请请听下回分析一下

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2017-08-08 00:41 标签： 请听下回分析
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最近TA克隆老是失败，请大家分析一下。
PCR产物，胶回收后TA克隆，板子总长成这样，请高手分析一下原因。taq酶，宝生物的；胶回收试剂盒，全式金的；T载体，用过生工和全式金的。感受态细胞，全式金和自己制备的。之前还做出来了，上学的时候TA克隆也没出过问题，现在涂的板子老是长成下面图片这样。我自己动手做了一次，2个研究生做了一次都是下面的结果（图1：准备回收的目的片段；图2-4，平板菌液，学生发过来的，忘记那一个是水做的对照）。分析不出来原因，请高手分析一下。谢谢！
我已经把涂菌改为50ul了。请问板子中一团糊的也是因为浓度太高的缘故？
首先谢谢你详细的回答。关于你分析的几个原因，我做一下说明，你看还有没有什么建议：
1、目的片段大约750bp，我用的是2K的marher。转化之后复苏时间1个小时左右，有的时候时间比较长（不超过2小时），没有集菌。涂板用量50ul。个人感觉摇菌时间这一块应该可以优化，缩短一下时间看看效果。
2、感受态，买的感受态和自己制备的感受态现在都出现这种状况。之前我自己做的，做出实验结果的感受态细胞也是目前这种情况。感受态这一块拿不准，买的感受态，自己制作的和学生做的，都出现这样的状况。
3、Amp的问题。这个之前没考虑到，一直以为可能是载体和感受态的问题，两个都换过还是没有解决问题。Amp准备重新定一只新的。涂板只用了Amp，IPTG和x-gal没有用。
4、阴阳性对照，学生报道说也是上述情况。上述图片其中一个是加水的对照。
5、请问板子中一团糊的也是因为浓度太高的缘故，还是其他原因？涂板用量已经缩小到50ul。涂板不均匀这个试验中很常见，挑到目的基因克隆子即可。一团糊的我一直难以理解，重新做新的培养基也是这个情况。要说浓度高，上学的时候经常做，浓度也有非常高的，可没有出现过一团糊的情况。
& & 读书时做TA克隆基本没有失败过，目前出现这种情况换了一些试剂盒条件，始终没有找到有效的解决办法。
你的意思负对照也长了？
是的，加水的也是类似情况。不知是否与Amp有关？
按你说的情况，加水也出现上述情况，那么就只有两种原因了，就是我说的第二三两种，按你所说感受态出问题的可能性不大，那么就是抗生素的问题了，你可以挑取五到十个菌斑，用M13通用引物进行PCR验证，如果绝大部分有产物，说明抗生素没问题，如果大部分无产物，抗生素失效，不过前提是感受态没问题，最好换换抗生素吧
做TA克隆一团糊，基本就是平板菌量太高所致，有两个方面，一方面是转化效率太高，主要是目的片段太短，复苏时间过长，过分集菌以及培养时间过长等原因所致，第二方面就是抗生素起不到作用，这又有两个方面，一是抗生素失效，无法杀死空菌，二是抗生素假失效，即感受态本身含有T质粒，无论该质粒连接的是什么片段，抗生素均不能将其杀死，导致糊成一片，从而表现出抗生素失效。
从你给出的数据，出问题的可能是第二方面的第一点，换个抗生素试试吧
你好，这是我重新做实验的结果，重新PCR扩增，胶回收，TA克隆，LB培养基（全部新买的试剂），Amp（用的还是之前买的生工的，新买的氨苄粉末由于超纯水仪器坏了，怕水质太差，没有配）。摇菌复苏1小时，涂板菌液取了50ul，没有富集。这是板子生长的结果（目的基因的，没做对照），挑去白斑检测结果全是空载体。一团一团糊一样的东西，我在网上也查找了一下，有点人说是感受态的死细胞。不知道是否正确？这种结果，是否需要将所有的试剂全换一遍？
IMG_659.jpg
刚刚我们实验室师弟师妹也出现了这种情况，涂得平板一团糊，我检查了一下，原因相当简单，复苏用的培养基污染了，长满了菌还在用，所以出现这种情况的原因很多的，建议你还是先用新的AMP试试，你所说的感受态死细胞，个人觉得可能性不大，既然是死细胞就不会生长，不会生长怎么会糊成一片呢？
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结果图，请大家帮帮忙 分析一下
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待解决问题
悬赏丁当:5
右边的 IP是免疫沉淀，左边的IB 是western blot， 那右边的TCL是什么意思?还有，最上面的LAMTOR1是指 在IP时 用的一抗是LAMTOR1吗？
不知道邀请谁？试试他们
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西瓜葡萄开心右边的 IP是免疫沉淀，左边的IB 是western blot， 那右边的TCL是什么意思? 还有，最上面的LAMTOR1是指 在IP时 用的一抗是LAMTOR1吗？有没有整个文献原文？
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TCL应该是total cell lysates。总蛋白提取物
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