应用细胞免疫荧光步骤法鉴定培养的细胞时必须加破膜剂吗

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2017-07-24 04:09 标签： 细胞免疫荧光原理
免疫荧光方法_百度文库
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免疫荧光方法
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模拟病理状态下气道上皮组织对气道平滑肌增生的影响研究
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3秒自动关闭窗口流式细胞术、免疫荧光、、免疫组化的应用及区别_公司新闻
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& 流式细胞术、免疫荧光、、免疫组化的应用及区别
流式细胞术、免疫荧光、、免疫组化的应用及区别
流式细胞术、免疫荧光、、免疫组化的应用及区别
免疫荧光、流式细胞术、免疫组化是三个大家最容易弄混的概念，下面干细胞搜网实验室人员讲解下免疫荧光、流式细胞术、免疫组化的应用及区别：
免疫组化（IHC）是应用免疫学基本原理&&抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性 结合的原理，通过化学反应使标记抗的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研 究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术.
免疫组化具有操作简单，特异性强，敏感性高，定位准确，形态与功能相结合等特点。
免疫组化常见问题分析：
1.显色过深：一抗浓度过高或孵育时间过长，建议降低一抗浓度或建少孵育时间；孵育温度过高，建议室温4度；HRP标记二抗孵育时间过长，建议减少时间
2.非特异性显色：石蜡切片脱腊不彻底，建议延长脱腊时间。
操作过程中冲洗不冲充分，建议增加冲洗的次数与冲洗的时间。
发生抗原异味。
蛋白封闭不充分，建议增加蛋白封闭时间。
3.显色强度弱：一抗浓度过低或孵育时间过短；操作过程中冲洗过度，建议适度冲洗。
&& 免疫荧光又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位
& 该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。
免疫荧光原理及特点
免疫荧光（IF）就是利用抗原与抗体的特异性结合原理及特殊的荧光素标记技术，通过激光激发使荧光素发出荧光，在荧光显微镜下观察荧光的变化从而对细胞内的抗原进行分析的技术。用免疫荧光显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）技术。
免疫荧光具有特异性强、敏感性高、速度快等特点。
免疫荧光常见问题分析：
1.背景过高：一抗或二抗浓度太高；封闭不完全，建议增加蛋白封闭时间；可通过调节荧光显微镜的参数降低背景；
2.信号弱无信号：无目的蛋白或表达量极少；细胞通透性差；一抗二抗浓度太低。
&& 流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统 的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。
细胞核衬染染料：
DAPI是一种能够与DNA强力结合的荧光染料它可以透过完整的细胞膜，因此以用于活细胞和固定细胞的染色。最大吸收波长为358nm，最大发射波长为461nm，其发散光的波长范围含盖了蓝色至青绿色。
Hoechst 33342 是一种DNA结合型荧光染料,可以嵌合到碱基分子中,在紫外激发光作用下发出兰色荧光.能够透过完整的细胞膜，可用于活细胞染色。
碘化丙啶(PI)是一种溴化乙啶的类似物，它在嵌入双链DNA后释放红色荧光。尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535nm和 615nm。
细胞浆衬染染料：
鬼笔环肽（phalloidin ）由鬼笔鹅膏真菌（Amanita phalloides）产生的一种环肽。可与F肌动蛋白结合，使F肌动蛋白保持稳定。其荧光标记物是鉴定F肌动蛋白的重要试剂。
荧光抗体的选择：
绿色荧光素：FITC，Alex488，Dylight488等。
红色荧光素：PE，Alex546等。
流式细胞术定义及原理
流式细胞仪（FC）（FLOW CYTOMETOR）：
& 进行流式细胞分析的仪器，是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，抗体技术为一体的高科技细胞分析仪。
流式细胞术（FLOW CYTOMETRY）:
& 利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速（每秒可达个）的定量分析和分选（纯度可达99%以上）的技术。
流式特点：1.测量速度快；2.可进行多参数测量；3.是一门综合性的高科技方法（ FCM综合了光学，电子学，流体力学，细胞化学，免疫学，激光和计算机等多门学科和技术）；4.既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
流式细胞术实验过程
细胞悬浮液制备（浓度为1～5&106个/ml）=〉细胞固定（合适的固定液，如4%甲醛溶液等）=〉细胞膜穿透（ 冰冷的甲醇等）=〉封闭（3%BSA-PBS等）〉一抗孵育=〉荧光二抗孵育=〉流式细胞仪分析
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培养料进入细胞的方式中运送前后物质结构发生变化的是?
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这是生物问题吧...养料 要经过很多地方的但是不觉得有什么地方发生了变化...顶多是营养物质进行循环利用到线粒体啊.核糖体啊.高尔基体啊..
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