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摘要 : 文中汇总了限制性内切酶产品及其使用中常见的一些问题，并对这些问题进行解答。
1)购买的带有两种不同的酶切缓冲液，该用哪一种?
每种限制性内切带有一管酶的最适反应液(通常是一种4-CORE反应液)，可能还带有一只MULTI-CORE反应液。
2)4-CORE酶切体系是什么?
大多数(大约75%)Promega公司的限制性内切酶有一种最适酶切缓冲液，即4-CORE酶切缓冲液，分别叫作A、B、C和D。其余的25%的限制性内切酶带有一种特定的酶切缓冲液(酶切缓冲液E-L)。每一种限制性内切酶带有一只最适酶切缓冲液。
3)MULTI--CORE酶切缓冲液体系是什么?
MULTI--CORE酶切缓冲液适用于双酶切。每一种Promega公司的限制性内切酶都测试了在MULTI--CORE酶切缓冲液中的活力，如果酶切活力达25%，就提供一只MULTI--CORE酶切缓冲液。作双酶切时，如果两个酶在MULTI--CORE酶切缓冲液中的活力达到50-100%，就可替代A-L酶切缓冲液。应选用酶活力最高的酶切缓冲液。
4)如何保存限制性内切酶?
不太常用的限制性内切酶多保存在-70oC,每周或每天用的酶保存在-20 oC。有一些酶需要不同的保存条件。每一种Promega公司的限制性内切酶都提供一份说明以供查讯。使用限制性内切酶时，应将酶保存在冰上。
5)一般的限制性内切酶反应中(也叫消化)，应用多少内切酶?
所用的酶量取决于DNA的纯度、量和型态。限制性内切酶的活力单位定义为在适当的温度下，在1小时内，1ugDNA在50ul体积中，被完全消化所需的限制性内切酶的量。一般说来，线性DNA比超螺旋DNA更易消化。比如，酶切1uglambdaDNA，需要1-2单位的酶，而酶切1ug，需要3-5单位的酶。
6)使用限制性内切酶的一般步骤是什么?
一般步骤如下：
A)测试酶切的量
B)计算完全酶切所需的酶量。为使终体积中甘油的浓度低于8%，计算能加的酶量，最多能加终体积的10%(甘油的浓度为5%)。
C)10X反应液的体积应为终体积的1/10;10X反应液的体积不应小于酶的体积。
D)加入计算好的DNA，10X反应液，酶。
加入水到终体积(20-50 ul)，轻轻混匀，在适当的温度下保温。一般酶的最适温度为37 oC，但有例外。应查讯分析说明。
DNA (2ug/ ul) 5 ul
10X反应液 5 ul
酶(5ug/ ul) 5 ul
dH2O 35 ul
37 oC保温2-3小时。
应最后加酶。
7)一次使用两个限制性内切酶的一般步骤是什么(比如双酶切)?
一次使用两个限制性内切酶的一般步骤，如同使用一个限制性内切酶的一般步骤。但要注意两个限制性内切酶在同一种缓冲液中都要有活力。甘油的浓度不应超过终体积的8%。应注意有些酶对末端敏感，活力差。
8)能否在一次反应中用很多的限制性内切酶?
可以，一般而言，甘油浓度超过8%对酶切有抑制。有些酶在高的甘油浓度中会产生星活力。限制性内切酶提供在50%的甘油中，故10 ul反应体积中不应加入超过1.6 ul的酶。
9)消化反应中是否需要加牛血清白蛋白(BSA)?
不需要。酶切不需要加BSA。但Promega公司的限制性内切酶活力测定时，均加入乙酰化的BSA达0.1mg/ml。BSA可以提高许多限制性内切酶活力。Promega公司的限制性内切酶均提供一管乙酰化的BSA(R396D，E，F)，并建议酶切时加入BSA达0.1mg/ml。
10)星活力是什么?
星活力是指在保温条件改变，如NaCl过多存在于反应液中，使酶切的核酸序列不同于它特定的识别序列。
11)什么是同切酶?
同切酶指两个酶的识别位点和酶切位点相同，如SphI(CGTAC'G)和BbuI(CGTAC'G)互为同切酶。
12)什么是neoschizomer?
Neoschizomer指两个酶的识别序列相同，但酶切位点不同，如SmaI(GGG'CCC)和XmaI(G'GGCCC)互为neoschizomer。
13)基因组规格指的是什么?
基因组规格的酶适用于酶切包裹在琼脂中的基因组DNA。另外，染色体DNA的制备、酶切和凝胶分离的条件对基因组规格的酶作了优化。
14)如果一个限制性内切酶不是基因组规格，是否表明它不能用于处理染色体DNA?
不一定。如果一个限制性内切酶不是基因组规格,Promega公司没有测试它能否处理包裹的基因组DNA。因此需作一些测试来决定酶是否会切割底物。
15)需要用多少单位的限制性内切酶对琼脂包裹的染色体DNA进行酶切?
切割包裹的DNA比普通底物需要更多的酶，一般需要多2倍。
16)什么是蓝/白克隆测试?
蓝/白克隆测试是一种确定酶切样品中，存在的少量外切核酸酶活力的质量检查过程。通过测定一个功能基因(Beta-半乳糖苷酶)酶切和重新连接后，蓝/白斑的比例，来确定外切核酸酶活力。如果存在少量外切核酸酶活力，或不存在外切核酸酶活力，得到的是蓝色菌落。产生粘性末端的酶实验产生的白色菌落应小于2%，而产生平头末端的酶实验产生的白色菌落应小于5%。这个方法的灵敏度很高，可以检测出缺失一个碱基的酶切末端。
17)限制性内切酶是如何命名的?
