染色液500ml脱色液500ml4*上样缓冲液1；100倍镜头可以看荧光、白光；200倍400倍，白镜头看荧光，黑镜看白光清楚开；拍白光：exposure选32ms左右，点aut；二七.Odessey（infraredimage；Imagestudiover2.0（IS）密us；鼠标单击蓝框选定范围后start；Image---imageadjust700鼠
染色液500ml 脱色液500ml 4*上样缓冲液100ml Ph6.8 双蒸水
甲醇 冰醋酸 双蒸水
考马斯亮蓝 甲醇 冰醋酸 双蒸水
Tris-HCl SDS 甘油 溴酚蓝 双蒸水 500ml 225ml 50ml 225ml 1g 225ml 50ml 225ml 3.028g 8g 40ml 0.008g 100ml 二六.荧光拍照：（NIS-ELEMNETS F3.0） 100倍镜头可以看荧光、白光 200倍400倍，白镜头看荧光，黑镜看白光清楚 开电源，荧光开关，左边白按钮开白光 右边eye为看镜头，L为看电脑屏 圆盘状选green，blue，白光无字 拍白光：exposure选32ms左右，点auto white 拍荧光：exposure选900ms Live扫描，auto存储 二七.Odessey（infrared imager） Image studio ver2.0（IS） 密user 鼠标单击蓝框选定范围后start Image---image adjust
700鼠源，800兔源 Dimmer/brighter（点右边700,800黑白） Done---点IS---export----single image view---current image
5*电泳液（2000ml、PH 8.3-8.8、不调PH、室温保存） 成分
Acr-Bis （H2O定溶至1000ml，滤去不溶物质,4℃保存） 成
剂量（1）C＝2.667
Acr（丙稀酰胺单体）
Bis（丙稀酰胺双体）
5*电转液（H2O定溶至640ml，用时取128ml电转液H2O定容至640ml，加甲醇到800ml） 成分
10*washing buffer（2000ml、PH7.6、调节PH、4℃保存、用时复温） 成分
SDS 2.5g 加DDH2O至25ml，浓度为10％，SDS 50℃水浴下溶解，室温保存 蔗糖 10g加DDH2O至25ml，浓度40％。 溶解后4℃保存 AP 0.5g加DDH2O至5ml，浓度10％。 溶解后4℃保存时间为1周
Tris－HCl （1.5M, PH 8.9） 称取36.3g 加DDH2O溶解定溶至200ml，滴定PH至8.9，溶解后4℃保存。 Tris－HCl （0.5M, PH 6.8） 称取1.514g 加DDH2O溶解定溶至25ml，滴定PH至6.8，溶解后4℃保存。
5*上样缓冲液（50ml、室温保存） 成分
1MTris-HCL（ph6.8）
2.5ml(最后加)
湿转： 恒流200mA， 转膜时间=KD*0.85 半干转下为石墨是正极，上为金属板是负极，湿转白为正极，黑为负极，白板放下面，其他跟半干转操作一样
PUBMED上查序列：Nucleotide---例如RAP2b Homo sapiens---人 Mus--------------鼠 包括编码和非编码序列 CDS：455-1006
终止：TAA, TAG, TGA 上游引物： 5’ 自设4个保护碱基+6个酶切位点+ATG+紧接其后的15个碱基 3’ 下游引物：
5’ 自设4个保护碱基+6个酶切位点+TGA互补碱基+反向互补的15个碱基 3’ 注意： 1. 3’端忌用a，也最好不要用t 2. 上游引物某字母太多，可--- 3. 酶切位点与455-1006之间不能有相同 4. 上游和下游酶切位点最好不一样 5. 与载体相连的话，上游的酶最好是载体的上游，下游的是载体的下游 6. 保护碱基自己选 7. 选50℃退火
举例：PCR部分目的片段的引物设计（PLC epsilon） 上游引物照抄一段，下游引物用互补反向的 如原序列上游：5’CATGGAAGGATAAGCGTTG 3’ 上游引物：
5’CATGGAAGGATAAGCGTTG 3’ 下游序列：
5’TCTTAACACGGGACTTGGG 3’ 下游引物：
5’CCCAAGTCCCGTGTTAAGA 3’ 注意： 1. Tm＜60℃，Tm=4*（G+C）+2*（A+T），上下游引物分开算 2. 3’段忌用a 3. 碱基长度20个左右 举例：PCR整个目的基因全长的引物设计： 选用pcDNA3.1作为载体，设计PLC epsilon真个编码区引物 先查询pcDNA3.1质粒图谱，查看酶切位点顺序（Nhe1，Pme1，Afl2，Hind3，Asp7181，Kpn1…EcoR1） 上游引物为：4个保护碱基+6个酶切位点+目的基因起始密码子+紧接15个碱基 下游引物为：4个保护碱基+6个酶切位点+目的基因终止密码子+反向互补15个碱基 如原序列CDS区为： ATGACTTCTGAAGAAATGAC……………..GATTACCGACAGTGACTAA 上游引物：CAGT+GCTAGC+ATG+ACTTCTGAAGAAATGAC
自设4个+Nhe1酶切位点+起始密码子+照抄15个
下游引物：GCTA+GGTACC+TTA+GTCACTGTCGGTAATC
自设4个+KPN1酶切位点+终止密码子反向互补+紧接的反向互补15个 注意：不算4个保护碱基和6个酶切位点，剩余的Tm值＞50即可
CDS区不能有Nhe1和KPN1的酶切位点
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【求助】kpn1酶切位点的设计
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这个帖子发布于11年零256天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
各位高手,大家好.我要在目的基因PCR引物5端加kpn1酶切位点,按照要求,需在识别序列两端加保护性碱基.我查到的资料如下:GG
