ／Ｌ；Ｄ２．丹参素０．１ ２５ ｍｍｏｌ／Ｌ；Ｄ３．丹参素ｏ．２５ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｗ Ｉ一渥曼青霉素２０ ｎｍｏｌ／Ｌ；Ｗ２．渥曼青霉素４０ ｎｍｏｉ／Ｌ；Ｗ３一渥曼青霉素６０ ｎｍｏｌ／Ｌ２１重庆医科大学硕士研究生学位论文２，４丹参素和渥曼青霉素对肝星状细胞中Ａｋｔ表达的影响用不同浓度丹参素和渥曼青霉素处理肝星状细胞２４小时后，均有Ａｋｔ蛋白的 表达条带，各组Ａｋｔ蛋白条带的密度强度差别不明显。（图２―１０） 不同浓度的丹参素和渥曼青霉素处理肝星状细胞２４小时后，均有ｐ＿Ａｋｔ蛋白 的表达条带，但条带的光密度强度不同，磷酸化蛋白在对照组表达最强，随着丹 参素和渥曼青霉素浓度的增加，其表达程度逐渐减弱。（图２―１１）３．讨论肝星状细胞（ＨＳＣ）的激活是肝纤维化发生、发展的中心环节，被看作抗纤维化 治疗的主要靶细胞。由于各种因素的作用，肝脏炎症持续存在时，ＨＳＣ被激活， 转化为肌成纤维样细胞，脂滴消失，收缩力增强，并分泌大量细胞外基质沉积于 Ｄｉｓｓ间隙，导致肝窦阻力增加，形成肝纤维化‘８】ｆ９１，因此，抑制ＨＳＣ增殖是抗肝 纤维化的重要途径之一。 磷脂酰肌醇３激酶（Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３－ｋｉｎａｓｅｓ，Ｐ１３一Ｋ）是一种蛋白酪氨酸激酶， 广泛地分布在真核生物的各种细胞中。蛋白激酶Ｂ（ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＢ，ＰＫＢ）又称Ａｋｔ．是Ｐ１３Ｋ下游的靶蛋白。目前在与Ｐ１３Ｋ相关的信号途径中研究较多的是Ｐ１３Ｋ／Ａｌ（ｔ 信号途径，该途径在细胞的生长、增殖、分化、凋亡等方面发挥着重要作用。在 哺乳动物细胞中，Ｐ１３．Ｋ是调节亚基Ｐ８５和催化亚基Ｐｌ ｌＯ构成的异源二聚体，分 为Ｉ、ＩＩ、ＩＩｌ３个亚型，其作用是将磷脂酰肌醇环上的第３位羟基进行磷酸化【ｌｏｌ。 Ａｋｔ，是一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，Ａｋｔ氨基端含有一个血小板一白细胞Ｃ激 酶底物同源结构区域（ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ，ＰＨ域），该结构域特异性作用于底物中 丝氨酸／苏氨酸残基并使其磷酸化。活化的Ｐ１３Ｋ催化细胞膜上磷脂酰肌醇４，５一二 磷酸（ＰＩＰ２）磷酸化，形成磷脂酰肌醇３，４，５．三磷酸（ＰＩＰ３），ＰＩＰ３与Ａｋｔ的ＰＨ功能区 结合，使Ａｋｔ从胞质转移到细胞膜，在ＰＤＫｌ或ＰＤＫ２的催化下Ａｋｔ的Ｔｈｒ３０８或 Ｓｅｒ４７３发生磷酸化，使Ａｋｔ成为有活性的激酶。磷酸化的Ａｋｔ（ｐ．Ａｋｔ）可诱导细胞 增殖【１１】。Ｐ１３．Ｋ／Ａｋｔ信号通路与ＥＲＫ信号通路联合，介导细胞周期蛋白Ｄ１（Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１，ＣＤｌ）的转录，这对于细胞周期依赖性蛋白激酶（ＣＤＫｓ）的激活和Ｇ１期的顺 利进行非常重要‘１柏。有研究表明，抑制Ｐ１３Ｋ活性后细胞的增殖明显被抑制，表重庆医科大学硕士研究生学位论文现为细胞周期阻滞、Ｇｌ期周期蛋白ＣｙｃｌｉｎＤｌ和ＣＤＫ４表达量减少¨”。 丹参素是丹参的水溶性有效成分，其结构为３，４．二羟基苯乳酸 【Ｄ．（＋）一ｐ一（３，４．ｄｉｈｙｄｏｘｙ ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）］，是从唇形科鼠尾草属植物丹参干燥根部提 取液中分离得到的一种有效成分，具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦的功效。 目前已知丹参素可降低肝脏的丙二醇含量，具有抗氧自由基及抗脂质过氧化的作 用；丹参素还可以降低谷丙转氨酶（ＡＬＴ），使血浆纤维连接蛋白（ＰＦＮ）升高， 提高其网状内皮系统的吞噬功能及调理素活性，防止肝脏的免疫损伤；丹参素是 一种良好的羟自由基清除剂，能够抑制脂质过氧化，保护线粒体，进而促进肝细 胞再生；丹参素可以改善微循环，活血化瘀；丹参素还可以通过抑制ＮＯ的诱导体 的表达，减少毒性作用ＮＯ产生，从而促进ＮＯ发挥改善微循环、抑制血小板聚集等 保护作用【１４１。丹参可通过促进激活的大鼠肝星状细胞表达Ｆａｓｌ抑铝ｆＪｂｃｌ－－２表达和 促进ｂａｘ的表达，诱导星状细胞凋亡。已有的研究表明，诱导激活的肝星状细胞发 生凋亡可防治实验性大鼠肝纤维化，激活的星状细胞可通过以下环节发生凋亡： Ｆａｓ―Ｆａｓｌ、下调ｂｃｌ一２、上调ｂａｘ［１ｓＪ、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体．２／死亡受体一５（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－ｒｅｌａｔｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－２／ｄｅａｔｈｒｅｃｅｐｔｏｒ－５，ＴＲＡＩＬＲ２／ＤＲ５）和神经生长因子低亲和力受体ｐ７５ｔ１６１。