关于IP实验步骤时是否能用GFP来拉目的蛋白

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2017-07-24 10:31 标签： IP实验步骤
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【求助】关于目的基因与GFP融合的读码框问题
欲构建目的基因与GFP的融合蛋白，请教各位高手看到各种载体，有的GFP在MCS之前，有的GFP在MCS之后，可不可以这样理解：如果载体的GFP在MCS之前，那么这个GFP已经被去掉了终止密码子，而要加入的目的基因需要去除起始密码子；相反，如果载体的GFP在MCS之后，那么这个GFP已经被去掉了起始密码子，而目的基因需要去除终止密码子。不知道是否正确?还有，目的基因插入时怎样确保目的基因与GFP的读码框正确，有什么具体的实施策略？渴望指点新手，望各位xdjm 指点在设计引物的时候,你要根据载体的图谱,目的基因的序列,考虑酶切位点等问题,在目的基因两端设计能被限制性内切酶切成粘性末端的序列,必要时还要加上保护碱基以保证不改变读码框.你要构建的是目的基因与GFP的融合蛋白？是要做标记？一般载体上的GFP并不会像GST或是HIS标签那样同目的基因融合，因为gfp只是个筛选标记/指示基因。一般来说载体上的GFP和目的基因的阅读框是独立的，它们可以共用一段启动子(条件是每个表达单位前都要有独立的ATG和核糖体结合位点，这个是一般的表达载体都有设计的），但是表达的效率可能会随启动子与目的基因ATG的距离变大而下降。因此将片段克隆入以gfp做指示基因的表达载体时，只要插入多克隆位点，而且cds完整时，是不用考虑移码的（如果连入GST标签或者His标签就要考虑，但一般商品化表达载体的mcs的位点都是有调整过的，只要你的ATG与酶切位点的第一个碱基之间的碱基数是3的倍数，就可以保证阅读框没错了）如果你要用GFP标记目的蛋白的话，我不太清楚是否有GFP融合目的基因表达的载体出售，但想来应该技术上不是问题。如果像你说的那样GFP在MCS前，那么它的终止密码子一定是切掉的，这时连入目的基因，只要注意要选取的酶切位点第一个碱基（是指回文序列的5‘端，不是断裂点！！）与你的目的基因的ATG之间没有终止密码子，之间的碱基数是3的整数倍（包括酶切位点的第一个碱基）就可以了，不会发生移码的。你也不用去掉你的ATG，cds里第一个密码子肯定是ATG，但不是说cds中间不会有ATG（一个阅读框起于ATG，但不会被ATG打断）。如果gfp连在mcs的后面，你就要注意去掉你自己目的基因的终止密码子，这样才能与GFP融合表达。另外想问一下，你有没有考虑融合表达后两段蛋白的独立活性？一般我们做蛋白的标记时，都是要求目的蛋白的一端游离（未被高级结构包裹),这时将标记连到目的蛋白的游离端，表达出来两个蛋白的独立活性才能都不受影响。请问楼上的站友: "另外想问一下，你有没有考虑融合表达后两段蛋白的独立活性？一般我们做蛋白的标记时，都是要求目的蛋白的一端游离（未被高级结构包裹),这时将标记连到目的蛋白的游离端，表达出来两个蛋白的独立活性才能都不受影响。" "蛋白的一端游离" 是怎么个游离法?多谢!这个是指n端或者c端中至少有一端位于高级结构的表面这个是指n端或者c端中至少有一端位于高级结构的表面这个是指n端或者c端中至少有一端位于高级结构的表面
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IP 实验原理
免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）原理
IP 是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合到抗体（免疫球蛋白）的FC 片段的现象开发出来的方法。目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads 上的prorein A/G就能达到吸附抗原的目的。通过低速离心，可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。
免疫沉淀实验的操作步骤比较多，同时由于在非变性条件下进行实验，所以要得到一个完美的实验结果，不仅需要高质量的抗体，同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。免疫沉淀实验从：蛋白样品处理；抗体-agarose beads孵育；抗体-agarose beads复合物洗涤到最后的鉴定，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个关键步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。