CC 或 CGGGGTACCCCG,可这样引物本身就形成了发荚结构.不只该如何处理?另外,还想麻烦高手帮我看看我设计的引物.序列1. g tgagagaaag aggtcctcag
agagtagcag ctcacataac tgggaccaga ggaagaagca acacattgtc ttctccaaac
tccaagaatg aaaaggctct gggccgcaaa ataaactcct gggaatcatc aaggagtggg
cattcattcc tgagcaactt gcacttgagg aatggtgaac tggtcatcca tgaaaaaggg
ttttactaca tctattccca aacatacttt cgatttcagg aggaaataaa agaaaacaca
aagaacgaca aacaaatggt ccaatatatt tacaaataca caagttatcc tgaccctata
ttgttgatga aaagtgctag aaatagttgt tggtctaaag atgcagaata tggactctat
tccatctatc aagggggaat atttgagctt aaggaaaatg acagaatttt tgtttctgta
acaaatgagc acttgataga catggaccat gaagccagtt ttttcggggc ctttttagtt
ggttaa引物:ccc aag ctt
ggg (atg) gtg aga gaa aga ggt
P2:gc tct aga
t ta a cca act aaa aag(上游加HindIII酶切位点,下游加,xbal酶切位点)序列2:CAGGTCCAACTGCAAGAGAGTGGCCCAGATCTGGTGCAGCCTTCTCAGTCACTGAGCATCACCTGTACGGTGAGtGGaTTCTCCCTGACCCGCTTCGACATTCACTGGGTGAGACAGTCTCCCGGTAAGGGCCTGGAATGGTTGGGGGTGATATGGAGCAGGGGCAAcACTGACTATAAcGCAGCCTTcATcAGTGGCCTTTCTATCAGCAAGGATAACTCCAAATCACAGGTCTTTTTCCGGATGAACTCGCTCCAGACAGACGACACAGCCATCTATTACTGtGTGCGcAAGCGGGACGGATACGCTATGGATTACTGGGGaCAGGGAACCACTGTAACCGTTAGCTCCGGTGGCGGTGGCTCGGGTGGCGGTGGATCCGGCGGTGGCGGTTCGGATATAGAACTGACCCAGTCACCaGCCAGtttgGCCGTGAGCCTGGGGCAGAGGGCAACAATcTCATACAGAGCATCTAAGAGTGTGTCTACCTCGGGATACTCCTACATGCACTGGAACCAGCAGAAGCCAGGaCAACCaCCTaGaCTTTTGATCTATCTGGTGTCCAACCTGGAAAGTGGTGTTCCTGCTCGGTTCAGCGGAAGCGGATCCGGCACTGACTTcACTCTGAAcATcCATCCCGTCGAGGAGGAGGACGCTGCGACATACTATTGCCAGCACATCaGGGGaGCCTATACCTTCGGTGGaGGCACGAAGCTCGAGATCAAACGGtacccacaggac引物:上游加kpn1酶切位点,下游加,HindIII酶切位点)KDRscFv:p1:gg ggt acc
cc atg cag gtc caa ctg
P2:ccc aag ctt
ggg (tta) gtc ctg tgg gta ccg tt
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希望前辈们百忙之中予以指导.我不会使用引物设计及分析的软件,以上引物序列是本人参考文献中的引物,结合目的序列,手工设计.没办法呀,笨人只能用笨方法.还望高手们不吝赐教.谢谢!
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【求助】Xho1和Kpn1进行双酶切--连接。急
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这个帖子发布于8年零291天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
各位大侠：我现在用takara公司的Xho1和Kpn1进行双酶切pCR产物和质粒PYES2，37度酶切4小时，然后用T4酶连接16度24h，做完转化后没有任何菌斑长出（蓝白斑均无），在老板的重压之下，很发愁，望各位高手提宝贵意见
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Xho1和Kpn1公用buffer是M Buffer，从我的以往的经验来看，M buffer是最好不要冻融很多次的。连接时间不用这么长，4度连接8h足够。酶切时间可以延长一点，同时做载体的单酶切对照，再无结果可以做T载体的亚克隆。一般来说，双酶切都是比较好了连接的。可以参考一下其他帖子的分析
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Xho1酶切时间长,效率会更高的.我们试过20小时,比过夜的效果更好
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To楼上两位大侠请问双酶切20h后我在进行连接时需要多长时间，我之前用的是24h，是考虑到Xho1酶切后产生的末端需要平末端连接条件，请问这样合适吗，我的连接体系是：T4连接酶：1buffer
2.5目的基因
1总共是12.5体系
但没有菌斑啊，怎么办
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