丹参可促进激活 的星状细胞的Ｆａｓｌ及Ｆａｓ表达增强，提示丹参通过增加激活的星状细胞的Ｆａｓｌ和Ｆａｓ 表达，ＦａｓＬ和自身Ｆａｓ结合，并通过ＦＡＤＤ（Ｆａｓ－－－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎｐｒｏｔｅｉｎ）传递死亡信号，启动胱门蛋白酶（ｃａｓｐａｓｅ），从而导致星状细胞凋亡。 渥曼青霉素（Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ）是一种常用的Ｐ１３Ｋ／Ａｋｔ特异性抑制剂，Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ 可以通透细胞膜，与Ｐ１３Ｋ的１１０ｋＤ催化亚基相结合，可特异性抑匍］Ｐ１３Ｋ，抑制 Ｐ１３Ｋ／Ａｋｔ信号途径，并抑铝ｉＪＡｋｔ磷酸化。有研究证明渥曼青霉素使肝星状细胞停滞于Ｇｌ则１７】。本实验用渥曼青霉素与丹参素做对照，以期了解丹参素对Ｐ１３Ｋ／Ａｋｔ信号通路有无影响。ＭＴＴ分析法是以活细胞代谢物还原剂ＭＴＴ噻唑蓝【３．（４，５）－ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｈｉａｚｏ （．ｚ―ｙ１）一３，５一ｄｉ－ｐｈｅｎｙｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｒｏｍｉｄｅ］为基础的一种简便、快速、敏感较高的检测 细胞成活率的方法。ＭＴＴ为黄色化合物，是一种可接受氢离子的染料，可作用于 活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素Ｃ的作用下使四唑环裂开， 生成蓝色的结晶，结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶重庆医科大学硕士研究生学位论文消失，不能将ＭＴＴ还原）。还原生成的结晶可在含５０％的Ｎ’Ｎ．二甲基甲酰胺和２０％ 的十二甲基磺酸钠（ｐＨ ４．７）的Ｍ１ｖｒ溶解液中溶解，利用酶标仪测定４９０ ｎ／ｌｌ处的光密度（ＯＤ）值，以反映出活细胞数目。本实验用ＭＴＴ检测发现渥曼青霉素大于２０ ｎｍｏｌ／Ｌ时可明显抑制ＨＳＣ的增殖，当浓度提高到４０ ｎｍｏｌ／Ｌ和６０ ｎｍｏｌ／Ｌ后， 抑制作用依次增强。并用ＭＴＴ检测出丹参素同样也可抑制ＨＳＣ的增殖，丹参素 浓度为Ｏ．０６２５ ｍｍｏｌ／Ｌ时抑制作用明显，随着丹参素浓度的增加，其抑制作用越明 显。 流式细胞术（ｆｌｏｗ ｅｙｔｏｍｅｔｒｙ，ＦＣＭ）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确地在保持细胞及细胞器或者微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选的技术。 本实验用流式细胞术检测丹参素和渥曼青霉素作用２４小时后的肝星状细胞的细胞 周期，发现两种药物均可使ＨＳＣ的Ｇ１期细胞增多，Ｓ期细胞减少，Ｇ２／Ｍ期细胞 变化不明显。 Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹（ｗｅｓｔｅｍ ｂｌｏｔ）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体检测 蛋白质表达的方法。用ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测丹参素和渥曼青霉素作用后的肝星状细胞 中的Ａｋｔ和Ｐ．Ａｋｔ的表达，发现Ａｋｔ的表达并无明显差异，但是Ｐ．Ａｋｔ的表达随丹 参素和渥曼青霉素浓度增加而减少，提示丹参素可以通过抑制ｐ－Ａｋｔ而抑制肝星状 细胞的增殖。 本研究结果表明Ｐ１３Ｋ／Ａｋｔｔ信号通路也许可以成为肝纤维化治疗的一个靶点， 抑制ｐ－Ａｋｔ的表达可能是丹参素诱导ＨＳＣ凋亡并抑制其增殖的原因之一，在治疗 肝纤维化时联合使用丹参素可能是一种有效的方法。２４重庆医科大学硕士研究生学位论文全文结论原位循环灌流法可以成功分离得到产量高、纯度高、活性高的大鼠肝星状细 胞。ＨＳＣ经鉴定后传代培养，通过Ｍ１ｖｒ实验观察丹参素和渥曼青霉素对ＨＳＣ活 化增殖的影响；流式细胞术检测丹参素和渥曼青霉素对ＨＳＣ细胞周期的影响；最后用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测被不同浓度的药物作用２４小时后的ＨＳＣ中Ａｋｔ和ｐ－Ａｋｔ的表达情况。实验得出：丹参素可以抑制肝星状细胞的增殖，使ＨＳＣ的Ｇｌ期细胞增 多，Ｓ期细胞减少，Ｇ２／Ｍ期细胞变化不明显，并使ＨＳＣ中的ｐ－Ａｋｔ蛋白的表达减 少，提示丹参素可以通过抑制ｐ－Ａｋｔ而抑制肝星状细胞的增殖。２５重庆医科大学硕士研究生学位论文参考文献【ｌ】ＧｅｅｒｔＡ，Ｎｉｋｉ Ｔ，Ｈｅｌｌｅｍａｎｓ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｔ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｓｉｄｅｃａｔｔｅｒ ａｃｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓｏｒｔｉｎｇ［Ｊ】．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１ ９９８，２７：５９０－５９８【２】罗云，戴立里，沈鼎明．