IP 实验步骤
基本实验步骤
(1）收获细胞，加入适量细胞IP 裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上或者4℃裂解30min ， 12,000g 离心30 min后取上清；
(2) 取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C 缓慢摇晃孵育过夜；
(3）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 g速度离心5 min，将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml 裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；
(4）SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。
一、 样品处理：
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GFP-Trap用于免疫沉淀（IP）
关键词：ChromoTek、GFP、RFP、免疫沉淀、IP、抗体、琼脂糖、磁珠& & 德国公司成立于年，拥有德国制造的良好质量，致力于细胞生物学和蛋白质组学的研发与研究，公司拥有强大的研发团队，有先进的生物制剂，主要使命是花费较少的时间和成本，使客户获得得高质量的实验数据。&产品包括单克隆抗体、重组单域抗体、荧光抗体、或连接蛋白等。& & 德国是一家专业研发生产标签抗体的公司，利用羊驼抗体的特异性解决了传统抗体分子量过大、转染表达效率低的问题，研发出分子量只有的高特异性抗体。公司的是来自于羊驼的偶联有单价矩阵基质（琼脂糖珠，磁珠以及多孔板基质）的单结构域的抗体片段。主要的产品有。&的产品分类&系列：板系列；，，，；；；二、系列：含；三、可用于实验的质粒或细胞系形式；四、高品质抗体（标签蛋白抗体和普通抗体）；&已被多篇同行评议的近期文献引用。&产品信息&产品分类货号产品名称规格报价（元）&GFP-Trap用于免疫沉淀（IP）&Nano-Trap：与agarose beads或者magnetic beads结合，在免疫沉淀或蛋白质相互作用的实验中，可高效抓取或纯化GFP或RPF融合蛋白。 &Nano-Trap优点：（三好三多）&抗体好：Nano-Traps采用的抗体是基于alpaca的单域抗体片段（VHHS）；具有分子量小（15Kda）、极端稳定（70℃仍保持稳定），高亲和力（高特异性性结合GFP蛋白），无普通抗体轻链与重链污染等一系列优点等优点；GFP抗体可以特异性结合绿色荧光蛋白的衍生物，如eGFP, wtGFP, GFP S65T，TagGFP，不与RFP衍生蛋白结合。&形式好：抗体结合了agarose beads（琼脂糖珠子）或者magnetic beads（磁珠），在IP实验，COIP ，pulldown，Chip实验中可以直接取代特异性GFP 抗体+proteinA/G 琼脂糖珠子；&效果好：孵化时间短（只需5-30min），能够更好结合，从细胞提取物或细胞器中定量分离GFP融合蛋白及结合因子；&实验应用多：被广泛用于免疫沉淀、质谱分析、酶活测定、生物大分子相互作用/亲和力实验、染色质免疫沉淀（ChIP）、蛋白质相互作用分析；&产品多：有GFP Trap，RFP Trap，GST Trap，Dnmt1-Trap；Mk2-Trap；P53-Trap；Mdm4/ HdmX-Trap 更多Trap 新品，给您提供更多的科研工具！GFP，RFP，GST Trap作为标签蛋白的特异性纯化方法，Dnmt1-Trap；Mk2-Trap；P53-Trap；Mdm4/ HdmX-Trap 是用于纯化目的蛋白。&样品类型多：mammalian cells（哺乳细胞）；tissues/ organisms（组织/器官样本）；bacteria（细菌）；yeast （酵母）；plants （植物样本）&&&& 操作步骤（简要，详细Protocol请见产品说明书）收集细胞& 裂解细胞&&&& 平衡beads&&&&& 结合蛋白，加入裂解的细胞&& 清洗beads&& 洗脱蛋白& 推荐产品产品名称产品货号规格报价（元）促销价（元）备注现货现货
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