限制性内切酶命名的次序如下：
A) 用3个字母代表来源的生物(如Bam代表 Bacillus amyloliquefaciens)
B) 1个字母或阿拉伯数字代表菌株(BamH)
C) 1个罗马字母代表发现或鉴定的次序(BamHI)
18)如何稀释限制性内切酶?
如果1小时内会使用限制性内切酶，可用补充有0.5mg/ml BSA的1X反应液稀释，如果在更长的时间内才会使用限制性内切酶，用酶贮存液稀释。
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SectionA细胞与大分子简述复杂大分子的生物学功能及与人类健康的关系。SectionC核酸的性质1.DNA的超螺旋结构的特点有哪些？A发生在闭环双链DNA分子上BDNA双链轴线高卷曲，与简单的环状相比，连接数发生变化C当DNA扭曲方向与双螺旋方向相同时，DNA变得紧绷，为正超螺旋，反之变得松弛为负超螺旋。自然界几乎所有DNA分子超螺旋都为负的，因为能量最低。2.简述核酸的性质。A核酸的稳定性：由于核酸中碱基对的疏水效应以及电荷偶极作用而趋于稳定B酸效应：在强酸和高温条件下，核酸完全水解，而在稀酸条件下，DNA的核苷键被选择性地断裂生成脱嘌呤核酸C碱效应：当PH超出生理范围时（7-8），碱基的互变异构态发生变化D化学变性：一些化学物质如尿素，甲酰胺能破坏DNA和RNA二级结构中的而使核酸变性。E粘性：DNA的粘性是由其形态决定的，DNA分子细长，称为高轴比，可被机械力和超声波剪切而粘性下降。F浮力密度：1.7g/cm^3,因此可利用高浓度分子质量的盐溶液进行纯化和分析G紫外线吸收：核酸中的芳香族碱基在269nm处有最大光吸收H减色性，热变性，复性。思考题：提取细菌的质粒依据是核酸的哪些性质？质粒是抗性基因，，在基因组或者质粒DNA中用碱提取法。SectioC课前提问1.在1.5mL的离心管中有500μL，取出10μL稀释至1000μL后进行检测，测得A260=0.15。问（1）：试管中的DNA浓度是多少？问（2）：如果测得A280=0.078,.A260/A280=？说明什么问题？稀释前的浓度：0.15/20=0.0075稀释后的浓度：0..75ug/ml（2）0.15/0.078=1.92〉1.8，说明DNA中混有RNA样品。2.解释以下两幅图（native:非变性的；denatured:变性的）图一表示dsDNA和RNA的热变性，中间的Tm值表示解链温度。随着温度的升高,DNA和RNA逐渐变性形成单链，因此光吸收率逐渐增大，然而随着温度的升高RNA中双链部分的碱基堆积逐渐减少，其光吸收率不规则地增大。较短的碱基配对区域具有更高的热力学活性，比较长的区域变性快。图二表示的是快速慢速降温下的DNA复性，在温度缓慢下降时，DNA可以经碱基配对逐渐形成双链，但在快速降温时，DNA只形成局部区域的dsDNA，经碱基配对或者在DNA内部或者DNA之间短的互补区域的退火而形成，因此A260的下降很小。SectioE提问大肠杆菌的DNA聚合酶主要有哪几种？它们有哪些特点？DNA聚合酶I：切除引物，修复DNA聚合酶II：修复DNA聚合酶III：复制SectionEDNA复制细胞周期(Thecellcycle)（1）什么是细胞周期？细胞周期包括DNA复制后的细胞分裂，即从一个母细胞产生两个子细胞。（2）细胞分裂是有序的还是无序的？为什么？细胞周期是一个有序的过程，受细胞周期机制的控制。2.检验点及其调控(Checkpointsandtheirregulation)（1）细胞如何从G0进入G1？G0期是指非增殖的休眠状态，称为沉默期。G1期有一限制点（R点）细胞会对环境进行评估，然后决定是否进入另一个分裂周期。细胞在到达R点之前具有胞外生长分子-促细胞分裂原即可使细胞从G0进入G1期。（2）限制点（R点）G1期，细胞会对环境进行评估，然后决定是否进入另一个分裂周期，G1期的这一点称为限制点。SectionFDNA损伤、修复与重组思考题（1）5’-GTATCTTCTGATGGCTCGTGTACAAACACG-3’3’-CATAGAAGACTACCGAGCACATGXXXGTGC-5’根据Holliday模型在什么时候可以被修复？该损伤的DNA链“XXX”部分本为“TTT”，修复时与另一个正常的DNA分子同源重组，“XXX”段将通过重组被正常的姐妹链上相应区域的“TTT”替代修复，而正常链上因此产生的缺口会被个填平。因为它的对面没有损伤，可通过正常的切除去掉，这样子就修复了。（2）设计实验以区别细菌遗传转化转移中的转化、转导和结合的过程。下面列出可使用的工具：（1）合适的突变菌株及其培养基。（2）DNA酶。（3）两种滤板，一种滤板能让游离的DNA通过，不可让细菌和病毒通过；另一种滤板只能持留细菌。（4）一种是插入滤板使其分隔成两个空间的玻璃容器（如U型管）。请写出实验设计并预期3种遗传转移过程的结果。SectionKω亚基：ω亚基的功能尚不清楚,也有人认为ω亚基对于RNA聚合酶的结构和功能没有太大的影响。问题：什么是启动子？上游？下游？转录起点？启动子：RNA聚合酶结合到待转录序列上游的特定起始位点，长约40bp转录起始点：CGT/CAT,G比A更常见，被称为+1位点。（2）原核生物δ70启动子有哪些特点？大肠杆菌最常见的δ因
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