原位循环灌流法分离大鼠肝星状细胞【Ｊ】．重庆医科大学学报，２００２，２７（１）：４８．５０【３】郑元义，戴立里．丹参素抗肝纤维化的实验研究．中华肝脏病杂志【Ｊ】，２００５，４（２）：３３－３５ 【４】ＲｏｙＫａｔｓｏ，Ｋｌａｕｓ Ｏｋｋｅｎｈａｕｇ，Ｋｈａｔｅｒｅｈ Ａｈｒｎａｄｉ，ＳａｒａｈＷｈｉｔｅ，Ｊｏｈｎ Ｔｉｍｍｓ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｄ．Ｗａｔｅｒｆｉｅｌｄ．Ｃｅｌｌｕｌａｒｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｅｄ３－ｋｉｎａｓｅｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ，ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ ｍｎｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏ，２００１．１７：６１ ５―６７５．【５】Ｎｅｄ ＬＭ，Ｂｏｒｇａｔｔｉ Ｐ，ＣａｐｉｔａｎｉＳ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３－ｋｉｎａｓｅ／ＡＫＴｐａｔｈｗａｙ－ａ ｎｅｗ ｓｅｃｏｎｄ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００２，ｌ ５８４（２＿－３）：７３―８０．３一ｋｉｎａｓ．ｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓａｓ【６】ＷａｒｄＳＧ，Ｆｉｎａｎ Ｐ．１ｓｏｆｏｒｍ?ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ．Ｐｈａｒｍａｃ０１．２００３：３：４２６－４３４．【７】徐永锋，管洪庚，薛万江．磷脂酰肌醇３（Ｐ１３Ｋ）激酶信号途径对血小板源生长 因子促肝星状细胞增殖与Ｉ型胶原表达的影响．苏州大学学报，２００６；２６，（３）：３８９－－４１４【８】Ｍｉｙａｍｕｒａ Ｍ，ｅｔａ１．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｓｈｏ?ｓａｉｋｏ－ｔｏｅｘｔｒａｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ａｎｄｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅ ｌｉｖｅｒ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｐｈａｒｍ【Ｊ】．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１９９８，５０：９７－１０５．【９】ＳａｋａｉｄａＩ，ｅｔ ａ１．Ｈｅｒｂａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅＳｈｏ－ｓａｉｋｏ－ｔｏ（ＴＪ一９）ｐｒｅｖｅｎｔｓａｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ａｎｄｅｎｚｙｍｅ―ａｌｔｅｒｅｄ ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ贬ｎ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙａｃｉｄ―ｄｅｆｉｎｅｄｃｈｏｌｉｎｅ―ｄｅｆｉｃｔｉｅｎｔ Ｌ．ａｍｉｎｏｄｉｅｔ【Ｊ】．Ｈｅｐａｔｏｌ，１ ９９８，２８：２９８―３０６．Ａ，Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ ＪＮ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｒｏｌｅ ｉｎ Ｂｉｏｌ【１ ０］Ｒｅｉｆ Ｓ．Ｌａｎｇｏｆｆｏｃａｌａｄｈｅｓｉｏｎ ｃｅｌｌｋｉｎａｓｅ－ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｏｎｓｉｔｏｌ３－ｋｉｎａｓｅ―ａｋｔ ｃｏｌｌａｇｅｎｈｅｐａｔｉｃｓｔｅｌｌａｔｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｔｙｐｅＩｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ】．Ｃｈｅｍ，２００３，２７８：８０８２ｍ８０９０．【ｌ １］ＺｈｏｕＨＬ，Ｌｉ ＸＭ，Ｍｅｉｎｋｏｔｈ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ａｋｔ Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｔａＰｏｓｔ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＬｅｖｅｌ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２０００，１５１（３）：４８３－４９４．重庆医科大学硕士研究生学位论文【１２］ＳｈｅｒｒＣＪ，ＲｏｂｅｒｔｓＪＭ：Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆｍａｍｍａｌｉａｎＧ１ ｅｙｃｌｉｎ―ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅｓ．Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ １９９５，９：１ １４９?１ １６３【１ ３］ＪｕｃｋｅｒｏｆａＭ，Ｓｕｄｅｌ Ｋ，Ｈｏｒｎ Ｓ，Ｓｉｃｋｅｌ Ｍ，Ｗｅｇｎｅｒ Ｗ，Ｆｉｅｄｌｅｒ Ｗ，Ｆｅｌｄｍａｎ ＲＡ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌｍｕｔａｔｅｄ ｆｏｒｍ ｏｆ ｔｈｅ ｐ８５ａｌｐｈａ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙａ３－ｋｉｎａｓｅ ｉｎ ８９４．９０１．Ｈｏｄｇｌｄｎ’Ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ－ｄｅｒｉｖｅｄｃｅｌｌｌｉｎｅ（ｃｏ）．Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２００２，１６：【１ ４］ＮａｎｏｒＪＸ，Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｂｉｌｅ ｄｕｃｔ ｌｉｇａｔｉｏｎｃａｒｂｏｎ ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｉｄｅ ｉｎｒａｔｓ【Ｊ】．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００２，５４：５５５―５６３．【１５］ＳａｉｌＢ，Ｋｎｉｔｔｅｌ Ｔ，Ｍａｔｔｈｅｓ Ｎ，ｅｔ ａ１．ＣＤ９５／ＣＤ９５Ｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆｔｈｅｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌ：ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ ｕｎｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｈｅｐａｔｉｃ ｔｉｓｓｕｅｒｅｐａｉｒ［Ｊ］．Ａｍ ＪＰａｔｈｏｌ，１ ９９７，１ ５１（５）：１ ２６５．【１ ６］Ｔｒｉｍ Ｎ，ＭｏｒｇａｎｎｅｒｖｅＳ，Ｅｖａｎｓ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓ ｔｈｅ ｌｏｗ ａｆｆｉｎｉｔｙｎｅｒｖｅｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐ７５ ａｎｄ ｕｎｄｅｒｇｏ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ，２００２，１ ５６（４）：１ ２３５．【１ ７】卢春风，刘明远，王丽敏．Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ对离体肝星状细胞增殖的影响【Ｊ】．解剖学研究，２００４，２６（４）：２５０－－２５ １２７重庆医科大学硕士研究生学位论文附图鼢舻蕊％图１―１：刚分离出的原代肝星状细胞（）【５０）Ｆｉ９１ Ｒａｔ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｈｔｅ ｃｅｌｌｓ ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｔ！ｐｒｉｍａｒｉｌｙ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｄｙｅｄ ｗｉｔｈＤｐａｎｌａｎｄ（×５０）溪潼囊酶目１―２：原代培养１０天后肝星状细胞ｄｅｓｍｉｎ免疫化学染色（ＳＡＢＣ×１００）Ｆｉｇ １－３ ｌｍｍｕｎｏｃｙｔｏｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｆｏｒ ｄｅｓｍｉｎ ｏｆ ｒａｔ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ １０ ｄａｙｓ ｏｆ ｉｎｃｕｂａｔｉｎｇ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｍｒｅ（ＳＡＢＣｘｌ００）重庆医科大学硕士研究生学位论文，’ｉ／≯晕、。》赣囊－涮幅√～ｌ豢Ｆｉｇ １－４ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｆｏｒ ｉｎｃｕｂａｔｉｎｇ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ以≮ Ｉ；Ｉ势》炒｜肇～ 箩 ≯《ｏｆ ｒａｔ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｇａｔｅ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ １０ ｄａｙｓ ｏｆ囤１―３：原代培养１０天后肝星状知胞ａ－ＳＭＡ免疫化学染色（ＳＡＢＣｘｌ００）ａ－ＳＭＡｃｕｌｔｕｒｅ（ＳＡＢＣｘｌ００）ｌ：｛Ｊ ｋ一！瓮图２―３流式细胞仪检测空白组肝星状细胞细胞周期Ｆｉｇ ２－３Ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅｏｆｎｏｒｍａｌ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｌｅ ｃｅｉｌｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙｔｈｅｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｌｒｙ．重庆｜基科大学硕上研究生学位论文ｌ¨Ｌ≯｜＼一３０重庆医科大学硕士研究生学位论文Ｌ图２Ｆｉｇ６流式细胞仪检测浓度为ｏ．２５ｍｍｏｌ／Ｌ的丹参素对肝星状细胞周期的影响ｏｎ２－６ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｔｈｅｃｅｌｌｃｙｃｌｅｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅｉｎｃｕｂａｔｅｄ ｗｉｔｈｄａｎｓｈｅｎｓｕ（０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ）ｆｏｒ ２４ ｈｏｕｒｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．图２―７流式细胞仪检测浓度为２０ｎｍｏｌ／Ｌ渥曼青霉素对肝星状细胞周期的影响Ｆｉｇ ２－７ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｏｉｌｔｈｅ ｃｅｌｌｃｙｃｌｅ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅｃｅｌｌｓｗｈｉｃｈｗｅｒｅｉｎｃｕｂａｔｅｄ ｗｉｔｈＷｏｒｔｍａｎｎｉｎ（２０ｎｍｏｌ／Ｌ）ｆｏｒ２４ ｈｏｕｒ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．重庆医科大学硕士研究生学位论文▲Ｉ一图２Ｆｉｇ ２－９ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｏＲ！兰兰叠．９流式细胞杖检测浓度为６０ｎｍｏｌ／Ｌ渥曼青霉素对肝星状细胞周期的影响ｔｈｅｃｅｌｌｃｙｃｌｅ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ ｗｈｉｃｈｗｅｒｅｉｎｃｕｂａｔｅｄ ｗｉｔｈＷｏｒｔｍａｎｎｉｎ（６０ｎｍｏｌ／Ｌ）ｆｏｒ２４ ｈｏｕｒｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙｔｈｅｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．重庆睡科大学硕Ｌ研究生学位论文●＿●●＿◆●ｍ◆－睡●◆●●１３ａｃｔｉｏ，图２一１０不同浓度丹参素和渥曼青霉素处理肝星状细胞２４小时后，用ｗｅｓｔｅｒｎ检测的Ａｋｔ 蛋白的表达条带。（１：空白对照组：２：丹参素０．０６２５ｒｅｔｏｏｌ／Ｌ；３：丹参素０．１２５ｒｅｔｏｏｌ／Ｌ；４：丹 参素０．２５ ｍｍｏｌ／Ｌ；５渥曼青霉素２０ ｎｍｏｌ／Ｌ；６：渥曼青霉素４０ ｎｍｏｌ／Ｌ；７：渥曼青霉素６０ｎｍｏｌｆＬ）Ｆｉｇ ２－１０ Ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｋｔ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｉｎｃｕｂａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＤａｎｓｈｅｎｓｕｏｒＷｏｒｔｍａｎｎｉｎｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ．ｒｌ：Ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ ｃｅｌｌｓ；２：Ｄａｎｓｈｅｎｓｕ０．０６２５ ｒｅｔｏｏｌ／Ｌ；３．Ｄａｎｓｈｅｎｓｕ ０．１２５ ｍｍｏｌ／Ｌ；４：Ｄａｎｓｈｅｎｓａ ０．２５ｒｅｔｏｏｌ／Ｌ；５：Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ２０ｎｍｏｌ／Ｌ；６．Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ４０ｎｍｏｌ／Ｌ；７．Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ６０ ｎｍｏｌ／Ｌ）?－●＇●●－●―■―ｌ＿●●―－●９址：口一ｍｎ图２―１１不同浓度丹参素和渥曼青霉素处理肝星状细胞２４小时后，用ｗｅｓｔｅｒｎ检测的ｐ－Ａｋｔ 蛋白的表速条带．（１：空白对照组：２：丹参素ｏ ０６２５ｍｍｏｌ／Ｌ；３：丹参素ｏ．１２５ｍｍｏＵＬ；４：丹 参素ｏ．２５ ｍｍｏｌ／Ｌ；５渥曼青霉素２０ ｎｍｏｌ／Ｌ；６：涯曼青霉素４０ ｎｍｏｌ／Ｌ；７：涅曼青霉素６０ｎｍｏｌ／Ｌ）Ｆｉｇ ２－ＩＩ Ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐ―Ａｋｔ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｉｎｃｕｂａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＤａｎｓｈｅｎｓｕｏｒＷｏｒｔｍａｎｎｉｎｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ．（１：Ｔｈｅｎｏｒｍａｌ ｃｅｌｌｓ；２：Ｄａｎｓｈｅｎｓｕ０．０６２５ ｍｍｏｌ／Ｌ；３．Ｄａｎｓｈｅｎｓｕ ０．１２５ ｍｍｏＦＬ；４：Ｄａｎｓｈｅｎｓｕ ０．２５ｒｅｔｏｏｌ／Ｌ；５：Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ２０ｎｍｏｌ／Ｌ；６．Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ４０ｎｍｏＦＬ；７．Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ６０ ｎｍｏｌ／Ｌ）重庆医科大学硕士研究生学位论文文献综述磷脂酰肌醇３激酶（Ｐ１３－Ｋ）／蛋白激酶Ｂ（Ａｋｔ）信号途径 对细胞增殖和凋亡的影响１．引言蛋白酪氨酸激酶是一类将ＡＴＰ的＾ｒ磷酸基转移到底物的特定氨基酸残基的激 酶，它通过磷酸化调节蛋白质的活性，并通过蛋白质的逐步磷酸化使信号放大，引起细胞反应。磷脂酰肌醇３激酶（Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３－ｋｉｎａｓｅｓ，Ｐ１３．Ｋ）是蛋白酪氨酸激酶中的一种，广泛地分布在真核生物的各种细胞中，目前在与Ｐ１３Ｋ相关的信号 途径中研究较多的是Ｐ１３Ｋ／Ａｋｔ信号途径，该途径在细胞的生长、增殖、分化、凋亡 等方面发挥着重要作用。本文仅就Ｐ１３．Ｋ／Ａｋｔ途径对细胞增殖和凋亡的影响作一综述。２．Ｐ１３．Ｋ及Ａｋｔ的结构特点２．１Ｐ１３一Ｋ结构及分型在哺乳动物细胞中，Ｐ１３．Ｋ是调节亚基Ｐ８５和催化亚基Ｐ１ １ ０构成的异源二聚 体。调节亚基Ｐ８５相对分子质量为８５ＫＤ，目前已发现至少５种Ｐ１３Ｋ调节亚基异 构体，即Ｐ８５ａ、ｖ８５１３、Ｐ５５ａ、Ｐ５５，、／及Ｐ５００［１１。其氨基端有１个ＳＨ３区域即Ｓｒｃ同源结构域３（Ｓｒｃ ｈｏｍｏｌｏｇｙ－３ ｄｏｍａｉｎ，ＳＨ３），羧基端有２个ＳＨ２区域即Ｓｒｃ同源 结构域２（Ｓｒｃ ｈｏｍｏｌｏｇｙ－２ ｄｏｍａｉｎ，ＳＨ２），中间编码区是与催化亚基Ｐ１１０结合的区 域。催化亚基ＰＩ １０包含Ｇｔ、ｐ、丫、６４种异构体，相对分子质量为ｌ １０ＫＤＩ¨，由催化域、Ｃ２结构域、Ｒａｓ结构域构成。它本身具有Ｓｅｒ／Ｔｈｒ激酶的活性，也具有磷脂 酰肌醇激酶的活性。 Ｐ１３．Ｋ分为Ｉ、ＩＩ、ＩＩｌ３个亚型，其作用是将磷脂酰肌醇环上的第３位羟基进行磷酸化。Ｉ型分为Ｉ Ａ和ｌ Ｂ亚类，Ｉ Ａ亚类包括催化亚单位ｐｌｌｏｃｔ、ｐｌｌ０１３、ｐｌｌＯ｛ｉ， 能与调节亚单位ｐ８５、ｐ５５、ｐ５０形成二聚体；Ｉ Ｂ亚类即催化亚单位ｐｌｌｏｙ。与Ｉ型Ｐ１３一Ｋ偶联的主要受体底物是磷脂酰肌醇４，５一二磷酸［Ｐｔｄｌｎｓ（４，５）Ｐ２］，二者相互 作用可产生最重要的磷脂酰肌醇一３，４，５－三磷酸［Ｐｔｄｌｎｓ（３，４，５）Ｐ３】；ＩＩ型Ｐ１３．Ｋ是 含有Ｃ２结构域的Ｐ１３Ｋ，包括三种亚型：Ｐ１３一ＫＣ２ａ、Ｐ１３一ＫＣ２１３、ＰＩＣ３．ＫＣ２７［１１，作用底物为磷脂酰肌醇（３，４）二磷酸【Ｐｔｄｌｎｓ（３，４）Ｐ２］和磷脂酰肌醇（Ｐｔｄｌｎｓ）；ＩＩＩ型３４重庆医科大学硕士研究生学位论文Ｐ１３．Ｋ是在哺乳动物细胞内发现的与酵母的ＶＰＳ３４分子结构同源的蛋白【ｌ】’仅以磷 脂酰肌醇（Ｐｔｄｌｎｓ）作为底物，尚未发现他们受细胞表面受体调节。２．２Ａｋｔ的结构及分型 Ａｋｔ，又称蛋白激酶Ｂ（ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＢ，ＰＫＢ），是一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶。目前发现至少存在３种Ａｋｔ家族成员：Ａｋｔｌ／ＰＫＢａ、Ａｋｔ２／ＰＫＢ］３、Ａｋｔ３／ＰＫＢ７。 Ａｋｔ氨基端含有一个血小板一白细胞Ｃ激酶底物同源结构区域（ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎｈｏｍｏｌｏｇｙ，ＰＨ域），该结构域特异性作用于底物中丝氨酸／苏氨酸残基并使其磷酸化，Ａｋｔ羧基 端是疏水区，富含脯氨酸【２１。 ３．Ｐ１３．Ｋ／Ａｋｔ信号转导通路３．１Ｐ１３一Ｋ／Ａｋｔ的激活：调节亚基Ｐ８５将催化亚基Ｐ１ｌＯ募集至活化的酪氨酸激酶受体，并在胞浆内与受 体形成复合物，然后催化亚基Ｐ１１０便可转移到细胞膜，在细胞膜磷酸化其底物。 底物磷酸化的结果是在质膜上产生第二信使磷脂酰肌醇三磷酸ＰＩＰ３。ＰＩＰ３与Ａｋｔ的 ＰＨ区结合，导致Ａｋｔ的Ｓｅｒ４７３和Ｔｈｒ３０８位点磷酸化，从而激活Ａｋｔ。活化的Ａｋｔ再激活其下游靶蛋白――凋亡相关分子ＢＡＤ、凋亡相关分子ｃａｓｐａｓｅ－９（ａｐｏｐｔｏｓｉｓｒｅｌａｔｅｄ ｅｙｓｔｅｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅ，ＣＡＳＰ９）、核转录因子（ＮＦ一１ｃＢ）、糖原合成酶３（ＧＳＫ３）、叉头转录因子（ＦＫＨＲ）、细胞周期素（ＣＤＫ）抑制物ｐ２１ｅｉ＃Ｆｆｌ］ｐ２７酬Ｐ等，进而调节 细胞的增殖、分化、凋亡以及迁移【３１。３．２Ｐ１３．Ｋ／Ａｋｔ的抑制：渥曼青霉素（Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ）、Ｌｙ２９４００２是抑制Ｐ１３．Ｋ活性的两种特异性抑制剂１１１， 渥曼青霉素（Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ）是一种真菌代谢产物，对Ｐ１３Ｋ呈不可逆性抑制作用，Ｗａｓｉｍ等发现Ｌｙ２９４００２ ｐ－－Ｊ＂Ｉ范通过阻滞细胞膜上的钾离子通道而抑制Ｐ１３－Ｋ的活性 【４１，但Ｌｙ２９４００２的抑制作用是可逆的。抑癌基因ＰＴＥＮ以及抑癌基因ＳＨＩＰ可以使磷脂酰肌醇的３位及５位去磷酸化，是磷脂酰肌醇一磷酸（ＰＩＰ）和磷脂酰肌醇二磷酸 （ＰＩＰ２）降解、转化及Ｐ１３．Ｋ信号传导终止的负调控分子。４．Ｐ１３．Ｋ／Ａｋｔ信号途径对细胞增殖的影响４．１Ｐ１３．Ｋ／Ａｋｔ信号途径对Ｇ１／Ｓ期的调节周期蛋白（Ｃｙｃｌｉｎ）和周期蛋白依赖性激酶（ＣＤＫｓ）是细胞周期的正向调节因子， 细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（ｃｌ（ｉ）是周期的负向调节因子。Ｐ１３Ｋ／Ａｋｔ信号传导３５重庆医科大学硕士研究生学位论文通路可通过增力ｌｌＣｙｃｌｉｎｓ和ＣＤＫｓ的表达以及抑制细胞周期依赖蛋Ｅａ９０Ｎ＠ｐ２７“＇ｐ１的 表达而促进Ｇｌ期进展，促进细胞增殖与分化【ｌ Ｊ。 Ｐ１３．Ｋ／Ａｋｔ信号通路与ＥＲＫ信号通路联合，介导细胞周期蛋白Ｄ１（ＣｙｃｌｉｎＤＩ，ＣＤｌ）的转录，这对于细胞周期依赖性蛋白激酶（ＣＤＫｓ）的激活和Ｇ１期的顺利进 行非常重要【５Ｊ。目前有证据表明Ｐ１３．Ｋ的激活可以稳定ＣＤｌ蛋白并提高ＣＤｌ的水平。 Ｐ１３．Ｋ能够激活细胞周期依赖性蛋白激酶４（ＣＤＫ４）和细胞周期依赖性蛋白激酶 ２（ＣＤＫ２），使细胞进入Ｓ期并诱导ＤＮＡ的合成【６】。 细胞周期依赖蛋白抑制物ｐ２７ｋｊｐｌ可使细胞周期停滞于Ｇｌ期。进一步的研究显示，Ｐ１３Ｋ能够对细胞周期依赖蛋白抑制物ｐ２７“Ｐ１的表达产生调节作用【ｌ】，Ｐ１３Ｋ通过Ａｋｔ的磷酸化和叉头蛋白家族的灭活来下调ｐ２７ｂｐＪ，有利于Ｇ１期顺利进行。 Ｃｏｌｌａｄｏ等应用Ｐ１３－Ｋ的抑制剂ＬＹ２９４００２作用于人胶质瘤Ｕ８７ＭＧ细胞，结果发现人胶质瘤Ｕ８７ＭＧ细胞ｐ２７酬ｌｐ表达升高，细胞阻滞在Ｇ１期。Ｇｒａｆｔ等研究证实，Ｐ１３Ｋ／心的激活能够抑制叉头相关转录因子介导的ｐ２７“ｐ１表达。最近在！Ｈｏｄｇｋｉｎ’Ｓ淋巴瘤分离出突变的ｐ８５ａ基因【７】，在乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌等多种肿瘤中发现Ｐ１１０ 和Ａｋｔ编码基因突变或扩增【８】，抑铝Ｉ］Ｐ１３Ｋ活性后细胞的增殖明显被抑制，表现为细 胞周期阻滞、Ｇ１期周期蛋Ｉ兰ＩＣｙｃｌｉｎＤｌ和ＣＤＫ４表达量减少，这种细胞周期的阻滞能 因细胞中激活的Ａｋｔ及其下游分子ｐ７０的Ｓ６激酶（ｐ７０Ｓ６Ｋ）的表达而恢复，ｐ７０Ｓ６ｋ 是哺乳动物体内蛋白质合成的重要物质，可以使细胞进入Ｓ期。在黑色素瘤及骨肉 瘤细胞株中，Ｐ１３Ｋ抑制剂可以诱导ｐ２７ｂｐｌ的表达，导致Ｇｌ期阻滞，从而抑制癌细 胞的增殖。４．２Ｐ１３一Ｋ／Ａｋｔ信号途径对Ｇ２／Ｍ期的调节 细胞周期蛋白Ｂ（Ｃｙｃｌｉｎ Ｂ）与细胞周期依赖性蛋白激酶１（ＣＤＫｌ）结合是细胞Ｍ期启动和运行的关键因素。细胞受损时，激活的ＣＤＫｌ作用于细胞分裂周期基因 ＣＤＣ２５，使ＣＤＣ２５上Ｓｅｒ２ １ ６位点磷酸化，磷酸化后的ＣＤＣ２５与抗凋亡结合蛋白 １４．３．３结合，并被其扣留而失活。失活的ＣＤＣ２５不能将ＣＤＣ２（ＣＤＫ的一种）的Ｔｈｒｌ４ ／Ｔｈｒｌ５上的磷酸基团去磷酸化，因此ＣＤＣ２不能被激活，导致细胞Ｇ２期阻滞，而 Ｐ１３Ｋ／Ａｋｔ可以直接激活ＣＤＣ２，使细胞顺利通过Ｇ２／Ｍ期ｆ９】。 Ｋａｎｄｅｌ等研究发现，一些细胞株如人胚肾ＨＥＫ２９３细胞株对Ｐ１３Ｋ抑制剂的反应 表现为细胞周期Ｇ２期阻滞，Ａｋｔ活化可消除该效应，提示：Ｐ１３Ｋ／Ａｋｔ通路可能参与重庆医科大学硕士研究生学位论文调控Ｇ２／Ｍ期转变。Ａｋｔ活化可以使细胞越过Ｇ２／Ｍ期检查点，逃逸ＤＮＡ损伤诱发 的凋亡，也可以通过磷酸化细胞周期依赖蛋白抑制物ｐ２１口ｐｌ使ｐ２１ａｐｌ失活．并促进ｐ５３降解，从而减少ｐ５３介导的细胞周期检查点。从此可以看出心的活化类似：：Ｊ：ｐ５３失活，可以消除细胞周期检查点，加速细胞周期的进行。 ５．Ｐ１３．Ｋ／Ａｋｔ信号途径抑制细胞凋亡的机制５．１Ｐ１３．Ｋ／Ａｋｔ信号途径对ｂｃｌ．２家族的影响 细胞凋亡是控制细胞过度增殖的一种正常细胞功能，Ｐ１３Ｋ／Ａｋｔ信号转导通路可调节ｂｃｌ．２家族成员的活性以调节细胞凋亡。ｂｃｌ．２家族成员分为凋亡抑制蛋白 和凋亡促进蛋白２类，ｂｃｌ．２、ｂｅｌ－ｘｌ、ｂｅｌ．Ｇ、ＭＣＩ―ｌ等是凋亡抑制蛋白；Ｂａｘ、Ｂａｄ、 Ｂａｋ、ｂｃｌ．Ｂ等是凋亡促进蛋白。ｂｃｌ．２家族的凋亡抑制蛋白和凋亡促进蛋白之间的平 衡是决定细胞生存或凋亡的关键。Ｂａｄ是Ｂｃｌ．２同源结构域３相关蛋白，它在非磷酸化 状态（即活化状态）下，既能够激活Ｂｃｌ．２家族促凋亡成员如Ｂａｘ或Ｂａｋ促进细胞的凋亡， 又能够直接与抑制凋亡蛋白结合，抑制其活性，从而促进细胞的凋亡ｆ１０１。Ｐ１３Ｋ依赖性的Ａｋｔ的激活可以使促凋亡蛋［刍Ｂａｄ的Ｓｅｒｌ３６／Ｓｅｄｌ２残基磷酸化，磷酸化的Ｂａｄ与ｂｅｌ．２解聚，然后与抗凋亡结合蛋白１４―３．３相结合，同时游离的ｂｃｌ．２也发挥抗 凋亡作用【１１】。并且Ｐ１３Ｋ／Ａｋｔ通路的激活，可以使促凋亡蛋白Ｂａｘ的Ｓｅｆｌ８４残基磷 酸化而失活，从而抑制细胞凋亡Ｉｌ引。５．２Ｐ１３．Ｋ／Ａｋｔ信号途径对Ｆｏｒｋｈｅａｄ转录因子家族的影响 １９９９年Ｂｒｕｎｅｔ等证实Ｆｏｒｋｈｅａｄ转录因子家族成员是Ｐ１３．Ｋ／Ａｋｔ信号转导途径下游重要的靶基因。在哺乳动物中，活化的Ａｋｔｌ～范够磷酸化这一转录因子家族中的Ｆｏｘｏ 蛋［刍ＦｏｘｏＩ（ＦＫＨＲ），Ｆｏｘ０３ａ（ＦＫＨＲＬＩ）和Ｆｏｘ０４（ＡＦＸ）并抑制它们的核易位，降低它们 转录激活靶基因的转录活性。Ｆｏｘｏ蛋白的非磷酸化形式能够提高一些凋亡蛋白的 转录活性，如ＦａｓＬ（Ｆａｓ ｌｉｇａｎｄ，Ｆａｓ配体），ＴＲＡＩＬ（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓｉｎｄｕｃｉｎｇ ｄｅａｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｌａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｌｉｇａｎｄ，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体）和ＴＲＡＤＤ（ＴＮＦｒｅｃｅｐｔｏｒｄｏｍａｉｎ，肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域）¨３１并引起进一步的细胞凋亡，故激活的Ａｋｔ通过使Ｆｏｘｏ磷酸化而抑制细胞凋亡。５．３Ｐ１３．Ｋ／Ａｋｔ信号途径对Ｃａｓｐａｓｅ家族的影响Ｃａｓｐａｓｅ且Ｐ半胱天冬蛋白酶，在凋亡过程中起着必不可少的作用【１４】。Ｃａｓｐａｓｅ．３是凋亡效应类Ｃａｓｐａｓｅ酶，Ｃａｓｐａｓｅ一９是凋亡启动类Ｃａｓｐａｓｅ酶。在正常细胞中，核酸３７重庆医科大学硕士研究生学位论文酶和抑制物是结合在一起的，核酸酶处于无活性状态，Ｃａｓｐａｓｅ可裂解这种抑制物 从而激活核酸酶，破坏细胞ＤＮＡ的结构和功能，导致细胞凋亡。Ｐ１３Ｋ／Ａｋｔ信号转 导通路可抑常１］Ｃａｓｐａｓｅ家族成员的活化。活化的Ａｋｔ可直接抑制半胱天冬蛋白酶 Ｃａｓｐａｓｅ一３和ＣａＳｐａＳｅ．９，使其失活，从而抑制细胞凋亡１１５Ｊ。’５．４Ｐ１３一Ｋ／Ａｋｔ信号途径对ｐ５３基因家族的影响 Ｐ５３基因是一种抑癌基因，有野生型和突变型两种亚型。野生型Ｐ５３对细胞凋亡有促进作用，突变型Ｐ５３对细胞凋亡有抑制作用。当细胞ＤＮＡ由于各种原因受损 后，野生型Ｐ５３首先诱导细胞进入Ｇ１期，抑制细胞增殖，直至损伤的ＤＮＡ修复，一 旦ＤＮＡ不能被修复，野生型Ｐ５３就会活化那些诱导细胞凋亡的基因转录，使细胞发 生凋亡。新近研究发现，Ａ上ｔ通路与ｍｄｍ２－ｐ５３的功能通路有关【１６】：癌基因ｍｄｍ２是 Ａｋｔ通路下游的一个作用底物，其第１６６、１８６位丝氨酸可以特异性地被活化的Ａｋｔ 磷酸化，从而使细胞质中的Ａｋｔ―ｍｄｍ２复合物迅速解离，ｍｄｌＩｌ２进入细胞核并与ｐ５３ 结合，进而促进ｐ５３降解，抑制野生型ｐ５３的促凋亡功能１１７Ｊ，５．５Ｐ１３一Ｋ／Ａｋｔ信号途径在抑制凋亡方面的研究成果 Ｐｒｏｕｄ研究发现雷帕霉素（Ｒａｐａｍｙｃｉｎ）诱导凋亡的能力可能依赖于细胞内ｐ５３的水平【ｌ ８】。在子宫内膜癌细胞株中，Ａｋｔ过表达使细胞凋亡蛋白抑制因子Ｉ（ｃｌＡＰ．１）表达增加从而发挥抑制凋亡的作用。在缺乏功能性ｐ５３的横纹肌肉瘤中， 雷帕霉素（Ｒａｐａｍｙｃｉｎ）抑制细胞生长，诱导大量细胞凋亡；但功能性ｐ５３的表达 则保护肉瘤细胞逃逸雷帕霉素（Ｒａｐａｍｙｃｉｎ）诱导的凋亡。在乳腺癌、非小细胞肺 癌等多种恶性肿瘤中，Ｐ１３Ｋ／Ａｋｔ通路活化能够抵抗化疗、放疗引发的细胞凋亡【１９１。 选择性抑制Ｐ１３Ｋ或Ａｋｔ活性，降低Ａｋｔ磷酸化水平，将会使细胞对化疗、放疗所致 凋亡的敏感性增加。 Ｐ１３．Ｋ信号转导通路维持着细胞周期的运行，是促进细胞生长增殖，抑制细胞 凋亡的重要因素。也正因为此，该信号通路成为国内外肿瘤研究的热点，并且近 年来对于Ｐ１３．Ｋ信号转导通路在肝纤维化、胰腺疾病、肺损伤、黑色素瘤【２０】等方面的作用的研究越来越多，该信号通路有望成为疾病治疗的靶点。３８重庆医科大学硕士研究生学位论文参考文献：【１］ＲｏｙＫａｔｓｏ，Ｋｌａｕｓ Ｏｋｋｅｎｈａｕｇ，Ｋｈａｔｅｒｅｈ Ａｈｍａｄｉ，ＳａｒａｈＷｈｉｔｅ，Ｊｏｈｎ Ｔｉｍｍｓ，ｆｏｒＭｉｃｈａｅｌ Ｄ．Ｗａｔｅｒｆｉｅｌｄ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｅｄ３一ｋｉｎａｓｅｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